馬尾松松針提取物對(duì)根面牙本質(zhì)脫礦影響的體外研究

唐成芳阮建平朱勇李子夏左艷萍徐紅艷

1.西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系，西安 710021；2.西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院預(yù)防科，西安 710004；3.陜西省人民醫(yī)院口腔科，西安 710076

馬尾松松針提取物對(duì)根面牙本質(zhì)脫礦影響的體外研究

唐成芳1阮建平2朱勇1李子夏1左艷萍1徐紅艷3

1.西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系，西安 710021；2.西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院預(yù)防科，西安 710004；3.陜西省人民醫(yī)院口腔科，西安 710076

目的 評(píng)價(jià)馬尾松松針提取物（PMNE）抑制根面牙本質(zhì)脫礦的效果。方法 將根面牙本質(zhì)塊根據(jù)pH循環(huán)中所用實(shí)驗(yàn)溶液隨機(jī)分為去離子蒸餾水（DDW）組，氟化鈉（NaF）組，4%、8%和12%PMNE組，試件進(jìn)行為期8 d的pH循環(huán)。顯微CT選區(qū)測(cè)定各組未脫礦牙本質(zhì)和脫礦牙本質(zhì)的牙本質(zhì)礦物密度（DMD）及兩者DMD差值（ΔDMD），掃描電鏡下觀察pH循環(huán)后牙本質(zhì)表面形貌。結(jié)果 PMNE各組和NaF組ΔDMD均顯著低于DDW組（P<0.05），且8% PMNE組和12%PMNE組ΔDMD組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），均顯著低于4%PMNE組，高于NaF組（P<0.05）。掃描電鏡見PMNE組牙本質(zhì)小管不全暴露，小管開口程度明顯小于DDW組，大于NaF組。結(jié)論 PMNE可抑制根面牙本質(zhì)脫礦，減緩酸對(duì)DMD的降低，具有一定的抗齲活性。8%PMNE即可達(dá)到較好抑制脫礦的效果。

馬尾松松針提取物； 根面齲； 牙本質(zhì)； 脫礦； 礦物密度

根面齲是發(fā)生在牙頸部涉及牙骨質(zhì)、牙本質(zhì)的特殊齲壞。老年人因牙齦退縮以及牙頸部薄弱部位暴露，更易發(fā)生根面齲[1-2]。據(jù)第3次全國(guó)口腔健康流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告，全國(guó)65～74歲老年人患齲率為98.4%，根齲患病率為63.6%，根面齲是老年人牙齒缺失的主要因素之一，嚴(yán)重危害著老年人的口腔健康[1,3]。因而，采用合理、安全有效的措施防治根面齲的發(fā)生和發(fā)展是非常必要的。研究[4-5]證實(shí)齲病的發(fā)生發(fā)展是牙體組織在細(xì)菌產(chǎn)酸作用下，發(fā)生的礦物質(zhì)溶出和有機(jī)物的崩解。因而，控制菌斑，增強(qiáng)礦物牙體組織抵抗酸/耐脫礦能力，促進(jìn)脫礦組織再礦化被認(rèn)為是“應(yīng)用微創(chuàng)理念”防治老年齲進(jìn)展的重要措施[5-6]。

松針，又稱松葉松毛，是松科松屬植物的葉，性溫味苦，自古記載其具有補(bǔ)益人體、祛風(fēng)止痛、活血化淤、固齒駐顏等功效。研究證實(shí)松針提取物有抑菌/抗菌、抗衰老、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性[7-9]，也被用于牙膏的研制[10]。本實(shí)驗(yàn)采用顯微CT（micro computer tomography, Micro-CT）和場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（field emission scanning electron microscopy，F(xiàn)ESEM）分析了我國(guó)廣泛分布的馬尾松松針提取物（Pinus massoniana needle extract，PMNE）對(duì)根面牙本質(zhì)抗酸/抑制脫礦能力的影響，探索PMNE抑制根面齲的潛能。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和器械

10∶1 PMNE（西安奧賽生物技術(shù)有限公司），氟化鈉（NaF，分析純）、磷酸二氫鉀（KH2PO4，分析純）、乙酸（CH3COOH，分析純）（西安化學(xué)試劑廠），羥乙基哌嗪乙磺酸（Sigma公司，美國(guó)），抗酸指甲油（Revlon公司，美國(guó)）。

采用去離子蒸餾水（distilled deionized water，DDW）為溶劑配制如下溶液。4%、8%和12%PMNE溶液：將PMNE加入DDW中配制質(zhì)量體積百分濃度為12%的澄明溶液，DDW稀釋方式配制4%和8%的PMNE溶液，備用；用DDW溶解適量NaF配制成0.1% 的NaF溶液；中性緩沖液：20 mmol·L-1羥乙基哌嗪乙磺酸，1.5 mmol·L-1KH2PO4，pH為7.0[11]；酸性緩沖液：50 mmol·L-1CH3COOH，1.5 mmol·L-1KH2PO4，pH為5.0[11]。

慢速切割機(jī)（UNIPOL-830，沈陽(yáng)科晶有限公司），恒溫水浴箱（上海醫(yī)療器械廠），維氏顯微硬度計(jì)（HXD-1000TM，上海泰明光學(xué)儀器有限公司），F(xiàn)E-SEM（FESEM S-4800，Hitachi公司，日本），Micro-CT（Explore Locus SP，通用醫(yī)療公司，美國(guó)），電感耦合等離子質(zhì)譜儀（熱電有限公司，美國(guó)）。

1.2 樣本制備

取頸部平坦且完整無(wú)齲壞的新近拔除第三磨牙35顆，用慢速切割機(jī)在流水降溫下去除冠方牙體組織，制備3 mm×4 mm×2 mm的根面牙體組織塊。在流水降溫下用2 000目碳化硅砂紙打磨牙體表面至牙本質(zhì)層，并使牙本質(zhì)表面光滑平整。按照文獻(xiàn)[12]的方法，用顯微硬度計(jì)挑選出牙本質(zhì)表面硬度在35～50維氏硬度值之間的試件50個(gè)。在牙本質(zhì)的光滑表面一端預(yù)留3 mm×2 mm大小的開窗區(qū)，其余部位均勻涂布抗酸指甲油，干透后涂布第二層。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及pH循環(huán)

按照所用實(shí)驗(yàn)溶液不同，將50個(gè)試件隨機(jī)分為5組，分別為DDW、NaF、4%PMNE、8%PMNE和12%PMNE組，每組10個(gè)試件，其中DDW組和NaF組分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照組。

各組試件分別于37 ℃的恒溫水浴箱中進(jìn)行pH循環(huán)：2 mL4%PMNE、8%PMNE、12%PMNE溶液、DDW或0.1%NaF等實(shí)驗(yàn)溶液浸泡10 min，2 mL酸性緩沖液1 h，2 mL中性緩沖液緩沖5 min。每次浸泡后用DDW徹底沖洗1 min，濾紙吸去多余水分，其余時(shí)間各試件放入37 ℃中性緩沖液中，每天緩沖3次，共8 d。各實(shí)驗(yàn)液及中性緩沖液每日更換1次。

1.4 牙本質(zhì)礦物密度（dentin mineral density，DMD）的測(cè)定

循環(huán)結(jié)束后DDW徹底沖洗，室溫下用3%戊二醛溶液與0.1 mol·L-1PBS緩沖液（1∶1，pH=7.2）固定4 h，去除牙本質(zhì)表面涂布的指甲油，DDW徹底沖洗。將試件置于Micro-CT中在80 kV、80 μA、14 μm層厚條件下進(jìn)行掃描，三維重建。測(cè)定每個(gè)標(biāo)本未脫礦側(cè)約0.996 0 mm×0.996 0 mm大小面積（圖1A中黃色區(qū)域），且自牙本質(zhì)表面向內(nèi)深0.220 4 mm的長(zhǎng)方體形區(qū)域內(nèi)（即0.996 0 mm×0.996 0 mm×0.220 4 mm選區(qū)，圖1B中黃色所示區(qū)域）的DMD，作為該樣本未脫礦牙本質(zhì)的礦物密度（normal dentin mineral density，NDMD），每個(gè)標(biāo)本測(cè)定4個(gè)區(qū)域，計(jì)算平均值。具體測(cè)定方法見圖1。

按照未脫礦側(cè)DMD同樣測(cè)定的方法，將未脫礦側(cè)分析選區(qū)框水平平移至同一牙本質(zhì)塊脫礦側(cè)的對(duì)稱位置，測(cè)定同樣大小選區(qū)內(nèi)的DMD，即作為pH循環(huán)后脫礦牙本質(zhì)的礦物密度（demineralized dentin mineral density，DDMD），每個(gè)標(biāo)本測(cè)定4個(gè)區(qū)域，求平均值。按照如下公式計(jì)算牙本質(zhì)塊NDMD與DDMD的差值（ΔDMD），ΔDMD=NDMD-DDMD。

1.5 表面微觀形貌觀察

試件經(jīng)Micro-CT掃描完成后即刻用DDW沖洗，自然干燥，噴金，F(xiàn)E-SEM電鏡觀察各組脫礦側(cè)牙本質(zhì)表面微觀形貌。

圖 1 牙本質(zhì)密度測(cè)定選區(qū)圖Fig 1 Selected area analysis in determination of dentin density

1.6 PMNE中鈣、鉬和氟含量測(cè)定

取4%PMNE溶液稀釋100倍，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，測(cè)PMNE中鈣、鉬和氟元素的含量，共測(cè)定5個(gè)樣。每個(gè)樣品測(cè)定3次，求平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)NDMD、DDMD及ΔDMD進(jìn)行單因素方差分析，采用組間LSD兩兩比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 DMD測(cè)量結(jié)果

各組NDMD、DDMD和ΔDMD測(cè)量結(jié)果見表1。

表 1 各組NDMD、DDMD和ΔDMD的比較Tab 1 The comparison of NDMD， DDMD and ΔDMD in each groups mg·cm-3， n=10

表 1 各組NDMD、DDMD和ΔDMD的比較Tab 1 The comparison of NDMD， DDMD and ΔDMD in each groups mg·cm-3， n=10

注：不同小寫字母代表NDMD、DDMD和ΔDMD等指標(biāo)組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

由表1可見，各組NDMD間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。DDW組DDMD最低，NaF組DDMD最高，兩組間DDMD差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；4%PMNE組DDMD明顯高于DDW組，顯著低于8%、12%PMNE組和NaF組（P<0.05）；8%PMNE組和12%PMNE組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），均略低于NaF組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。DDW組ΔDMD最高，NaF組△DMD最低，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；PMNE各組ΔDMD顯著高于NaF組，顯著低于DDW（P<0.05）；8%PMNE 組ΔDMD略低于12%PMNE組，但兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），兩者均顯著低于4%PMNE組（P<0.05）。

2.2 表面微觀形貌觀察結(jié)果

各組pH循環(huán)后脫礦牙本質(zhì)表面微觀形貌見圖2。由圖2可見，DDW組牙本質(zhì)表面牙本質(zhì)小管完全暴露，小管開口呈圓形或類圓形，牙本質(zhì)表面欠平整，未見明顯膠原纖維，牙本質(zhì)小管壁較疏松，可見膠原纖維。NaF組牙本質(zhì)表面的玷污層完整，未見牙本質(zhì)小管暴露，表面僅見3～5 μm長(zhǎng)度的狹小微裂隙。低倍鏡下各濃度PMNE組牙本質(zhì)表面的玷污層完整性受到不同程度破壞，牙本質(zhì)小管口部分堵塞，呈不同程度的點(diǎn)隙狀開口；4%PMNE組牙本質(zhì)表面點(diǎn)隙最大，分布最密集。高倍鏡下見4%PMNE組牙本質(zhì)表面牙本質(zhì)小管口暴露不全，裂隙呈3～5 μm線狀和多角形不規(guī)則開口，但牙本質(zhì)小管開口程度較DDW組明顯減?。?%和12%PMNE組牙本質(zhì)表面的部分牙本質(zhì)小管被堵塞，部分牙本質(zhì)小管口不全暴露，呈3～5 μm長(zhǎng)的梭形/小的不規(guī)則形開口，兩組牙本質(zhì)表面的點(diǎn)隙狀開口基本相當(dāng)，點(diǎn)隙大小和密集程度明顯小于4%PMNE組。

2.3 PMNE中鈣、鉬和氟含量

本樣品中鈣元素含量為（12.46±0.23） μg·mg-1，鉬元素含量為（3.31±0.12） μg·mg-1。本樣品不含氟元素。

圖 2 各組牙本質(zhì)表面微觀形貌 FE-SEMFig 2 Micro morphology of dentin surface in every group FE-SEM

3 討論

口腔中的致病菌可利用食物產(chǎn)酸致使釉質(zhì)、牙本質(zhì)等牙體硬組織發(fā)生脫礦，繼而脫礦裸露的膠原纖維等有機(jī)基質(zhì)在酶和唾液環(huán)境中降解，導(dǎo)致齲病發(fā)生發(fā)展[4-5]。本實(shí)驗(yàn)在pH循環(huán)模式下，以NaF作為對(duì)照觀察富含黃酮類化合物的PMNE抑制根面牙本質(zhì)脫礦的作用，并分析PMNE濃度效應(yīng)，為預(yù)防根面齲的發(fā)生及抑制其進(jìn)展提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此外，為避免緩沖液對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，本實(shí)驗(yàn)pH循環(huán)所用的酸性和中性緩沖液均不含鈣離子。

Micro-CT是采用X線成像原理進(jìn)行超高分辨率三維成像的設(shè)備，可在不破壞樣本的情況下，定量計(jì)算樣品內(nèi)部任意選定區(qū)域的體積、面積、孔隙率、礦物密度等[13]。礦物密度是根據(jù)體模和標(biāo)準(zhǔn)CT值計(jì)算得到并以單位體積的羥磷灰石含量來(lái)表示的礦物質(zhì)含量，可反映單位組織內(nèi)礦物質(zhì)的含量[14]。牙本質(zhì)等牙體組織是以無(wú)機(jī)物為主的硬組織，具有X線阻射，因而Micro-CT也被用于測(cè)定牙體組織的礦物含量和齲病動(dòng)態(tài)過(guò)程及療效觀察[15]。本研究采用Micro-CT定量對(duì)比分析各組根面牙本質(zhì)脫礦區(qū)、正常未脫礦等大選區(qū)內(nèi)礦物密度值和兩者礦物密度差，以評(píng)價(jià)PMNE抑制酸所致牙本質(zhì)脫礦的效果。結(jié)果表明，NaF和PMNE均可有效抑制根面牙本質(zhì)脫礦的進(jìn)展。

由于能夠促進(jìn)牙體組織礦化和減弱酸對(duì)牙體組織的脫礦，故氟化物干預(yù)是當(dāng)前減輕齲病進(jìn)展的有效措施。本實(shí)驗(yàn)Micro-CT也證實(shí)NaF組牙本質(zhì)脫礦區(qū)與未脫礦區(qū)的ΔDMD顯著低于DDW組，提示0.1% NaF能有效地減弱酸對(duì)根面牙本質(zhì)的脫礦作用。FESEM見NaF組牙本質(zhì)表面玷污層完整而DDW組玷污層完全破壞，進(jìn)一步證實(shí)了氟化物提高牙本質(zhì)耐脫礦或抑制脫礦的能力。研究[12]表明，氟化物在牙本質(zhì)/釉質(zhì)表面可與鈣離子或羥磷灰石結(jié)合形成氟化鈣或氟磷灰石，增強(qiáng)根面牙本質(zhì)抗酸蝕脫礦能力，促進(jìn)再礦化。

本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)PMNE可抑制酸所致牙本質(zhì)脫礦，其機(jī)制推測(cè)主要可能與PMNE保存脫礦牙本質(zhì)有機(jī)基質(zhì)有關(guān)。牙本質(zhì)是含有約30%有機(jī)基質(zhì)的鈣化硬組織，已有研究[16]表明保留脫礦牙本質(zhì)內(nèi)的有機(jī)基質(zhì)可為再礦化提供支架，并形成一個(gè)機(jī)械屏障從而阻止酸的擴(kuò)散和礦物離子釋出。PMNE是從馬尾松葉中提取的天然物質(zhì)，其主要分子結(jié)構(gòu)具有多個(gè)酚羥基的原花青素、黃酮類等生物活性成分[8-9]。原花青素、五倍子等含多酚結(jié)構(gòu)的物質(zhì)可通過(guò)共價(jià)鍵、離子鍵、氫鍵等與蛋白質(zhì)反應(yīng)，增加交聯(lián)度，增強(qiáng)膠原基質(zhì)，使非膠原蛋白凝固，抑制金屬基質(zhì)蛋白酶活性，減輕脫礦牙本質(zhì)的降解[8,11-12,16]。據(jù)此推測(cè)，PMNE抑制根面牙本質(zhì)脫礦的可能機(jī)制是PMNE通過(guò)原花青素、黃酮類等有效成分的多酚結(jié)構(gòu)與膠原基質(zhì)的相互作用，增強(qiáng)了膠原基質(zhì)的交聯(lián)，抑制其降解，從而保存了脫礦牙本質(zhì)有機(jī)基質(zhì)并形成屏障。該屏障可一定程度阻礙pH循環(huán)過(guò)程中的H+擴(kuò)散從而減輕脫礦。另外，由于原花青素的交聯(lián)作用以及其B環(huán)上酚羥基的螯合作用[8,12]，交聯(lián)于脫礦牙本質(zhì)膠原基質(zhì)的原花青素還可以通過(guò)B環(huán)上酚羥基螯合因脫礦釋出的部分鈣離子，從而阻礙鈣離子釋出。因而，雖經(jīng)pH循環(huán)，PMNE組牙本質(zhì)玷污層未完全被酸去除，表現(xiàn)為牙本質(zhì)小管仍部分堵塞，而陰性對(duì)照DDW組玷污層完全被去掉，牙本質(zhì)小管完全暴露，且PMNE組ΔDMD顯著低于DDW組。

此外，PMNE抑制根面組織脫礦的作用可能還與PMNE中含有的鈣元素和鉬元素相關(guān)。松針提取物中還含有鈣、磷、鉬等多種元素。本研究采用質(zhì)譜儀也證實(shí)本實(shí)驗(yàn)所用PMNE中含有（3.31±0.12） μg·mg-1鉬元素，（12.46±0.23） μg·mg-1鈣元素。據(jù)此推測(cè)，一方面PMNE溶液中所含鈣可沉積在脫礦牙本質(zhì)表面，能促進(jìn)表面的殘余羥磷灰晶體生長(zhǎng)；另一方面PMNE處理后，其內(nèi)鉬元素沉積于脫礦牙體表面，還可能增加牙本質(zhì)抵抗pH循環(huán)中酸的侵蝕。據(jù)報(bào)道，增加攝入鉬元素可增強(qiáng)牙齒的硬度和牢固度，預(yù)防齲齒，還可提高氟再礦化表層下釉質(zhì)的功效。然而鉬元素是如何發(fā)揮作用的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)中8%PMNE組和12%PMNE組抑制牙本質(zhì)脫礦效果優(yōu)于4%PMNE。結(jié)果提示，8%PMNE即可達(dá)到良好的抑制牙本質(zhì)脫礦的效果。結(jié)果可能與單位體積高濃度PMNE溶液中多酚含量、鉬元素等有效成分相對(duì)較多有關(guān)，到8%濃度時(shí)PMNE即含有能與脫礦牙本質(zhì)反應(yīng)的最適量有效成分。然而，PMNE是混合物，其有效成分除原花青素和鉬元素外，是否還有其他抑制牙本質(zhì)脫礦的成分還有待進(jìn)一步研究。

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（本文編輯 杜冰）

Effect of Pinus massoniana needle extract on root dentin demineralization in vitro

Tang Chengfang1, Ruan Jianping2, Zhu Yong1, Li Zixia1, Zuo Yanping1, Xu Hongyan3.
(1. Dept. of Stomatology, Xi’an Medical University, Xi’an 710021, China; 2. Dept. of Preventive, School of Stomatology, Xi’an Jiao Tong University, Xi’an 710004, China; 3. Dept. of Stomatology, Shanxi Provincal People’s Hospital, Xi’an 710076, China)

Supported by: Tackling Project of Scientific and Technological Social Development from Science and Technology Department of Shanxi Province(2015SF242); Scientific Research Project from Education Department of Shanxi Province (15JK1625); Doctor Start Fund Project from Xi’an Medical University (2015DOC20); Key Discipline from Xi’an Medical University. Correspondence: Tang Chengfang, E-mail: tangchengfang@sohu.com.

Objective This study aims to evaluate the effects of Pinus massoniana needle extract (PMNE) on inhibiting demineralization of root dentin. Methods Root dentin blocks were randomly divided into distilled deionized water (DDW) group, fluoride sodium (NaF) group, and 4%, 8% and 12% PMNE groups according to the experimental solution used in the process of pH cycling in each group. All specimens in each group experienced pH cycling for 8 d. The dentin mineral density （DMD） of the normal dentin and demineralized dentin and their D-value （ΔDMD） were determined using micro computed tomography. The morphology of dentin surface after pH cycling was also observed using a scanning electron microscope. Results The ΔDMD values in all PMNE groups and the NaF group were considerably lower than the ΔDMD in the DDW group (P＜0.05）. The ΔDMD values of the 8% and 12% PMNE groups had no difference （P>0.05), both of which were lower than the ΔDMD in the 4% PMNE group and higher than that in the NaF group （P<0.05). The dentin tubules were partly opened in the PMNE groups. The opening degrees of the dentin tubule in PMNE groups were significantly less and smaller than the opening degree in the DDW group and were larger than that in the NaF group. Conclusion PMNE can inhibit the demineralization of root dentin and can slow down the reduction in DMD. PMNE has the potential to prevent caries, and 8% PMNE can effectively inhibit dentin demineralization.

Pinus massoniana needle extract; root caries; dentin; demineralization; mineral density

R 781.1

A [doi] 10.7518/hxkq.2016.05.018

2016-03-15；

2016-06-22

陜西省科技廳社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目（2015SF242）；陜西省教育廳科研課題（15JK1625）；西安醫(yī)學(xué)院博士啟動(dòng)基金（2015DOC-20）；西安醫(yī)學(xué)院重點(diǎn)學(xué)科資助

唐成芳，副教授，博士，E-mail：tangchengfang@sohu.com

唐成芳，副教授，博士，E-mail：tangchengfang@sohu.com