丹酚酸B 對人牙周膜細胞成骨分化的影響

馬玥任嬡姝付鋼

1.重慶醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院正畸科；2.口腔疾病與生物醫(yī)學重慶市重點實驗室；3.重慶市高校市級口腔生物醫(yī)學工程重點實驗室，重慶 401147

丹酚酸B 對人牙周膜細胞成骨分化的影響

馬玥1,2任嬡姝1,2付鋼3

1.重慶醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院正畸科；2.口腔疾病與生物醫(yī)學重慶市重點實驗室；3.重慶市高校市級口腔生物醫(yī)學工程重點實驗室，重慶 401147

目的 探討中藥丹參主要活性成分丹酚酸B（Sal B）對人牙周膜細胞（hPDLCs）成骨分化的影響。方法 取第3代hPDLCs進行實驗，運用甲基噻唑基四唑（MTT）法檢測不同濃度丹酚酸B對hPDLCs增殖活性影響，通過檢測堿性磷酸酶（ALP）活性、礦化結節(jié)染色、骨鈣素（OCN）mRNA表達來探討丹酚酸B對hPDLCs成骨分化的影響。結果 丹酚酸B對hPDLCs增殖活性無影響。當?shù)し铀酈濃度為0.5、1、5 μmol·L-1時均能增加hPDLCs的ALP活性和OCN mRNA表達，與OIM組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；且當?shù)し铀酈濃度為0.5、1、5 μmol·L-1時hPDLCs形成礦化結節(jié)數(shù)量明顯高于OIM組。結論 適宜濃度的丹酚酸B能有效促進hPDLCs成骨分化。

丹酚酸B； 人牙周膜細胞； 成骨分化； 堿性磷酸酶活性； 礦化結節(jié)

牙周炎是成年人口腔中失牙最主要的原因，其標志性的特征是發(fā)生牙槽骨的病理性吸收。牙周組織的修復與再生一直都是牙周炎治療的重要研究課題之一。人牙周膜細胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）是包括了大量成纖維細胞、少量干細胞、成牙骨質細胞和成骨細胞的特異細胞群[1]，其具有干性和成骨分化的潛能，是牙周組織再生的主要細胞來源。丹酚酸B（salvianolic acid B，Sal B）是我國中藥丹參的水溶性提取物之一，也是水溶性提取物中活性最強的成分之一，占水溶性藥用成分總含量的70%。研究[2-3]表明丹酚酸B主要具有促增殖、抗氧化和細胞保護等作用，廣泛用于心血管疾病[4-5]，且對神經(jīng)細胞具有保護作用[6-7]，還能防止肝纖維化。近年來研究[8]發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B能防治糖皮質激素引起的大鼠骨質疏松，進一步研究[9]表明其能促進間充質干細胞成骨分化。而丹酚酸B對hPDLCs的成骨影響尚未見報道，本實驗旨在通過研究丹酚酸B對hPDLCs成骨的影響為牙周組織再生中的牙槽骨重建提供新的思考。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

丹酚酸B（重慶博培生物公司），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），青霉素/鏈霉素（Hyclone公司，美國），茜素紅S、抗壞血酸、β-磷酸甘油磷酸鈉、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色試劑盒、地塞米松（Sigma公司，美國），ALP定量檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），BCA蛋白濃度測定試劑盒（吳江近岸蛋白質科技有限公司），real-time聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒、引物合成（Takara公司，日本），波形蛋白抗體、角蛋白抗體、通用型免疫組化檢測試劑盒、DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。倒置顯微鏡（尼康公司，日本），熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司，美國），酶標儀（PerkinElmer公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 hPDLCs的取材和培養(yǎng) 取10～12歲因正畸需要而拔除的健康前磨牙進行hPDLCs培養(yǎng)。所有患者知情同意，實驗操作嚴格遵守重慶醫(yī)科大學醫(yī)學研究倫理委員會的要求。拔牙后將離體牙立即置于含青霉素、鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液中。無菌條件下反復沖洗后，刮取牙根中1/3的牙周膜組織，用剪刀剪碎后平鋪于25 mL培養(yǎng)瓶底，加入含血清的DMEM/ F12培養(yǎng)液（含100 μg·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素、10%FBS），翻轉培養(yǎng)瓶放入CO2孵箱（37 ℃、5%CO2、100%濕度）。12 h后待組織塊貼壁，將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉后繼續(xù)培養(yǎng)。此后每間隔3 d換液1次，待細胞長至培養(yǎng)瓶底約80%時，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2傳代培養(yǎng)。取第3代細胞進行實驗。

1.2.2 hPDLCs的鑒定 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)和生長情況。選取第3代細胞按二步法進行波形蛋白和角蛋白的免疫細胞化學染色，鑒定細胞來源。

1.2.3 細胞毒性實驗 將第3代hPDLCs以密度為每孔4×103個接種于96孔板中，細胞貼壁后，分別加入含0、0.1、0.5、1、5 μmol·L-1丹酚酸B的含藥培養(yǎng)基[8-9]，在藥物作用1、3、5、7 d后，采用甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法，每孔加入20 μL MTT溶液（0.5 mg·mL-1）孵育4 h后，吸去孔內液體，加入150 μL DMSO振蕩10 min后，490 nm波長測各孔光密度（optical density，OD）值。

1.2.4 丹酚酸B影響hPDLCs成骨分化 實驗分為對照組（Con組）：DMEM/F12+胎牛血清；標準成骨誘導培養(yǎng)基組（OIM組）：DMEM/F12+5%FBS、10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉、50 mg·L-1抗壞血酸、1×10-8mol·L-1地塞米松；丹酚酸B+標準成骨培養(yǎng)基組（Sal B+OIM組）：標準成骨培養(yǎng)基分別加入濃度為0.1、0.5、1、5 μmol·L-1的丹酚酸B。

1.2.5 ALP活性測定 將第3代hPDLCs以密度為每孔5×104個接種于24孔板中，待細胞生長至80%匯合后，按預先設置的分組對細胞進行誘導培養(yǎng)，即為Con組、OIM組、Sal B+OIM（0.1、0.5、1、5 μmol·L-1）組，培養(yǎng)7 d后去上清液，PBS沖洗2遍，加入0.2% TritonX-100 100 μL裂解2 h后，吹打1 min，取50 μL裂解液至96孔板中，按試劑盒說明進行OD值測定，并用BCA法測定細胞內的總蛋白量，校正ALP的活性結果。

1.2.6 ALP染色 將第3代hPDLCs以密度為每孔5×104個接種于24孔板中，待細胞生長至80%匯合后，按預先設置的分組對細胞進行誘導培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d后去上清液，PBS沖洗2遍，95%乙醇固定30 min后PBS沖洗2遍，加入按試劑盒要求配置的染液染色10 min，蒸餾水沖洗2遍后鏡下觀察成像。

1.2.7 礦化結節(jié)染色 將第3代hPDLCs以密度為每孔4×104個接種于24孔板中，待細胞生長至60%匯合后，按預先設置的分組對細胞進行誘導培養(yǎng)，培養(yǎng)20 d后去上清液，PBS沖洗2遍，95%乙醇固定30 min后PBS沖洗2遍，加入0.2%茜素紅染液（pH 8.4），37 ℃染色30 min，蒸餾水沖洗2遍后鏡下觀察成像。

1.2.8 real-time PCR檢測骨鈣素（osteocalcin，OCN）表達 取第3代hPDLCs，以密度為每孔3×105個接種于6孔板中，待細胞生長至80%匯合后，按預先設置的分組對細胞進行誘導培養(yǎng)，培養(yǎng)10 d后按照RNA提取試劑盒說明書提取RNA，將提取的總RNA用分光光度計定量，A260/A280比值在1.9～2.1之間表明RNA純度較好，同時采用凝膠電泳檢測RNA完整性，測定RNA濃度后取1 μg逆轉錄成cDNA，real-time PCR檢測成骨標志基因OCN mRNA的表達，β-actin作為內參。數(shù)據(jù)分析采用ΔΔCT法，數(shù)據(jù)取3次重復的平均值。實驗引物序列如下。OCN上游引物序列：5’-CGCTACCTGTATCAATGGCTGG-3’，下游引物序列：5’-ATGTGGTCAGCCAACTCGTCA-3’。β-actin上游引物序列：5’-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3’，下游引物序列：5’-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3’。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0軟件包的單因素方差分析對實驗數(shù)據(jù)進行處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 hPDLCs形態(tài)學觀察及鑒定

倒置顯微鏡下觀察到8～10 d內細胞從組織塊中游出，可見組織塊周圍出現(xiàn)梭形細胞，胞核清晰。繼續(xù)培養(yǎng)，組織塊周圍細胞增多，圍繞組織塊成放射狀、旋渦狀（圖1）。細胞免疫組織化學染色結果可見，波形絲蛋白染色陽性，表現(xiàn)為胞質棕黃色著色；角蛋白染色陰性，未見著色（圖2），說明細胞來源于中胚層。

圖 1 組織塊周圍出現(xiàn)細胞 倒置顯微鏡 × 40Fig 1 Cells grew around the tissue inverted microscope × 40

2.2 丹酚酸B對hPDLCs增殖活性的影響

通過MTT法檢測丹酚酸B對hPDLCs增殖活性有無影響，結果顯示在丹酚酸B濃度為0.1、0.5、1、5 μmol·L-1時其對hPDLCs增殖活性無影響（圖3）。

2.3 丹酚酸B提高hPDLCs的ALP活性

ALP是hPDLCs成骨分化的標志，ALP讀數(shù)和染色能反映其活性。Con組，OIM組，0.1、0.5、1、5 μmol·L-1Sal B+OIM組ALP檢測結果分別為（0.933± 0.029）、（1.110±0.037）、（1.140±0.023）、（1.362± 0.022）、（1.307±0.084）、（1.451±0.057）金氏單位·gprot-1。結果表明在礦化誘導條件下，丹酚酸B能增加hPDLCs的ALP活性，OIM組ALP表達較Con組高（P＜0.05），且當?shù)し铀酈濃度為0.5、1、5 μmol·L-1時其ALP活性讀數(shù)與OIM組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），ALP活性隨丹酚酸B濃度升高而增加，5 μmol·L-1與0.5 μmol·L-1組、1 μmol·L-1組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)。ALP染色顯示Sal B+OIM組與Con組和OIM組比較胞質藍染較深且較多，與ALP活性讀數(shù)有相似規(guī)律（圖4）。

圖 2 波形絲蛋白染色陽性（左），角蛋白染色陰性（右） 免疫組織化學染色 × 200Fig 2 Positive expression of vimentin(left), negative expression of keratin(right) immunohistochemistry × 200

圖 3 不同濃度丹酚酸B對hPDLCs活性的影響Fig 3 Effects of Sal B on hPDLCs activity

2.4 丹酚酸B促進hPDLCs礦化

細胞培養(yǎng)20 d后茜素紅染色結果顯示Con組未見礦化結節(jié)形成，OIM組可見散在礦化結節(jié)。而當?shù)し铀酈濃度為0.5、1、5 μmol·L-1時的Sal B+OIM組可見大量礦化結節(jié)，且礦化結節(jié)數(shù)量較OIM組明顯提高（圖5），上述結果提示一定濃度的丹酚酸B可以促進hPDLCs成骨分化形成礦化結節(jié)。

2.5 丹酚酸B提高hPDLCs的OCN mRNA表達

hPDLCs在不同條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后應用real-time PCR檢測第10天的OCN mRNA表達（圖6）。OIM組OCN mRNA表達較Con組高（P＜0.05），丹酚酸B各濃度組在礦化誘導培養(yǎng)液中均能促進OCN mRNA的表達，與Con組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），0.5、1、5 μmol·L-1Sal B+OIM組與OIM組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。當?shù)し铀酈濃度為5 μmol·L-1時OCN mRNA表達最高，但5 μmol·L-1組與0.5 μmol·L-1組、1 μmol·L-1組比較差異無統(tǒng)計學意義。

圖 4 hPDLCs在不同條件下誘導7 d時ALP染色結果 ALP染色 × 200Fig 4 ALP staining results of hPDLCs under different conditions for 7 d ALP staining × 200

圖 5 hPDLCs在不同條件下誘導20 d時茜素紅染色結果 茜素紅染色 × 100Fig 5 Alizarin red staining results of hPDLCs under different conditions for 20 d alizarin red staining × 100

圖 6 不同濃度丹酚酸B對OCN mRNA表達的影響Fig 6 Effects of different concentrations Sal B on OCN mRNA ex- pression

3 討論

丹參是一味古老的具有活血化瘀作用的中草藥，具有抗氧化、改善微循環(huán)防止血栓形成等多種功能。近年發(fā)現(xiàn)丹參可促進骨愈合，在預防股骨頭壞死及骨質疏松治療中有很好的療效。在動物模型中發(fā)現(xiàn)丹參可減輕牙周組織在矯治中的損傷，包括缺氧性損傷與炎癥性損傷，另一方面，丹參可以提高牙周組織的修復能力，包括清除變性壞死組織的能力和形成新生牙周組織的功能，丹參還能促進牙周膜成纖維細胞增殖及成骨分化增加其骨保護素分泌[10]。有研究[11]指出丹參提取物能有效地治療由糖皮質激素引起的大鼠骨質疏松。

丹酚酸B是丹參中的一種有效的提取物，分子式為C36H30O16，相對分子質量為718，呈淡黃色絮狀結晶，為三分子丹參素與一分子咖啡酸縮合而成，為丹參中含量最高活性最強的水溶性單體成分，具有很強的抗脂質過氧化和清除自由基作用。研究表明丹酚酸B能促進多種組織細胞增殖，具有抗氧化[3]和細胞保護等作用，其可通過介導多種途徑對骨髓干細胞進行保護，減少其凋亡[2]。有研究表明丹酚酸B能通過ET途徑對鼠心肌細胞進行保護[4]，且能通過抑制炎癥反應和促進內皮依賴性血管舒張改善血管功能[5]，這使其能被廣泛應用于心血管疾病的治療，而且使其成為治療內皮功能障礙相關的心血管疾病的一個有力的候選物質。研究[6-7]表明丹酚酸B具有神經(jīng)細胞保護作用且發(fā)揮神經(jīng)保護活性經(jīng)由抗炎和抗氧化作用，并且丹酚酸B可以是阿爾茨海默氏病治療的潛在候選物資，不僅如此它還能防止肝纖維化。有學者[8]研究發(fā)現(xiàn)丹酚酸B通過刺激成骨、骨髓血管生成和抑制脂肪形成起到防止糖皮質激素引起的骨質疏松的作用，另有學者[9]通過體外實驗對其刺激成骨能力進行研究表明，它能通過增強細胞外信號調節(jié)激酶通路促進間充質干細胞成骨分化。而牙周炎的主要病理改變是牙槽骨吸收和牙周袋形成，恢復附著喪失形成牙周新附著一直是治療牙周病的最終目標。hPDLCs是構成牙周膜的細胞群，實驗表明其具有干細胞特性，有成骨分化能力，丹酚酸B刺激間充質干細胞的成骨能力如能作用于hPDLCs將對牙周炎中根周病理性吸收的牙槽骨的再生治療提供新的思考和方向，本實驗對丹酚酸B對hPDLCs成骨分化能力的影響研究結果顯示，丹酚酸B還具有促進hPDLCs成骨分化的作用。

為了評價丹酚酸B對hPDLCs成骨分化的影響，筆者首先檢測了hPDLCs的ALP活性，ALP作為早期成骨分化的標志物，其活性能反映成骨細胞成熟狀態(tài)[12-15]。其可使局部鈣、磷濃度升高，有助于礦化機制的進行，是促進骨間質礦化的重要酶。本實驗結果表明當?shù)し铀酈濃度在0.5、1、5 μmol·L-1時能有效提高hPDLCs的ALP活性，從而增強其成骨活性，且在本實驗濃度范圍內其ALP活性隨丹酚酸B濃度升高而提高。

OCN是成骨細胞合成分泌的一種非膠原蛋白，是反映成骨細胞分化成熟的指標，能表示成骨細胞的活性，它能準確反映成骨細胞的成骨功能[16-17]。其主要生理作用是反映骨轉換的指標，當骨形成和骨吸收解偶聯(lián)時，OCN是反映骨形成的特異指標。本實驗中，hPDLCs在加入了0.5、1、5 μmol·L-1丹酚酸B的礦化培養(yǎng)液中培養(yǎng)能被顯著增強OCN mRNA的表達，且在濃度為5 μmol·L-1時表達最強，但在此實驗濃度范圍內無明顯濃度依賴性。丹酚酸B能有效促進hPDLCs成骨分化，從而在牙周組織再生中起到重要作用，而OCN作為骨形成的重要指標其mRNA表達增加有利于發(fā)揮它在生物礦化中的特有作用。

筆者對丹酚酸B對hPDLCs礦化能力的影響進行了檢測。鈣鹽沉積是中晚期的成骨指標[18]，結果發(fā)現(xiàn)在丹酚酸B濃度為0.5、1、5 μmol·L-1這幾個有效濃度下hPDLCs較未加丹酚酸B的普通礦化培養(yǎng)基下的hPDLCs更早出現(xiàn)細胞聚集，并出現(xiàn)了更多和更大的礦化結節(jié)。這表明丹酚酸B能顯著提高hPDLCs的礦化能力，促進其形成礦化結節(jié)。

綜上所述，適宜濃度的丹酚酸B能夠有效促進hPDLCs成骨分化，且有可能是通過提高hPDLCs的ALP活性和促進其OCN mRNA表達而實現(xiàn)。本實驗為進一步研究丹酚酸B對牙周炎的治療作用奠定了重要基礎，有助于牙周炎組織再生的實現(xiàn)，但其具體機制及應用于體內模型中的作用與方法尚待深入研究。筆者將在后續(xù)實驗中研究其體外促進成骨機制且采用動物模型模擬牙周炎時骨缺損狀態(tài)用以進一步探討丹酚酸B的實際應用價值。

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（本文編輯 杜冰）

Effects of salvianolic acid B on osteogenic differentiation of human periodontal ligament cells

Ma Yue1,2, Ren Aishu1,2, Fu Gang3.
(1. Dept. of Orthodontics, Stomatological Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 401147, China; 2. Chongqing Key Laboratory of Oral Diseases and Biomedical Sciences, Chongqing 401147, China; 3. Chongqing Municipal Key Laboratory of Oral Biomedical Engineering of Higher Education, Chongqing 401147, China)

Supported by: Scientific and Technological Research Program of Chongqing Yuzhong (20140128); Project Supported by Health Bureau of Chongqing (2011-2-180); Program for Innovation Team Building at Institutions of Higher Education in Chongqing in 2013 (KJTD201314). Correspondence: Ren Aishu, E-mail: rasras@163.com.

Objective This study investigated the effects of salvianolic acid B (Sal B), a major bioactive component of the Chinese medicine salvia miltiorrhiza, on osteogenic differentiation of human periodontal ligament cells (hPDLCs). Methods Third passage PDLCs were used in this experiment. Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method was employed to observe the effects of different Sal B concentrations on proliferation activity of hPDLCs. Alkaline phosphatase (ALP) activity and mineralization capability were measured, and mRNA expression of osteocalcin (OCN) was detected to investigate the effects of Sal B on osteogenesis of hPDLCs. Results Sal B did not influence the viability of hPDLCs. The ALP activity and OCN mRNA expression levels of hPDLCs were both significantly improved (P<0.05) under treatment with different Sal B concentrations （0.5， 1， and 5 μmol·L-1) compared with those in OIM group. Moreover, the number of mineralized nodules formed by hPDLCs were considerably higher under treatment with different Sal B concentrations （0.5， 1， and 5 μmol·L-1) than that in the OIM group. Conclusion Appropriate Sal B concentration can improve the osteogenic differentiation of hPDLCs.

salvianolic acid B; human periodontal ligament cells; osteogenic differentiation; alkaline phosphatase activity; mineralized nodules

R 781.4

A [doi] 10.7518/hxkq.2016.05.007

2016-01-06；

2016-07-12

重慶市渝中區(qū)科委基金（20140128）；重慶市衛(wèi)生局基金資助項目（2011-2-180）；2013年重慶高校創(chuàng)新團隊建設計劃資助項目（KJTD201314）

馬玥，碩士，E-mail：yaotong6@hotmail.com

任嬡姝，副教授，博士，E-mail：rasras@163.com