根尖維管組織在狗薔薇類原球莖發(fā)生中的作用

劉鳳欒，閔　睫，陳　青，田代科，趙梁軍

(1 中國農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，北京 100193；2 上海辰山植物園 中國科學院上海辰山植物科學研究中心，上海市資源植物功能基因組學重點實驗室，上海 201602)

?

根尖維管組織在狗薔薇類原球莖發(fā)生中的作用

劉鳳欒1,2，閔睫2，陳青2，田代科2，趙梁軍1*

(1 中國農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，北京 100193；2 上海辰山植物園 中國科學院上海辰山植物科學研究中心，上海市資源植物功能基因組學重點實驗室，上海 201602)

為了解狗薔薇(RosacaninaL.)類原球莖發(fā)生機制，以建立月季高效再生體系，探討了根尖內(nèi)部維管組織在狗薔薇愈傷-不定根根尖膨大發(fā)育為類原球莖過程中所起作用。剪切試驗發(fā)現(xiàn)，脫離愈傷的狗薔薇不定根根尖不能誘導類原球莖形成；橋接培養(yǎng)表明，通過維管組織向根尖運輸外源激素TDZ誘導類原球莖發(fā)生的效率高于共質(zhì)體運輸方式；TIBA(2, 3, 5-triiodobenzoic acid)處理限制了根尖維管組織向分生區(qū)的延伸速度，并最終影響了類原球莖發(fā)生率；在類似狗薔薇愈傷-不定根結(jié)構(gòu)的蒺藜苜蓿(MedicagotruncatulaGaertn.)根段-不定根上也重現(xiàn)了根尖被誘導發(fā)育為綠色球體過程。由此表明，愈傷-不定根中完整的維管組織是狗薔薇類原球莖發(fā)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)之一，揭示獲得與愈傷-不定根類似的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和組合模式的外植體(如毛狀根)，并將其視為整體進行誘導培養(yǎng)，是建立月季類原球莖再生體系的前提之一。

狗薔薇；類原球莖；維管組織；薔薇屬；TDZ

類原球莖(protocorm-like body，PLB)原指蘭科植物莖尖、葉片等外植體被誘導產(chǎn)生類似其種子萌發(fā)過渡態(tài)——原球莖的一種組織結(jié)構(gòu)[1-2]，認為它是包含了未分化的薄壁細胞團和多個分生中心的類似嫩莖的器官[3]，在植物高效再生、遺傳轉(zhuǎn)化、次生代謝物質(zhì)生產(chǎn)及植物發(fā)育生物學研究等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用價值[4]。我們課題組首次在狗薔薇(RosacaninaL.)葉片愈傷產(chǎn)生的不定根根尖上成功誘導出類原球莖[5]，并發(fā)現(xiàn)香水月季(R.odorataSweet)、多花薔薇(R.multifloraThunb.)和月季(R.hybridaL.)等9種薔薇屬植物亦可不同程度地重現(xiàn)此過程[6-7]。已有研究表明，狗薔薇類原球莖是體胚與器官發(fā)生的聚合體[5, 8]，且再生率極高，為薔薇屬植物潛在的良好遺傳轉(zhuǎn)化受體[9]。結(jié)合其相關(guān)功能基因RcSERK1(SOMATICEMBRYOGENESISRECEPTOR-LIKEKINASE1)[10]、RcWUS(WUSCHEL)[11]、RcKN1(KNOX1)[12]、RcLEC1(LEAFYCOTYLEDON1)等在擬南芥及煙草中的表達規(guī)律和功能驗證，以及細胞分裂素[13-14]和生長素[15]在誘導其發(fā)生過程中的調(diào)控作用等研究結(jié)果，初步證明：狗薔薇類原球莖發(fā)生為“不定根根尖激素平衡破壞 — 根尖分生中心分化 — 體胚發(fā)生和器官發(fā)生(類原球莖發(fā)生) — 再生芽”過程，并發(fā)現(xiàn)偏藍光和紅光分別有利于其啟動發(fā)生和分化萌發(fā)[16]。同時，此過程僅局限于不定根根尖分生區(qū)，易于解剖觀察與定位，且內(nèi)部發(fā)育與外部形態(tài)對應(yīng)準確，取材方便，故此再生體系也是研究薔薇屬植物細胞分化、器官發(fā)生的良好體系。基于上述特點，狗薔薇類原球莖對薔薇屬植物具有重要的研究和利用價值，進一步了解其發(fā)生機制，對建立月季類原球莖再生體系以用于工廠化快繁和分子育種具有指導作用。

不同于其它植物類原球莖使用獨立的莖尖、葉片切塊等外植體即可被誘導[4, 17]，狗薔薇類原球莖的發(fā)生要求將其葉片產(chǎn)生的愈傷-不定根視為整體進行培養(yǎng)[5, 8]。針對這一獨特現(xiàn)象，本研究以狗薔薇類原球莖發(fā)生體系為研究對象，通過比較不同培養(yǎng)方式下愈傷-不定根根尖的形態(tài)發(fā)育及其類原球莖發(fā)生特點，分析維管組織在誘導狗薔薇類原球莖發(fā)生過程中作用，為闡明薔薇屬植物類原球莖發(fā)生的分子機理提供參考。

1　材料和方法

1.1材料與試劑

狗薔薇類原球莖再生體系：以狗薔薇葉片為外植體，在MS + 1.5 mg/L 2,4-D培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)4周后，其葉片愈傷形成大量不定根。將愈傷-不定根轉(zhuǎn)接至1/2 MS + 20 mg/L TDZ培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)，可誘導不定根根尖膨大產(chǎn)生大量類原球莖，類原球莖經(jīng)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)可萌芽成為新植株，此即狗薔薇類原球莖再生體系[5,8](圖1)。試驗材料為各個處理下不同發(fā)育時期的愈傷-不定根根尖及其類原球莖。蒺藜苜蓿(2HA)由中國科學院植物研究所贈送。形態(tài)解剖采用常規(guī)石蠟切片切片技術(shù)，Olympus BX-51顯微鏡觀察拍照。

1.2方法

1.2.1不定根維管組織完整性對根尖類原球莖形成的影響隨機選取具有5～7條不定根的愈傷，進行不定根剪切培養(yǎng)試驗(圖2)：剪取10個愈傷的所有不定根根尖(S1，約0.1 cm)，均分2份，于誘導培養(yǎng)基中分別豎置和平置培養(yǎng)；其剩余的愈傷-不定根(C-S2)與上述豎置、平置根尖S1培養(yǎng)于同一皿中，重復3皿。同樣操作，剪取上半部不定根(S3)，剪取整條不定根(S5)，剪切不定根成根段(S6)進行豎置與平置培養(yǎng)，各自剩余部分的愈傷-不定根培養(yǎng)于對應(yīng)皿中。對照為正常誘導、未剪切的愈傷-不定根。

培養(yǎng)5 d和15 d時，采樣S2、S4不定根各20條，切片觀察不定根切口位置發(fā)育狀況。培養(yǎng)40 d時，統(tǒng)計各處理不定根根尖類原球莖發(fā)生率。發(fā)生率=形態(tài)發(fā)生不定根數(shù)/總不定根數(shù)。

A、a. 0 d的愈傷-不定根；B、b. 培養(yǎng)5 d時，根尖變綠，PVE延生至分生區(qū)，細胞功能發(fā)生轉(zhuǎn)變；C、c. 培養(yǎng)12 d，根尖呈紡錘體，其內(nèi)部細胞分化為薄壁細胞；D、d. 培養(yǎng)30 d，膨大根尖表面形成類原球莖；E、e. 培養(yǎng)35 d，類原球莖萌芽。PLB. 類原球莖；PVE. 孔紋管分子；RC. 根冠；VT. 維管組織。綠色圓圈. 根尖干細胞池位置。圖1　狗薔薇類原球莖發(fā)生發(fā)育過程A, a. Callus - rhizoids；B, b. PVE extended to the meristem where the cells dedifferentiation began at 5 days on TDZ medium；C, c. Spindle-shaped tips showing parenchyma cells at 12 days on TDZ medium；D, d. PLBs were formed on the rhizoid tips at 30 days；E, e. PLBs generated buds at 35 days. PLB. Protocorm-like body；PVE. Pitted vessel element；RC. Root cap；VT. Vascular tissue. Green circle. Stem cell nicheFig.1　The developmental process of PLBs formation in R. canina

S1. 剪取0.1 cm根尖；C-S2. 剪去0.1 cm根尖的愈傷-不定根；S3. 剪取上半部的不定根；C-S4. 剪去上半部根尖的愈傷-不定根；S5. 剪取整條根培養(yǎng)；S6. 剪切整條根為多個根段培養(yǎng)；C. 愈傷圖2　愈傷-不定根的剪切處理示意圖S1. 0.1 cm tip；C-S2. Callus-rhizoids without 0.1 cm tips；S3. The upper half tip；C-S4. Callus-rhizoids without the upper half tips；S5. The whole rhizoid was cut for culturing；S6. Rhizoid segments were cultured；C. CallusFig.2　Schematic of cutting treatment on the callus-rhizoids

0-T. 愈傷在1/2 MS培養(yǎng)基而根尖在TDZ誘導培養(yǎng)基；T-0. 愈傷在TDZ誘導培養(yǎng)基而根尖在1/2 MS培養(yǎng)基圖3　愈傷-不定根的橋接培養(yǎng)示意圖0-T. Callus was cultured on 1/2MS medium while rhizoid tips on TDZ-induction medium；T-0. Callus was cultured on TDZ-induction medium while rhizoid tips on 1/2MS mediumFig.3　Schematic of bridging culture of callus-rhizoids

1.2.2不定根維管組織對根尖早期發(fā)育的影響在一個培養(yǎng)皿中制作2種不同培養(yǎng)基，一側(cè)為正常的1/2 MS + TDZ誘導培養(yǎng)基，一側(cè)為無誘導激素的1/2 MS培養(yǎng)基(圖3)。剪掉過長或過短不定根，愈傷保留約1.0 cm不定根1～2條，然后將愈傷-不定根分別搭接于兩側(cè)培養(yǎng)基。每皿正、反橋接各5個愈傷-不定根，每側(cè)正常接種5個愈傷-不定根作為對照(CK1、CK2)，重復10皿。培養(yǎng)40 d后，統(tǒng)計不定根根尖類原球莖發(fā)生率。

1.2.3不定根維管組織向頂延伸速度對根尖發(fā)育的影響生長素的極性運輸促使維管組織的向前分化和延伸[18-19]。作為生長素的競爭底物，TIBA可與根尖內(nèi)部運輸生長素的PINs蛋白結(jié)合，進而抑制生長素的極性運輸[20-21]。不同濃度TIBA均抑制狗薔薇類原球莖的發(fā)生，0.1 mmol/L TIBA為其半抑制濃度，故選擇此濃度進行試驗。(1)TIBA抑制培養(yǎng)后轉(zhuǎn)至TDZ誘導培養(yǎng)：在TDZ+0.1 mmol/L TIBA抑制培養(yǎng)基接種愈傷-不定根，每皿20個，共20皿。預培養(yǎng)1、3、5和7 d后，分別轉(zhuǎn)移3皿外植體至TDZ培養(yǎng)基上誘導培養(yǎng)，同時剪取1皿約50個根尖，切片觀察其發(fā)育狀態(tài)；剩余2～4皿不轉(zhuǎn)接、持續(xù)抑制培養(yǎng)作為對照(CKTIBA)。(2)TDZ誘導培養(yǎng)后轉(zhuǎn)至TIBA抑制培養(yǎng)，操作方法同上，剩余2～4皿持續(xù)誘導培養(yǎng)作為對照(CKTDZ)。2個處理均在轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基培養(yǎng)40 d后，統(tǒng)計愈傷-不定根根尖類原球莖發(fā)生率。

1.2.4不定根(維管組織)長度對根尖類原球莖發(fā)生的影響將愈傷-不定根接入TDZ培養(yǎng)基誘導類原球莖，每皿20個外植體，重復5皿。培養(yǎng)5 d后，按長度分成短(≤0.5 cm)、中(0.5 ～ 1.0 cm)和長(≥1.0 cm)等3種不定根，每種剪取根尖(長度0.3 ～ 0.5 cm)各20個，F(xiàn)AA固定，制作石蠟切片。培養(yǎng)12 d后，統(tǒng)計3種不定根根尖發(fā)育狀態(tài)；培養(yǎng)40 d后，統(tǒng)計3種不定根根尖類原球莖發(fā)生率。

1.2.5類愈傷-不定根外植體的類原球莖誘導及其形態(tài)學觀察類似狗薔薇葉片愈傷可形成不定根，課題組以蒺藜苜蓿(2HA)組培苗根段為外植體誘導獲得不定根：將2HA組培苗的根切成約0.5 cm長度，接種至P4+ 10 μmol/L NAA + 0.2 mmol/L GSSG培養(yǎng)基[22]，黑暗培養(yǎng)3周后，根段表面形成大量不定根。模擬狗薔薇愈傷-不定根誘導類原球莖的條件，可誘導此根段-不定根根尖膨大成為綠色球體，但未能進一步形成類原球莖。為了解造成此差異的原因，在誘導培養(yǎng)5、9 、20 和30 d后，對蒺藜苜蓿根段-不定根進行根尖取樣，每時期20個，進行石蠟切片、解剖學觀察。

2　結(jié)果與分析

2.1愈傷-不定根維管組織完整性對根尖類原球莖形成的作用

將不定根由愈傷剪切下誘導培養(yǎng)，無論是豎置或平置的根尖S1、半條根S3、整條根S5和由整條根剪取的根段S6，均無法形成類原球莖。相反，剪去根尖S1和上半部S3后，剩余C-S2和C-S4不定根切口位置產(chǎn)生類原球莖，但發(fā)生率降低，分別為15.2%和20.7%(圖4)。

切片顯示，剪切處理的C-S2和C-S4在培養(yǎng)5 d時，兩者不定根切口位置細胞分裂為排列緊密的小細胞(圖5，A)，并可見多條清晰的導管分子。至15 d時，切口處細胞膨大發(fā)育為一團愈傷組織(圖5，B)，40 d后愈傷表面產(chǎn)生類原球莖。剪切試驗結(jié)果表明，愈傷-不定根作為有機整體，即保證愈傷與不定根內(nèi)部維管組織的完整性，是狗薔薇類原球莖可獨特發(fā)生的前提之一。

2.2不定根維管組織在根尖早期分化中的作用

橋接培養(yǎng)中，兩種相反橋接方式的根尖類原球莖發(fā)生率差異顯著(圖6)。愈傷在TDZ培養(yǎng)基-根尖在無TDZ培養(yǎng)基的T-0培養(yǎng)方式，誘導根尖類原球莖發(fā)生率顯著低于正常誘導培養(yǎng)CK1，但顯著高于與其反向的0-T培養(yǎng)方式(圖6)。分析造成此差異的主要原因為：T-0通過維管組織而0-T經(jīng)胞間連絲向不定根根尖輸送激素與營養(yǎng)物質(zhì)，前者運輸效率及能力遠大于后者，由此導致了不同的根尖早期分化及功能轉(zhuǎn)變效率[8]，進而影響了根尖后期類原球莖誘導效果。

圖中不同小寫字母表示0.05水平差異顯著，下同。圖4　不同剪切處理對根尖類原球莖誘導的效果Different normal letters indicate significant difference at 0.05 level，the same as belowFig.4　The PLBs formation on the rhizoids with different cutting treatments

A.誘導培養(yǎng)5 d，切除根尖不定根的切口處細胞分裂為小細胞(黑色箭頭所示)；B. 誘導培養(yǎng)15 d，不定根切口小細胞膨大發(fā)育成為愈傷組織(白色箭頭所示)，維管組織(VT)發(fā)達圖5　切除根尖不定根切口的發(fā)育解剖A. Lots of little cells were observed at the incision of the rhizoid ithout tip (black arrow)；B. Little cells on the rhizoid incision swelled into callus (white arrow)，and vascular tissue was well developedFig.5　Histological analyses of the rhizoids without tips

圖6　不同橋接方式培養(yǎng)下根尖類原球莖發(fā)生率的差異Fig.6　Different rates of PLBs formation between two ways of bridging culture

TIBA-TDZ. 在TIBA抑制培養(yǎng)基預培養(yǎng)特定天數(shù)后轉(zhuǎn)移至TDZ誘導培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；TDZ-TIBA. 在TDZ誘導培養(yǎng)基預培養(yǎng)特定天數(shù)后轉(zhuǎn)移至TIBA抑制培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)； X軸CKTDZ/CKTIBA.CKTIBA. 愈傷-不定根在TIBA抑制培養(yǎng)基上持續(xù)培養(yǎng)作為對照；CKTDZ. 愈傷-不定根在TDZ誘導培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)作為對照圖7　TIBA或TDZ預培養(yǎng)對狗薔薇類原球莖發(fā)生的影響TIBA-TDZ. Callus-rhizoids were transferred to TDZ medium after TIBA-preculture；TDZ-TIBA. Callus-rhizoids were transferred to TIBA medium after TDZ-preculture；X-axis CKTIBA / CKTDZ. Callus-rhizoids were cultured on TIBA or TDZ medium all the timeFig.7　The effects of preculture on TIBA or TDZ medium for PLBs formation

2.3不定根維管組織延遲發(fā)育對根尖類原球莖發(fā)生的抑制作用

抑制培養(yǎng)1 d再轉(zhuǎn)入誘導培養(yǎng)，其根尖類原球莖誘導率顯著高于持續(xù)抑制培養(yǎng)CKTIBA。然而，過長抑制預培養(yǎng)(≥3 d)會導致不可逆的抑制效果，這些愈傷-不定根再轉(zhuǎn)移至誘導培養(yǎng)，其類原球莖發(fā)生率與持續(xù)抑制培養(yǎng)CKTIBA差異不大(圖7)。反之，誘導預培養(yǎng)7 d再抑制培養(yǎng)的愈傷-不定根，其類原球莖發(fā)生率雖低于持續(xù)誘導培養(yǎng)CKTDZ但高于持續(xù)抑制培養(yǎng)CKTIBA，這表明，誘導預培養(yǎng)可一定程度消除TIBA對不定根根尖膨大發(fā)育的抑制作用，但同時統(tǒng)計結(jié)果顯示，少于7 d的誘導預培養(yǎng)無此顯著抵消效果(圖7)。

切片觀察發(fā)現(xiàn)，抑制培養(yǎng)不定根的根尖發(fā)育進程較誘導培養(yǎng)滯后2 ～3 d：抑制培養(yǎng)7 d 時，僅少部分根尖樣品的維管組織延伸至根尖分生區(qū)，而此事件在正常誘導5 d時即可大量發(fā)生(圖8)。這暗示，生長素運輸抑制劑TIBA的存在，擾亂了愈傷-不定根根尖內(nèi)部的生長素極性輸出，進而阻礙不定根維管組織向根尖的快速分化、延伸。因此，此抑制試驗間接證明了愈傷-不定根維管組織對狗薔薇類原球莖發(fā)生的重要作用。

A.抑制培養(yǎng)3 d，根尖根冠解體，分生區(qū)結(jié)構(gòu)秩序混亂；B.抑制培養(yǎng)5 d，2 ～ 3條導管(箭頭)延伸至分生區(qū)；C.抑制培養(yǎng)7 d，維管束逐漸成熟，PVE出現(xiàn)在原分生區(qū)中柱細胞位置；a ～ c. 正常TDZ誘導下根尖發(fā)育過程圖8　TIBA對根尖維管組織向頂延伸的阻礙作用A. Stem cell niche became disorder and rhizoid cap started to disintegrate at 3 days on TIBA medium；B. Two-three vessels extended to the meristem at 5 days on TIBA medium；C. Vascular tissue matured，PVE formed at stele area； a-c. The normal process of callus-rhizoids cultured on TDZFig.8　The establishment of vascular channel was delayed by TIBA

2.4不定根維管組織長度與根尖發(fā)育狀態(tài)的關(guān)系

不同長度不定根在誘導培養(yǎng)基上發(fā)育不同步。長度越短，根尖膨大越快，形成類原球莖的能力越強(表1)。切片結(jié)果顯示，同一時期相比，長度小于0.5 cm不定根的維管組織向根尖延伸速度最快、到達分生區(qū)最早，且分生區(qū)細胞發(fā)生分化、分裂最早(數(shù)據(jù)未顯示)。與之相比，長度大于1.0 cm不定根內(nèi)部維管組織發(fā)育相對遲緩。這表明，不定根長度及維管組織延伸速度與狗薔薇根尖類原球莖的發(fā)生存在密切關(guān)系。

2.5蒺藜苜蓿根段-不定根類原球莖誘導及其形態(tài)學分析

在誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)20 d后，蒺藜苜蓿根段-不定根(圖9，A)根尖膨大成綠色球體(圖9，B、C)。培養(yǎng)至30 d，根尖綠色球體衰老、解體，無類原球莖發(fā)生。與狗薔薇愈傷-不定根發(fā)育形態(tài)學比較，兩者根尖膨大發(fā)育至綠色球體過程相似，均經(jīng)歷維管組織向頂延伸、分生區(qū)細胞分化、根尖外圍細胞膨大(圖8，a ～ c)等事件。之后階段產(chǎn)生差別：蒺藜苜蓿根尖綠色球體外層細胞凋亡，其內(nèi)層細胞未分化出類原球莖分生中心(圖9，D)，且最終未能形成類原球莖。導致此結(jié)果的具體原因需進一步探討。

表1　不定根長度對根尖發(fā)育及其類原球莖發(fā)生的影響Table 1　The effect of rhizoid length on the development of rhizoid tips and PLBs

注. 表中百分比為形態(tài)發(fā)生不定根數(shù)/總不定根數(shù)，為平均值±標準誤差；a、b表示差異顯著性(P< 0.05)

Note. The percentage including mean ± SE means of the number of developing rhizoids / the total number of rhizoids；a and b show significant difference (P< 0.05)

A.蒺藜苜蓿根段被誘導出白色不定根；B.根段-不定根培養(yǎng)20 d，不定根根尖形成綠色球體；C.不定根根尖外圍細胞膨大發(fā)育，原有序組織結(jié)構(gòu)喪失；D.球體根尖外圍細胞開始解體圖9　蒺藜苜蓿根尖類原球莖的誘導A. Many white rhizoids were inducted on the root segments；B. Rhizoid tips developed into green globular tips at 20 days；C. The outer cells of rhizoid tips were swelling；D. The outer cells of globular rhizoids started to disintegrateFig.9　PLBs induction from the rhizoid tips of Medicago truncatula

3　討　論

在外源高濃度TDZ培養(yǎng)基上，狗薔薇不定根根尖失去原有的延伸功能，其結(jié)構(gòu)有序、功能確定的分生組織轉(zhuǎn)變?yōu)榉至鸦钴S、脫分化的細胞群，經(jīng)分生中心發(fā)育成類原球莖，此即狗薔薇類原球莖的形態(tài)發(fā)育過程[8,23]。與其它植物類原球莖的誘導方式不同，此再生體系的獨特發(fā)生，與將愈傷-不定根整體作為外植體、而非傳統(tǒng)培養(yǎng)方式以不定根切段或愈傷單獨為外植體有關(guān)：在剪切試驗中，將不定根從愈傷分離進行獨立培養(yǎng)，破壞了兩者結(jié)合時其內(nèi)部完整封閉的維管組織所具備的毛細管作用，根尖無法快速從培養(yǎng)基中吸收激素和營養(yǎng)，故不能改變自身發(fā)育進程。

橋接試驗中，在向不定根根尖輸送營養(yǎng)與外源激素方式上，T-0和0-T處理存在極大不同：前者為通過維管組織的外質(zhì)體運輸，后者是經(jīng)細胞質(zhì)與胞間連絲的共質(zhì)體運輸。前者運輸物質(zhì)能力顯著高于后者，這保證了短時間內(nèi)向根尖分生區(qū)匯聚大量外源激素與物質(zhì)，進而誘導后續(xù)發(fā)育事件[8,24-25]。同時，結(jié)合前者根尖內(nèi)部發(fā)育較后者快速的形態(tài)事實(數(shù)據(jù)未顯示)，說明維管組織的存在對不定根根尖前期功能轉(zhuǎn)變具有重要催化作用。

已有研究表明，生長素是導管分子分化的先決條件[26-27]，其極性運輸促使了維管組織的向前分化和延伸[18-19]。在本研究中，作為生長素運輸?shù)鞍滓种苿┑腡IBA，抑制已有維管組織向不定根根尖分生區(qū)的延伸，最終阻礙了根尖膨大發(fā)育、降低了類原球莖發(fā)生率。此試驗反證了愈傷-不定根內(nèi)部維管組織的快速向頂延伸對狗薔薇類原球莖發(fā)生的促進作用。此外，不定根越短，根尖膨大越早、類原球莖發(fā)生率越高，暗示不定根維管組織長度也會對狗薔薇類原球莖的形成產(chǎn)生影響。

前人使用不同濃度TDZ，在完整種苗的下胚軸[28]、子葉節(jié)[29-32]等部位誘導形成體胚或幼芽。在此過程中，除運輸營養(yǎng)物質(zhì)以外，種苗內(nèi)部的維管組織亦可能起著對TDZ(或其衍生物)的快速運輸、匯集作用。

上述資料表明，依賴完整獨立的維管組織，愈傷至不定根根尖之間建立了一條‘運輸通道’，使得培養(yǎng)基(‘源’)中營養(yǎng)與外源激素可被快速運輸至不定根的根尖(‘庫’)，從而引發(fā)了根尖膨大發(fā)育[8,15]，即封閉獨立的維管組織是催化狗薔薇根尖功能轉(zhuǎn)變、誘導類原球莖發(fā)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)之一。這提示，月季中建立類原球莖再生體系的前提是尋找或建立類似狗薔薇愈傷-不定根這種獨特結(jié)構(gòu)模式的外植體，或其它類似具獨立成熟維管組織的結(jié)構(gòu)組織。本研究中，以類似愈傷-不定根的蒺藜苜蓿根段-不定根為外植體，雖未最終誘導類原球莖，但成功實現(xiàn)了不定根根尖的膨大發(fā)育，一定程度上輔證了上述推論的合理性。此外，易自發(fā)形成毛發(fā)不定根的植物，或受發(fā)根農(nóng)桿菌侵染易產(chǎn)生毛發(fā)根的植物，亦可嘗試通過愈傷/莖段-不定根等外植體誘導其類原球莖發(fā)生。

[1]徐程，詹忠根，張銘. 中國蘭的組織培養(yǎng)[J]. 植物生理學報，2002，38(2)：171-174.

XU C，ZHAN Z G，ZHANG M. Tissue culture of Chinese orchid[J].PlantPhysiologyJournal，2002，38(2)：171-174.

[2]MOREL G M．Producing virus-free cymbidiums[J].AmericanOrchidSocietyBulletin，1960，29：495-497.

[3]詹忠根，徐程，張銘. 蘭科植物原球莖(類原球莖 )的形態(tài)建成[J]. 種子，2002，5：36-37.

ZHAN Z G，XU C，ZHANG M. The Morphogenesis of protocorms(protocorm-like body) in orchids[J].Seed，2002，5：36-37.

[4]姜福星，劉鳳欒，趙梁軍. 植物類原球莖的研究與應(yīng)用[J]. 核農(nóng)學報，2012，26(3)：478-483.

JIANG F X，LIU F L，ZHAO L J. Research and application of plant protocorm-like body[J].JournalofNuclearAgriculturalSciences，2012，26(3)：478-483.

[5]TIAN C W，CHEN Y，ZHAO X L，etal. Plant regeneration through protocorm-like bodies induced from rhizoids using leaf explants ofRosaspp[J].PlantCellReport，2008，27(5)：823-831.

[6]郭艷超，張倩，田傳衛(wèi)，等. 香水月季類原球莖(PLBs)途徑再生植株的研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學學報，2008，13(5)：29-34.

GUO Y C，ZHANG Q，TIAN C W，etal. Regeneration ofRosaodoratavia protocorm-like bodies[J].JournalofChinaAgriculturalUniversity，2008，13(5)：29-34.

[7]田傳衛(wèi)，尚愛芹，張建甫，等. 多花薔薇假珠芽誘導、體細胞胚發(fā)生及植株高效再生[J]. 園藝學報，2008，35(3)：403-408.

TIAN C W，SHANG A Q，ZHANG J F，etal. Pseudobulbils induction，somatic embryogenesis and shoot regeneration inRosamultifloraThunb[J].ActaHorticulturaeSinica，2008，35(3)：403-408.

[8]LIU F L，ABDURAZAK I，XI L，etal. Morphohistological analysis of the origin and development ofRosacaninaprotocorm-like bodies[J].ScientiaHorticulturae，2014，167：107-116.

[9]畢玲，劉鳳欒，董愛香，等. 狗薔薇類原球莖遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J]. 核農(nóng)學報，2012，26(2)：270-274.

BI L，LIU F L，DONG A X，etal. Establishment of genetic transformation system in protcorm like-body(PLB) ofRosacanina[J].JournalofNuclearAgriculturalSciences，2012，26(2)：270-274.

[10]XU K D，LIU Q L，YANG H F，etal. Isolation and molecular characterisation ofRcSERK1：ARosacaninagene transcriptionally induced during initiation of PLBs[J].AfricanJournalofBiotechnology，2011，10(20)：4 011-4 017.

[11]姜福星，劉鳳欒，趙梁軍. 狗薔薇RaWUS基因的超量表達誘導轉(zhuǎn)基因煙草根系形成不定芽[J]. 林業(yè)科學，2011，47(12)：43-52.

JIANG F X，LIU F L，ZHAO L J. Overexpression ofRaWUSgene ofRosacaninainducing shoot regeneration from root tip of transgenic tobacco[J].ScientiaSilvaeSinicae，2011，47(12)：43-52.

[12]姜福星，張建甫，劉鳳欒，等. 狗薔薇RcKN1基因的克隆及功能分析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2012，20(7)：715-725.

JIANG F X，ZHANG J F，LIU F L，etal. Cloning and functional characterization ofRcKN1 gene fromRosacaninaL[J].JournalofAgriculturalBiotechnology，2012，20(7)：715-725.

[13]GAO B，F(xiàn)AN L S，LI X X，etal.RcRR1，aRosacaninatype-A response regulator gene，is involved in cytokinin-modulated rhizoid organogenesis[J].PLoSONE，2013，8(8)：e72914. doi:10.1371/journal.pone.0072914.

[14]王玲，高彬，溫超，等. 狗薔薇細胞分裂素氧化酶基因RcCKX5的克隆及表達分析[J]. 園藝學報，2014，41(7)：1 418-1 426.

WANG L，GAO B，WEN C，etal. Isolation and expression analysis of cytokinin dehydrogenase geneRcCKX5 inRosacanina[J].ActaHorticulturaeSinica，2014，41(7)：1 418-1 426.

[15]劉鳳欒，寇亞平，陳曉麗，等. 狗薔薇生長素輸出載體基因PIN1和PIN2的分離與表達分析[J]. 園藝學報，2014，41(5)：925-934.

LIU F L，KOU Y P，CHEN X L，etal. Cloning and expression analysis ofPIN1 andPIN2 encoding auxin efflux carriers inRosacanina[J].ActaHorticulturaeSinica，2014，41(5)：925-934.

[16]趙宏偉，寇亞平，王軻永，等. 光質(zhì)對狗薔薇類原球莖發(fā)生和植株再生的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學學報，2015，20(4)：113-119.

ZHAO H W，KOU Y P，WANG K Y，etal. Effects of light quality onRosacaninaPLBs induction and plant regeneration[J].JournalofChinaAgriculturalUniversity，201520(4)：113-119.

[17]張超，王廣東. 文心蘭原球莖形態(tài)發(fā)生與可溶性物質(zhì)及抗氧化酶的關(guān)系[J]. 西北植物學報，2009，29(8)：1 607-1 613.

ZHANG C，WANG G D. Soluble substance and antioxidase activities changes during protocorm-like body morphogenesis inOncidium[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica，2009，29(8)：1 607-1 613.

[18]ALONI R. Foliar and axial aspects of vascular differentiation：Hypotheses and evidence[J].JournalofPlantGrowthRegulator，2001，20：22-34.

[19]YE Z H. Vascular tissue differentiation and pattern formation in plants[J].AnnualReviewofPlantBiology，2002，53：183-202.

[20]BLILOU I，XU J，WILDWATER M，etal. The PIN auxin efflux facilitatior network controls growth and patterning inArabidopsisroots[J].Nature，2005，433：39-44.

[21]GRUNEWALD W，F(xiàn)RIML J. The march of the PINs：developmental plasticity by dynamic polar targeting in plant cells[J].TheEuropeanMolecularBiologyOrganizationJournal，2010，29(16)：2 700-2 714.

[22]IMIN N，NIZAMIDIN M，WU T，etal. Factors involved in root formation inMedicagotruncatula[J].JournalofExperimentalBotany，2007，58(3)：439-451.

[23]張建甫，田傳衛(wèi)，畢玲，等. 狗薔薇類根體和類原球莖發(fā)生發(fā)育的組織學研究[J]. 園藝學報，2014，41(6)：1 167-1 174.

ZHANG J F，TIAN C W，BI L，etal. Studies on the histology and ultrastructure of the initiation of rhizoids and protocorm-like bodies(PLBs)induced from the leaf explants ofRosacanina[J].ActaHorticulturaeSinica，2014，41(6)：1 167-1 174.

[24]IOIO R D，LINHARES F S，SCACCHI E，etal. Cytokinins determineArabidopsisroot-meristem size by controlling cell differentiation[J].CurrentBiology，2007，17(8)：678-682.

[25]SU Y H，LIU Y B，ZHANG X S. Auxin-cytokinin interaction regulates meristem development[J].MolecularPlant，2011，4(4)：616-625.

[26]ROBERTS L W，GAHAN P B，ALONI R. Hormonal aspects of vascular differentiation. Vascular differentiation and plant growth regulators[M]. Berlin：Springer-Verlag，1988.

[27]NELSON N D，HILLIS W E. Ethylene and tension wood formation inEucalyptusgomphocephala[J].WoodScienceandTechnology，1978，12(4)：309-315.

[28]VICTOR J M R，MURCH S J，KRISHNARAJ S，etal. Somatic embryogenesis and organogenesis in peanut：the role of thidiazuron and N6-benzylaminopurine in the induction of plant morphogenesis[J].PlantGrowthRegulation，1999，28：9-15.

[29]MURTHY B N S，MURCH S J，SAXENA P K. Thidiazuron：a potent regulator ofinvitroplant morphogenesis[J].InvitroCellular&DevelopmentalBiology-Plant，1998，34：267-275.

[30]CHHABRA G，CHAUDHARY D，VARMA M，etal. TDZ-induced direct shoot organogenesis and somatic embryogenesis on cotyledonary node explants of lentil(LensculinarisMedik.) [J].PhysiologyandMolecularBiologyofPlants，2008，14：347-353.

[31]RADHAKRISHNAN R，RAMACHANDRAN A，RANJITHA KUMARI B D. Rooting and shooting：Dual function of thidiazuroninvitroregeneration of soybean(Glycinemax. L)[J].ActaPhysiologiaePlantarum，2009，31：1 213-1 217.

[32]SINGH N D，SAHOO L，SARIN N B，etal. The effect of TDZ on organogenesis and somatic embryogenesis in pigeonpea(CajanuscajanL. Millsp)[J].PlantScience，2003，164：341-347.

(編輯:宋亞珍)

Role of Vascular Tissue of Rhizoids for Protocorm-like Bodies Regeneration inRosacanina

LIU Fengluan1,2, MIN Jie2, CHEN Qing2, TIAN Daike2, ZHAO Liangjun1*

(1 College of Horticulture，China Agricultural University，Beijing 100193，China；2 Shanghai Key Laboratory of Plant Functional Genomics and Resources，Shanghai Chenshan Plant Science Research Center，the Chienese Academy of Science，Shanghai Chenshan Botanical Garden，Shanghai 201602，China)

Protocorm-like bodies (PLBs) regeneration system has been established for severalRosaspp. More understandings on the process of PLBs formation, including what roles of vascular tissue of rhizoids play in the incipient stage, will contribute to the establishment of PLBs protocols in cut roses. We proposed a hypothesis named ‘vascular channel’: Through the vascular tissue inR.caninarhizoids, high concentration of TDZ (thidiazuron) containing in medium was quickly and largely transported to rhizoid meristem, resulting in the rhizoid meristem cells shifting their functions, which initiated PLBs development. In the present study, we provided some evidence on the rationality of this hypothesis. Both whole callus-free rhizoids and its segments were cultured either vertically or horizontally on the induction medium with TDZ, no PLBs formed. During the bridging culture, the efficiency of PLBs induction was higher in the callus-rhizoids relied on apoplastic transport than symplastic transport. The TIBA (2, 3, 5-triiodobenzoic acid) treatment had suppressed the elongation of vascular tissue towards to the rhizoid meristem, which finally led to a low rate of PLBs formation. Furthermore, the partial process of PLBs system was reproduced inMedicagotruncatulaGaertn., their rhizoid tips derived from the rhizoid segment were induced into green ellipsoidal bodies. These findings indicated that the vascular tissue ofR.caninacallus - rhizoids being capable of rapidly delivering nutrients and hormones was critical for PLBs development, and it must be closed and complete from the callus to the rhizoid tip. Based on this, we proposed that the prerequisite for achieving a PLBs system of cut roses is to induce callus-rhizoids or similar explants possessing a transporting system that could rapidly aggregate hormones and nutrients.

Rosacanina；protocorm-like body；vascular tissue；Rosa；TDZ

1000-4025(2016)09-1764-08doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.09.1764

2016-06-04;修改稿收到日期:2016-07-26

國家自然科學基金(NSFC 31171993)

劉鳳欒(1984-)，男，博士，助理研究員，主要從事園林植物遺傳育種與花發(fā)育的研究。E-mial：19liu19@163.com

趙梁軍，教授，博士生導師，從事園林植物栽培生理與分子生物學研究。E-mail：zhaolj5073@sina.com

Q813.1+3; Q944.5

A