手十二井穴刺絡(luò)放血對(duì)急性一氧化碳中毒意識(shí)障礙大鼠促醒作用及其機(jī)制的研究*

岳　穎　金　軍劉建衛(wèi)　劉　亮　劉文淑　馮　宇　郭　義*

手十二井穴刺絡(luò)放血對(duì)急性一氧化碳中毒意識(shí)障礙大鼠促醒作用及其機(jī)制的研究*

岳穎①金軍②劉建衛(wèi)③劉亮④劉文淑④馮宇④郭義④*

目的：觀察探討手十二井穴刺絡(luò)放血對(duì)急性一氧化碳中毒大鼠意識(shí)狀態(tài)、靜脈血中碳氧血紅蛋白（COHb）濃度及腦組織中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性的影響。方法：選用成年雄性SD大鼠30只，將其隨機(jī)分為正常組、模型組及治療組3組，每組10只。于大鼠染毒前、染毒后即刻、染毒后1 h及4 h，觀測(cè)大鼠意識(shí)狀態(tài)，分別取大鼠尾靜脈血檢測(cè)COHb濃度，4 h后取腦組織，進(jìn)行GSH-Px活性檢測(cè)。結(jié)果：手十二井穴刺絡(luò)放血可以改善急性一氧化碳中毒大鼠的意識(shí)狀態(tài)，縮短昏迷時(shí)間；染毒后1 h和染毒后4 h，治療組大鼠靜脈血中COHb濃度明顯低于模型組，三組比較均有差異（F=10.640，F(xiàn)=4.401；P＜0.05）。染毒后4 h，治療組大鼠腦組織中GSH-Px活性明顯高于模型組，三組比較均有差異（F=17.626，P＜0.05）。結(jié)論：手十二井穴刺絡(luò)放血對(duì)急性一氧化碳中毒大鼠具有腦保護(hù)作用。

急性一氧化碳中毒；井穴放血；碳氧血紅蛋白；谷胱甘肽過氧化物酶

［First-author’s address］ Department of Clinical and Practical Teaching， Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 300193， China.

一氧化碳（CO）為一種無(wú)色、無(wú)味的氣體，是最常見的引起中毒性死亡的氣體，可以引起多臟器損害［1］。約有50%的存活者在CO中毒后的3 d到4周內(nèi)會(huì)發(fā)生急性一氧化碳中毒（acute carbon monoxide poisoning，ACOP）遲發(fā)性腦病。ACOP在許多國(guó)家引起意外生活性中毒及職業(yè)性中毒的疾病中，是發(fā)病率和病死人數(shù)最多的中毒，其病死人數(shù)在我國(guó)各種急性中毒中高居首位［2-3］。本研究在前期工作中發(fā)現(xiàn)，手十二井穴刺絡(luò)放血可以改善ACOP患者的意識(shí)狀態(tài)［4］。因此，本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步拓展研究范圍，探討和評(píng)價(jià)手十二井穴刺絡(luò)放血的促醒作用及其部分機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇30只健康成年雄性Wistar大鼠，3月齡，體重為180～220 g；自由飲水，在相對(duì)濕度50%～55%、溫度20～22 ℃及自然照明的環(huán)境中飼養(yǎng)備用。大鼠于染毒前1 d禁食不禁水，觀察7 d，大鼠健康情況良好，進(jìn)行染毒實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用均符合國(guó)際動(dòng)物倫理法案的要求。

1.2設(shè)備與試劑

（1）自制染毒裝置。染毒裝制為一有機(jī)玻璃艙，其容積約90 L，染毒前用CO標(biāo)準(zhǔn)氣體（4000 ppm）吹掃，下端一側(cè)有出氣口，其對(duì)側(cè)上端有一進(jìn)氣口，尾氣以氨性氯化鈣回收。罐底預(yù)先放置堿石灰以吸收大鼠呼出的二氧化碳?xì)怏w。

（2）儀器與試劑。采用722分光光度計(jì)（上海儀器有限公司），CO標(biāo)準(zhǔn)氣體氣相色譜分析（天津盛唐特種氣體責(zé)任有限公司），谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒（南京建成）。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及建模

參照Ishchiropoulos的方法［5］將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)編號(hào)分為：正常組（10只）、模型組（10只）、治療組（10只）。正常組：大鼠在罐內(nèi)靜式吸入空氣60 min；模型組：大鼠在罐內(nèi)靜式吸入含CO濃度為4000 ppm的空氣60 min；治療組：同模型組。

1.4靜脈血COHb濃度及GSH-Px活性檢測(cè)

1.4.1靜脈血中COHb濃度檢測(cè)

檢測(cè)方法：①制備CO飽和液，分別吸取20倍稀釋的患者血液各0.5 ml于2只試管中，1支試管加飽和一氧化碳液4.5 ml，另1支試管加雙蒸水4.5 ml，室溫放置10 min，用722分光光度計(jì)，波長(zhǎng)419 nm，1 cm比色杯比色，根據(jù)吸光度計(jì)算出血液COHb含量；②選穴，位于大鼠的雙側(cè)前肢趾端的十二井穴，每側(cè)刺六個(gè)井穴（井穴定位方法采用比較解剖學(xué)方法選取）。

（1）正常組。不通入一氧化碳?xì)怏w，進(jìn)氣口和出氣口與外界空氣相通，大鼠置于空的染毒罐中，于1 h、4 h取大鼠尾靜脈血檢測(cè)。

（2）治療組。從染毒罐取出后，立刻用刺血針在以上各井穴進(jìn)行點(diǎn)刺放血，出血量每穴一滴為宜。于1 h、4 h取大鼠尾靜脈血檢測(cè)。

（3）模型組。從染毒罐取出后，置于空氣中，于1 h、4 h取大鼠尾靜脈血檢測(cè)。

1.4.2腦組織中GSH-Px活性檢測(cè)

從染毒罐中取出4 h后，對(duì)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行固定并取腦。大鼠采取俯臥位，從枕后部沿顱頂正中線直至鼻尖部位，切開大鼠的頭皮，使大鼠顱骨暴露。然后沿正中線向前剪開至后囟，再沿正中線剪開至前囟，慢慢打開顱腔，暴露大鼠的腦組織，然后將腦膜、血管剪除。取出鼠腦，將其分別放置于低溫下，取冰生理鹽水按1∶4（W∶V）制備成20%勻漿，于-78℃低溫保存。測(cè)定時(shí)選取2500 r/min，離心10 min，取上清液按試劑盒操作說明操作。

1.5觀察指標(biāo)

（1）觀察大鼠昏迷狀態(tài)。將大鼠意識(shí)狀態(tài)分為6級(jí)，其Ⅴ、Ⅵ級(jí)被認(rèn)為是昏迷狀態(tài)。死亡的大鼠即予棄去［6］。

（2）檢測(cè)大鼠靜脈血中碳氧血紅蛋白（carboxyhemoglobin，COHb）濃度和腦組織中GSH-Px活性。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，采用one-way ANOVA統(tǒng)計(jì)方法，組間比較選用LCD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（1）治療組大鼠意識(shí)狀態(tài)得到明顯改善，昏迷時(shí)間極大縮短，且治療組明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.422，P＜0.05），見表1。

表1　模型組與治療組大鼠促醒時(shí)間（x-±s）

（2）3組大鼠染毒后1 h、染毒后4 h，治療組大鼠尾靜脈血中COHb濃度均明顯低于模型組，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.640，F(xiàn)=4.401；P＜0.05）見表2。

（3）3組大鼠染毒后4 h，治療組大鼠腦組織中GSH-Px活性明顯高于模型組，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=17.626，P＜0.05），見表3。

表3　各組大鼠腦組織內(nèi)GSH-Px活性（μmol/mg Pr·min， x-±s）

3　討論

3.1COHb濃度測(cè)定

進(jìn)入人體的CO大量與血紅蛋白結(jié)合而形成難以解離的COHb，其不僅妨礙氧與Hb的結(jié)合，而且抑制了氧的解離，從而造成全身組織嚴(yán)重缺氧，進(jìn)而造成低氧血癥的出現(xiàn)［7-8］。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)缺氧最為敏感，故腦部最先受累，患者出現(xiàn)昏迷狀態(tài)。此外，有臨床研究報(bào)道［9］：COHb水平越高預(yù)示著一氧化碳中毒病情越重。所以COHb濃度的降低，有助于O2Hb含量的增加，有助于解決組織缺血缺氧，從而保護(hù)機(jī)體重要器官。

本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，染毒后即刻，模型組、治療組COHb濃度明顯高于正常組，且模型組和治療組染毒后即刻COHb濃度無(wú)明顯差異，表明染毒成功，模型組和治療組大鼠中毒程度無(wú)明顯差異。染毒后1 h、4 h模型組COHb濃度仍然明顯高于正常組。染毒后1 h、4 h治療組COHb濃度明顯低于模型組，且染毒后4 h其COHb濃度與正常組無(wú)明顯差異，治療組COHb已經(jīng)趨于正常水平?？梢娛质ù探j(luò)放血可盡快緩解組織缺氧情況，以有效預(yù)防和減輕腦水腫及腦細(xì)胞損傷，從而起到腦保護(hù)作用。

3.2GSH-Px活性測(cè)定

ACOP后再灌注過程中產(chǎn)生大量的自由基，是造成腦組織損傷的主因之一［10］。有研究證實(shí)，CO中毒后腦中過氧化物、氧自由基明顯增加，而GSH-Px等抗氧化酶類明顯減少，會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷，以致細(xì)胞嚴(yán)重受損或死亡［11］。有研究證實(shí)，GSH-Px在ACOP腦損傷中發(fā)揮重要作用，是至今在CO引起諸多效應(yīng)指標(biāo)中，早期最為敏感的指標(biāo)之一［12］。

本研究結(jié)果表明，染毒后模型組和治療組腦組織中GSH-Px活性比正常組顯著增高，這符合ACOP早期，大鼠腦組織GSH-Px活性增高這一結(jié)論。因此，在ACOP后即刻給予手十二井穴刺絡(luò)放血治療可以提高腦組織GSH-Px活性，對(duì)氧自由基的清除能力增強(qiáng)，減少腦組織中過氧化物代謝產(chǎn)物的形成，從而起到腦保護(hù)作用。因此，在ACOP早期，予以手十二井穴刺絡(luò)放血法，可以減輕自由基氧化損傷，從而保護(hù)腦細(xì)胞。

3.3意識(shí)狀態(tài)改變

中醫(yī)認(rèn)為“諸陽(yáng)之會(huì)”和“腦為髓?！?，ACOP后必?fù)p元陽(yáng)，針刺可起到促醒作用，故采用疏通經(jīng)絡(luò)、開竅醒神及行氣活血的治則。本研究觀察到，治療組大鼠的促醒時(shí)間明顯低于模型組，表明手十二井穴進(jìn)行刺絡(luò)放血治療能改善大腦的血液循環(huán)，提升含氧量，提高腦細(xì)胞活性，起到促醒作用。

4　結(jié)語(yǔ)

本研究發(fā)現(xiàn)，在ACOP早期，予以手十二井穴刺絡(luò)放血法，可盡快改善中毒后意識(shí)障礙大鼠的意識(shí)狀態(tài)，起到促醒作用，可使大鼠靜脈血中COHb濃度迅速下降，從而盡快緩解組織缺氧情況，以有效預(yù)防和減輕腦水腫及腦細(xì)胞損傷，可以減輕自由基氧化損傷，從而起到腦保護(hù)作用。手十二井穴刺絡(luò)放血療法是一種簡(jiǎn)單、方便、有效且經(jīng)濟(jì)的院前急救ACOP措施，此法可為院前急救的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

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Study on the mechanism of promoting awakening of twelve well points of the hand pricking blood therapy on acute carbon monoxide poisoning consciousness disorder rats

YUE Ying，JIN Jun， LIU Jian-wei， et al// China Medical Equipment，2016，13（10）:125-127.

Objective: To observe the effect of needling hand twelve wells phlebotomy poisoning glutathione peroxidase activity of rat consciousness， venous blood carboxyhemoglobin concentration and brain tissue of acute carbon monoxide. Methods: A total of 30 adult male SD rats were randomly divided into normal group， model group and treatment group， with 10 rats in each group. In rats exposed before and immediately exposed after 1 hour and 4 hours， we observed the state of consciousness of rats and tested venous blood carboxyhemoglobin contents. The brain tissue was taken out after 4 hours， to detect glutathione peroxidase activity. Results: Twelve well points of the hand pricking blood in rats with acute carbon monoxide poisoning can improve the state of consciousness and shorten the duration of coma. After exposed for 1 hour and 4 hours， carboxyhemoglobin concentration in rat tail vein blood in the treatment group was significantly higher than that in the model group. The glutathione peroxidase activity in the brain tissue of the treatment group was significantly higher than that of the model group after exposed for 4 hours. Conclusion: Twelve well points of the hand bloodletting has protective effect on brain of rats with acute carbon monoxide poisoning coma.

Acute carbon monoxide poisoning； Blood-letting puncture at Jing-points； Carboxyhemoglobin； Glutathione peroxidase

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2016.10.037

1672-8270（2016）10-0125-03

R246

A

2016-08-09

國(guó)家自然科學(xué)基金（81303023）“基于p38信號(hào)通路的井穴放血法對(duì)急性一氧化碳中毒的腦保護(hù)作用機(jī)制研究”；天津市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（08JCYBJC27700）“手十二井穴刺絡(luò)放血急救煤氣中毒的臨床與實(shí)驗(yàn)研究”

①天津中醫(yī)藥大學(xué)臨床實(shí)訓(xùn)教學(xué)部 天津 300193

③天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 天津 300193

②天津中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)際教育學(xué)院 天津 300193

④天津中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院 天津 300193

guoyi_168@163.com

岳穎，女，（1980- ），博士研究生。天津中醫(yī)藥大學(xué)臨床實(shí)訓(xùn)教學(xué)部，研究方向：井穴刺絡(luò)放血。