益生菌干預(yù)對芽囊原蟲感染大鼠血清IL-4、IL-10、IL-12和IL-17的影響*

李小波，黃彬紅，李　娟，宋　濤，鄧　婷

(贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西　贛州　341000)

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益生菌干預(yù)對芽囊原蟲感染大鼠血清IL-4、IL-10、IL-12和IL-17的影響*

李小波，黃彬紅，李娟，宋濤，鄧婷

(贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西贛州341000)

目的:研究益生菌干預(yù)對芽囊原蟲感染大鼠外周血IL-4、IL-10、IL-12和IL-17的影響，探討益生菌、芽囊原蟲感染和腸道菌群失調(diào)三者的關(guān)系。方法:48只雄性SD大鼠按三因素(益生菌干預(yù)、芽囊原蟲感染和腸道菌群失調(diào))兩水平(0、1)隨機分為8組。取芽囊原蟲包囊液103·只-1灌胃，連續(xù)5 d，建立感染模型。用鹽酸克林霉素以5 000 mg·kg-1灌胃，連續(xù)5 d，建立腸道菌群失調(diào)模型。芽囊原蟲感染合并菌群失調(diào)模型在感染模型建立后用鹽酸克林霉素建立。建模后1 d，金雙歧2 g·d-1經(jīng)口飼喂，共7 d。ELISA法檢測大鼠血清IL-4、IL-10、IL-12和IL-17水平。結(jié)果:益生菌干預(yù)、芽囊原蟲感染對IL-4和IL-10水平的影響均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且益生菌干預(yù)與芽囊原蟲感染之間存在交互作用(P<0.05)。益生菌干預(yù)、菌群失調(diào)對IL-12水平的影響有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，益生菌干預(yù)與芽囊原蟲感染，益生菌干預(yù)與菌群失調(diào)之間存在交互作用(P<0.05)。各組間IL-17水平未見顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論:芽囊原蟲感染增高大鼠外周血IL-4、IL-10水平，菌群失調(diào)增高IL-12水平，合并芽囊蟲感染IL-12水平較之降低，益生菌干預(yù)可改善這些細胞因子的水平。

益生菌干預(yù)；芽囊原蟲感染；腸道菌群失調(diào)；IL-4；IL-10；IL-12；IL-17

芽囊原蟲是寄居于人類、哺乳動物、鳥類、鼠類及爬行動物類等腸道的原生動物，在發(fā)達國家感染率約3%～5%，發(fā)展中國家感染率約為60%左右[1]。許多腸道癥狀與皮膚疾患都與芽囊原蟲感染有關(guān)[2]。芽囊原蟲感染最普遍的腸道癥狀為腹瀉與腹痛，非特異性癥狀有惡心、嘔吐、脹氣等[2]，但其致病機制尚不清楚。

Th1/Th2失衡是感染性疾病的特征之一，在胞內(nèi)菌、胞內(nèi)原蟲和病毒感染中表現(xiàn)為Th1偏移，寄生蠕蟲感染表現(xiàn)為Th2偏移。芽囊原蟲感染引起Th偏移的相關(guān)研究不多，結(jié)果也各有側(cè)重[3-4]，實驗所用蟲株不同，及體內(nèi)實驗存在腸道菌群可能是結(jié)果不一致的原因。芽囊原蟲棲居腸道，腸道中存在著大量正常菌群，芽囊原蟲與腸道菌群之間是如何相互影響的？為此，本文研究益生菌干預(yù)對芽囊原蟲感染大鼠外周血IL-4、IL-10、IL-12和IL-17的影響，探討益生菌、芽囊原蟲感染和腸道菌群失調(diào)三者的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1主要實驗試劑及儀器IL-4、IL-10、IL-12和IL-17 ELISA試劑盒(Cloud-Clone公司)；鹽酸克林霉素膠囊(0.15 g×24 s，哈藥集團三精黑河藥業(yè)有限公司)；雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片(0.5 g×24 s，內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司，含長型雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌)；多功能酶標儀Varioskan Flash(Thermo公司)。

1.2蟲株與包囊收集本實驗使用蟲株編號為HC07-12(ST1)，分離自贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腹瀉就診患者。此蟲株在實驗室保種傳代，將人芽囊原蟲LES培養(yǎng)基中的滋養(yǎng)體經(jīng)初步離心后接種至成囊培養(yǎng)基，到第6天包囊成熟的高峰期用淋巴細胞分離液分離成囊培養(yǎng)基中的包囊。包囊經(jīng)蒸餾水處理并貯于4 ℃保存，備用。

1.3動物分組及實驗設(shè)計SPF級SD大鼠48只，雄性，體重(100±10) g，各組大鼠體重統(tǒng)計學(xué)比較無顯著性差異(P>0.05)。按三因素(芽囊原蟲感染、腸道菌群失調(diào)和益生菌干預(yù))二水平(有和無)設(shè)計隨機分為8組。

1.4動物模型建立與益生菌干預(yù)取芽囊原蟲包囊液以103·mL-1濃度1 mL·只-1經(jīng)口灌胃給接受芽囊原蟲感染的大鼠，連續(xù)5 d，建立芽囊原蟲感染模型。每日檢查大鼠糞便，糞便中連續(xù)一星期檢出人芽囊原蟲空泡期或者包囊，視為感染成功。接受菌群失調(diào)處理組大鼠用鹽酸克林霉素灌胃，劑量5 000 mg·kg-1，連續(xù)5 d，大鼠出現(xiàn)腹瀉，排便次數(shù)明顯增多，且糞便呈稀水樣改變，達到抗生素脫污染菌群失調(diào)的程度，視為建模成功。芽囊原蟲感染合并菌群失調(diào)在芽囊原蟲感染后用鹽酸克林霉素灌胃，劑量與時間同菌群失調(diào)組，其余各組用等量生理鹽水平行操作。實驗第13天金雙歧2 g·d-1經(jīng)口飼喂益生菌干預(yù)組大鼠，共7天，其余組平行飼喂等量滅菌生理鹽水。

1.5標本采集實驗20天，各組大鼠禁食24 h，禁水12 h，稱重，10%水合氯醛按0.3 mL·100 g-1大鼠的標準腹腔注射。將已麻醉好的大鼠四肢固定，心臟采血3～5 mL，分離血清， ELISA 法檢測大鼠血清 IL-4、IL-10、IL-12和IL-17水平。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件進行三因素兩水平方差分析。

2　結(jié)　果

各組大鼠血清IL-4、IL-10、IL-12和IL-17水平見表1。

2.1益生菌干預(yù)、芽囊原蟲感染和腸道菌群失調(diào)對大鼠血清IL-4水平的影響經(jīng)三因素兩水平方差分析，益生菌干預(yù)、芽囊原蟲感染、腸道菌群失調(diào)對大鼠血清IL-4水平的影響均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且益生菌干預(yù)與芽囊原蟲感染之間存在交互作用(P<0.05)，見圖1，即益生菌干預(yù)可拮抗芽囊原蟲感染導(dǎo)致的IL-4水平增高。

圖1表明:沒有益生菌干預(yù)大鼠在感染芽囊原蟲后血清IL-4水平增高，進行益生菌干預(yù)后IL-4水平顯著下降，益生菌干預(yù)與芽囊原蟲感染之間有交互作用。

表1　各組大鼠血清IL-4、IL-10、IL-12、IL-17水平/pg·mL-1

圖1　益生菌干預(yù)與芽囊原蟲感染對大鼠血清IL-4水平的影響

2.2益生菌干預(yù)、芽囊原蟲感染和腸道菌群失調(diào)對大鼠血清IL-10水平的影響經(jīng)三因素兩水平方差分析，益生菌干預(yù)、芽囊原蟲感染、腸道菌群失調(diào)對大鼠血清IL-10水平的影響均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且益生菌干預(yù)與芽囊原蟲感染之間存在交互作用(P<0.05)，見圖2，即益生菌干預(yù)可拮抗芽囊原蟲感染導(dǎo)致的IL-10水平增高。

圖2　益生菌干預(yù)與芽囊原蟲感染對大鼠血清IL-10水平的影響

圖2表明：沒有益生菌干預(yù)大鼠在感染芽囊原蟲后血清IL-10水平增高，進行益生菌干預(yù)后IL-10水平顯著下降，益生菌干預(yù)與芽囊原蟲感染之間有交互作用。

2.3益生菌干預(yù)、芽囊原蟲感染和腸道菌群失調(diào)對大鼠血清IL-12水平的影響經(jīng)三因素兩水平方差分析，益生菌干預(yù)、菌群失調(diào)對IL-12水平的影響有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，益生菌干預(yù)與芽囊原蟲感染，益生菌干預(yù)與菌群失調(diào)，存在交互作用(P<0.05)，見圖3和圖4。

圖3表明：芽囊原蟲感染后IL-12水平較對照組增高，腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致IL-12水平較對照組急劇增高，但芽囊原蟲合并腸道菌群失調(diào)組大鼠IL-12水平較腸道菌群失調(diào)組低，兩線有交叉，說明兩者有交互作用，即芽囊原蟲感染可部分拮抗腸道菌群失調(diào)造成的IL-12水平增高。

圖4表明：腸道菌群失調(diào)造成IL-12水平顯著增高，益生菌干預(yù)可改善此種改變。

圖3　芽囊原蟲感染與腸道菌群失調(diào)對大鼠血清IL-12水平的影響

圖4　益生菌干預(yù)與腸道菌群失調(diào)對大鼠血清IL-12水平的影響

2.4益生菌干預(yù)、芽囊原蟲感染和腸道菌群失調(diào)對大鼠血清IL-17水平的影響經(jīng)三因素兩水平方差分析，芽囊原蟲感染與菌群失調(diào)均導(dǎo)致IL-17水平增高，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3　討　論

由于芽囊原蟲分布廣泛，感染率高，不僅存在于有癥狀人群中，在健康或無癥狀人群中也有分布[1]。盡管許多研究者致力于芽囊原蟲的致病性研究，但至今仍有爭議。

有報道認為芽囊原蟲感染發(fā)生的病理生理學(xué)改變是由于觸發(fā)炎癥細胞因子應(yīng)答及核轉(zhuǎn)錄因子基因表達[4-5]。Iguchi等[3]報道芽囊原蟲分離株RN94-9感染大鼠誘導(dǎo)杯狀細胞輕度增生，Th1型前炎癥細胞因子顯著上調(diào)。但有體外研究結(jié)果與之不符[3-4]，他們證明暴露于有癥狀芽囊原蟲抗原的HCT116表達Th1型和Th2型細胞因子上調(diào)，提示細胞與體液免疫均被激活，但以Th2型細胞因子為主。本文研究結(jié)果表明芽囊原蟲ST1株感染導(dǎo)致Th2型細胞因子IL-4增高，可能IL-4通過T細胞非依賴方式導(dǎo)致芽囊原蟲感染的結(jié)腸癥狀，如腹瀉、腹脹和腹痛等。同時抑制性細胞因子IL-10水平也增高，接受雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片干預(yù)后可以改善這種狀況，Th1型細胞因子IL-12和Th17型細胞因子IL-17雖有增高的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義?？股匾鸬哪c道菌群失調(diào)組大鼠IL-12水平增高，芽囊原蟲感染和益生菌干預(yù)均可降低增高的幅度?？赡苁怯捎谘磕以x感染導(dǎo)致抑制性細胞因子增高，促使TH0向Th2分化，從而部分拮抗了腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致的Th1型細胞因子IL-12增高。Céline Nourrisson等研究[6]發(fā)現(xiàn)芽囊原蟲感染導(dǎo)致雙歧桿菌明顯減少。我們使用雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片干預(yù)芽囊原蟲感染大鼠后改善了IL-4和IL-10的水平，可能是增加了感染大鼠腸道雙歧桿菌數(shù)量的原因。

[1]Tan.New insights on classification,identification, and clinical relevance of Blastocystis spp[J].Clin Microbiol Rev,2008,21(4):639-65.

[2]Balint A,Doczi I,Bereczki L,et al.Do not forget the stool examination!-cutaneous and gastrointestinal manifestations of Blastocystis sp. infection[J].Parasitol Res，2014,113(4):1585-1590.

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[5]Bartlomiej Swiatczak and Maria Rescigno.How the interplay between antigen presenting cells and microbiota tunes host immune responses in the gut[J].Semin Immunol,2012,24(1):43-49.

[6]Céline Nourrisson,Julien Scanzi,Bruno Pereira,et al.Blastocystis is associated with decrease of fecal microbiota protective bacteria:comparative analysis between patients with irritable bowel syndrome and control subjects[J].PLoS One,2014,9(11):e111868.

Impact of Probiotics on the Levels of Serum Cytokine IL-4, IL-10,IL-12 and IL-17 afterBlastocystishominisInfection in Rats

LIXiao-bo,HUANGBing-hong,LIJuan,SONGTao,DENGTing

(SchoolofBasicMedicines,GannanMedicalUniversity,GanzhouJiangxi341000)

Objective: To investigate the impact of probiotics on the levels of serum cytokine IL-4、IL-10、IL-12 and IL-17 afterBlastocystishominisinfection in rats, and to explore the interaction among probiotics,B.hominisinfection, and intestinal dysbiosis. Methods:Fourty-eight SD rats were randomly assigned to 8 groups according to factorial design with three factors (probiotics,B.hominisinfection, and intestinal dysbiosis) and two levels (0 and 1). The rats in infection groups orally received 103/dayB.hominiscysts for 5 days. The rats in intestinal dysbiosis groups were orally given 5 000 mg·kg-1lincomycin hydrochloride for 5 days. The rats in mix model groups were infected withB.hominisat first 5 days and then were fed with lincomycin hydrochloride for another 5 days. The probiotics groups were fed with 2 g·d-1golden bifidobacteriums tablets for 7 days after mix models were set up. The levels of serum cytokine IL-4,IL-10,IL-12,and IL-17 were detected by ELISA. Results:Both probiotics andB.hominisinfection significantly affect the levels of serum cytokine IL-4 and IL-10(P<0.05), and there is interaction between probiotics andB.hominisinfection (P<0.05). Both probiotics and intestinal dysbiosis have significant impact on the level of serum cytokine IL-12(P<0.05),and there is interaction between probiotics and intestinal dysbiosis (P<0.05).There is no significant difference in serum IL-17 level among all groups (P>0.05).Conclusion:B.hominisinfection results in increased serum IL-4 and IL-10 levels, and intestinal dysbiosis lead to increased serum IL-12 level. However,B.hominisinfection could counteract the effect of intestinal dysbiosis in terms of IL-12 level and probiotics could balance the levels of cytokine IL-4,IL-10,and IL-12.

Probiotics;Blastocystishominisinfection; Intestinal dysbiosis; IL-4;IL-10;IL-12

江西省自然科學(xué)基金資助(20132BAB205051);江西省教育廳科學(xué)技術(shù)項目(GJJ13684)

李娟，女，副教授，主要從事消化道病原體與抗感染免疫研究。E-mail：lily_lij@163.com

R382.9

A

1001-5779(2016)04-0547-04

10.3969/j.issn.1001-5779.2016.04.013

2016-03-08)(責任編輯：敖慧斌)