化痰法結(jié)合補(bǔ)氣、活血法促進(jìn)肝星狀細(xì)胞系HSC-T6凋亡的實(shí)驗(yàn)研究*

宋春花，張志花，陳　濤，黃志華，常欣峰，尹　寶，陳薈瀛，周海倩，韓立民

(1.贛南醫(yī)學(xué)院 a.第一附屬醫(yī)院，江西　贛州　341000;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南　長(zhǎng)沙　410007)

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化痰法結(jié)合補(bǔ)氣、活血法促進(jìn)肝星狀細(xì)胞系HSC-T6凋亡的實(shí)驗(yàn)研究*

宋春花1a，張志花1，陳濤1，黃志華1，常欣峰1，尹寶2，陳薈瀛1，周海倩1，韓立民1

(1.贛南醫(yī)學(xué)院 a.第一附屬醫(yī)院，江西贛州341000;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410007)

目的：觀察化痰法結(jié)合補(bǔ)氣、活血法對(duì)肝星狀細(xì)胞系HSC-T6生長(zhǎng)的抑制作用及對(duì)相關(guān)凋亡蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)的影響。方法：制備相關(guān)化痰法藥物血清，采用MTT法檢測(cè)各組含藥血清對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖的影響；AnnexinⅤ/PI雙染法，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率；Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：MTT結(jié)果表明化痰法結(jié)合補(bǔ)氣、活血法可有效抑制肝星狀細(xì)胞HSC-T6的增殖；AnnexinⅤ/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明化痰法結(jié)合補(bǔ)氣、活血法可以促進(jìn)HSC-T6細(xì)胞凋亡；Western blot 結(jié)果顯示化痰法結(jié)合補(bǔ)氣、活血法能降低細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，且Bcl-2/Bax明顯下降。結(jié)論：化痰法結(jié)合補(bǔ)氣、活血法可通過(guò)抑制Bcl-2蛋白表達(dá)、促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抗肝纖維化作用。

肝纖維化；化痰法；HSC-T6；Bcl-2；Bax

肝纖維化是指由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，導(dǎo)致肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉淀的病理過(guò)程。肝纖維化是肝硬化的必經(jīng)階段，并與肝癌有關(guān)。因此治療肝纖維化對(duì)于預(yù)防肝硬化、肝癌有著十分重要的意義。中醫(yī)認(rèn)為，“痰瘀阻絡(luò)、正氣不足”是肝纖維化的基本病機(jī)，抗肝纖維化的中醫(yī)藥研究就是以其基本病機(jī)作為指導(dǎo)，然而既往的研究多從“活血化瘀”和“扶養(yǎng)正氣”方面展開(kāi)，從“化痰”角度開(kāi)展的研究鮮有報(bào)道，有必要對(duì)其進(jìn)行探索研究。為此，我們選取了化痰藥物白芥子結(jié)合補(bǔ)氣藥物黃芪、活血藥物丹參，制備相應(yīng)含藥血清，觀察其對(duì)肝星狀細(xì)胞系HSC-T6的影響并探討作用機(jī)制。

1　材　料

1.1動(dòng)物及細(xì)胞株雄性Wistar大鼠，清潔Ⅱ級(jí)，體重(150±30) g，購(gòu)自贛南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6購(gòu)自上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所，贛南醫(yī)學(xué)院科研中心傳代培養(yǎng)。

1.2藥品和試劑胎牛血清(Gibco，10099-141)、0.25%胰酶(Gibco，25200-056)、MTT Formazan(Sigma，M2003-1G)、PI Annexin Ⅴ apoptosis detection kit(美國(guó)BD公司，3018688)，Bcl-2抗體(Santa Cruz，Sc-492)、Bax抗體(Santa Cruz，Sc526)、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司(A：Lot#J9122；B：Lot#J8830)。

1.3儀器Ⅱ型水套式CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo)，TS100-F型熒光倒置生物顯微鏡(日本尼康公司)，MK3型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)，BD Calibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)和電泳、轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

2　方　法

2.1各組中藥制備化痰組：白芥子100 g；化痰結(jié)合補(bǔ)氣組：白芥子100 g+黃芪150 g；化痰結(jié)合活血組：白芥子100 g+丹參150 g。以上3組中藥于蒸餾水煮3次，每次煮開(kāi)1 h，沙布過(guò)濾，合液后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至500 mL，即白芥子濃度為：0.2 g·mL-1；丹參及黃芪濃度為：0.3 g·mL-1。大鼠給藥體積為1 mL·100 g-1，即白芥子每次給藥劑量為2.0 g·kg-1，丹參及黃芪每次給藥劑量為3.0 g·kg-1(給藥量參照《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》體表面積劑量換算公式)。

2.2含藥血清制備將80只清潔Ⅱ級(jí)Wistar雄性大鼠隨機(jī)分成4組：A、正常對(duì)照組(Control)；B、化痰法組(白芥子組，B)；C、化痰結(jié)合補(bǔ)氣法組(白芥子+黃芪，BH)；D、化痰結(jié)合活血法(白芥子+丹參，BD)，每組20只。 治療組分別給予相關(guān)藥物灌胃，1 mL·100 g-1，每日2次；正常組給予等劑量生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥4天。于末次給藥1 h后，1.5%的苯巴比妥鈉腹腔注射麻醉，無(wú)菌條件下，腹主動(dòng)脈取血約10 mL，分離血清。將同組大鼠血清混勻，56 ℃，30 min水浴滅活，0.22 μm薄膜濾菌器過(guò)濾，-20 ℃保存。

2.3大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6的復(fù)蘇與培養(yǎng)HSC-T6細(xì)胞株復(fù)蘇，CO2孵箱(5%CO2,37 ℃,95%濕度)傳代培養(yǎng)，3代后用于以下實(shí)驗(yàn)。

2.4MTT法檢測(cè)各組含藥血清對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖的影響待HSC-T6細(xì)胞形成單層，用0.25%胰蛋白酶消化，吹打均勻后加10%NCS的DMEM培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞數(shù)量調(diào)整為2.5×104·mL-1接種至96 孔培養(yǎng)板，每孔200 μL 細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后，分4組(正常血清對(duì)照組，白芥子組，白芥子+黃芪組，白芥子+丹參組)，每組8個(gè)復(fù)孔，棄培養(yǎng)液, 分別加入正常大鼠血清，白芥子大鼠含藥血清，白芥子+丹參大鼠含藥血清，白芥子+黃芪大鼠含藥血清，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，加入0.5%的MTT(5 mg·mL-1)，每孔20 μL，37 ℃作用4 h，棄培養(yǎng)液，加入DMSO (二甲基亞砜) 100 μL，37 ℃、10 min輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)板，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)處的光吸收值，計(jì)算公式：細(xì)胞增殖抑制率=[(對(duì)照孔測(cè)定的平均OD值-用藥組測(cè)定的平均OD值)/對(duì)照孔測(cè)定的平均OD值]×100%。

2.5AnnexinⅤ/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞凋亡取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，常規(guī)消化，制成單細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)并調(diào)整劑量為4×104個(gè)·mL-1接種于60 mm2培養(yǎng)皿中，每皿5 mL(即2×105個(gè)·皿-1)，CO2培養(yǎng)箱(5%CO2,37 ℃, 95%濕度)中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后見(jiàn)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)良好, 棄培養(yǎng)液, 加10%NCS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。48 h后棄培養(yǎng)液，PBS清洗1次，加入200 μL 0.25%胰蛋白酶消化，鏡下觀察消化完全后，加入800 μL 10%NCS的DMEM培養(yǎng)液終止反應(yīng)，重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)。收集細(xì)胞于1.5 mL EP管中，離心(1 000 r·min-1×5 min)，棄上清。PBS液清洗2次，離心(1 000 r·min-1×5 min)，棄上清。取適量AnnexinⅤ Binding Buffer 重懸，計(jì)數(shù)，調(diào)細(xì)胞劑量為1×106個(gè)·mL-1，取40 μL 細(xì)胞(即4×104個(gè))放入離心管中。每管加AnnexinⅤ、PI各2 μL，混合后避光放置15 min，上機(jī)檢測(cè)。

2.6Western Blot法檢測(cè)肝星狀細(xì)胞系HSC-T6細(xì)胞BcI-2、Bax蛋白水平的表達(dá)HSC-T6細(xì)胞經(jīng)各組含藥血清培養(yǎng)48 h后，裂解細(xì)胞，提取蛋白，BCA蛋白檢測(cè)法進(jìn)行蛋白定量。取50 μg蛋白，調(diào)整體積為24 μL，樣品煮沸5 min，冰上放置5 min ，再6 000 r·min-1離心5 min，-80 ℃保存。電泳時(shí)取細(xì)胞蛋白放于沸水中煮5 min后放入冰盒內(nèi)冷卻5 min，4 ℃，6 000轉(zhuǎn)離心5 min，經(jīng)SDS/PAGE凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)移至NC膜，封閉后，一抗4 ℃過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑孵育1 min，超高靈敏度化學(xué)成像系統(tǒng)照相，圖像軟件測(cè)定灰度值。同樣方法測(cè)定內(nèi)參的光密度值，受檢蛋白與相應(yīng)β-actin的光密度值比值為該蛋白的相對(duì)光密度值。各組重復(fù)試驗(yàn)8次，每次以對(duì)照組條帶相對(duì)光密度值為1進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，所得8次數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3　結(jié)　果

3.1各組含藥血清對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖的影響MTT試驗(yàn)結(jié)果表明，加藥培養(yǎng)干預(yù)24 h、48 h、72 h后，各含藥血清組對(duì)HSC-T6細(xì)胞生長(zhǎng)均有一定的抑制作用，其中白芥子+丹參組效果最好。同時(shí)，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡的數(shù)量增多，有時(shí)間依存性。而正常血清組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，各含藥血清組與正常血清對(duì)照組比較有顯著意義(P<0.01)。提示化痰法結(jié)合補(bǔ)氣、活血法可有效抑制肝星狀細(xì)胞系HSC-T6的增殖(見(jiàn)表1)。

表1　各組含藥血清對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖的影響

注：與正常血清組比較，**P<0.01。

3.2各組含藥血清對(duì)HSC-T6細(xì)胞凋亡的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白芥子組、白芥子+黃芪組、白芥子+丹參組細(xì)胞凋亡率分別為：(16.46±1.49)%、(17.57±1.12)%、(19.04±1.43)%，與正常血清對(duì)照組(6.92±0.99)%比較有顯著性差異(P<0.01)，提示化痰法結(jié)合補(bǔ)氣、活血法可以促進(jìn)HSC-T6細(xì)胞凋亡。同時(shí)，白芥子+丹參組與白芥子組比較有差異(P<0.05)，提示化痰結(jié)合活血法效果好于單純化痰法(見(jiàn)圖1～5) 。

3.3各組含藥血清對(duì)相關(guān)凋亡蛋白的影響與正常血清組比較，各含藥血清組中Bcl-2蛋白表達(dá)均降低，Bax蛋白表達(dá)則顯著升高，有明顯差異(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值亦明顯下降(P<0.01)；各治療組之間比較，白芥子組與白芥子+丹參組在Bcl-2蛋白表達(dá)上差異明顯(P<0.05)；而在Bcl-2/Bax比值上，白芥子組與白芥子+黃芪組、白芥子+丹參組亦有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)；各治療組在Bax蛋白表達(dá)上則無(wú)顯著性差異(P>0.05)。提示化痰法結(jié)合補(bǔ)氣、活血法可以通過(guò)降低Bcl-2蛋白表達(dá)，增強(qiáng)Bax蛋白表達(dá)，調(diào)整Bcl-2/Bax比值，促進(jìn)HSC-T6細(xì)胞的凋亡(見(jiàn)圖6、圖7)。

注：與正常血清組比較**P<0.01；與白芥子組比較，#P<0.05。

圖1各組含藥血清對(duì)HSC-T6細(xì)胞凋亡的影響

圖2正常血清組 圖3白芥子組

圖4白芥子+黃芪組 圖5白芥子+丹參組

注：與正常血清組比較*P<0.05，**P<0.01；白芥子組比較，#P<0.05，##P<0.01。

A、正常血清組，B、白芥子組，C、白芥子+黃芪組，D、白芥子+丹參組。

圖7各組含藥血清對(duì)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

4　討　論

肝纖維化是肝細(xì)胞發(fā)生持續(xù)、反復(fù)的壞死或炎癥刺激，大量纖維增生同時(shí)伴有纖維降解的相對(duì)或絕對(duì)不足，細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)在肝內(nèi)大量沉積所致[1-3〗。中醫(yī)認(rèn)為，“痰瘀阻絡(luò)、正氣不足”是本病的基本病機(jī)，并以此為指導(dǎo)，臨床上以“化痰活血、扶養(yǎng)正氣”等為主要治法對(duì)肝纖維化及肝硬化進(jìn)行治療，療效較好。然而，在有關(guān)藥物抗肝纖維化的機(jī)制研究中，多以“活血化瘀”和“扶正”的中藥為主，涉及“化痰”中藥抗肝纖維化的機(jī)制研究鮮有報(bào)道。這表明之前的研究主要是從活血化瘀、扶養(yǎng)正氣等方面展開(kāi)的，對(duì)“化痰法”在治療本病中的作用和機(jī)制研究還不夠重視。這不僅不利于對(duì)本病基本病機(jī)科學(xué)性的全面認(rèn)識(shí)，也在很大程度上阻礙了中醫(yī)藥抗肝纖維化優(yōu)勢(shì)的充分發(fā)揮。因此有必要對(duì)“化痰法”抗肝纖維化的作用及其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究探討。

有關(guān)化痰藥的選用，我們?cè)陂L(zhǎng)期臨床的基礎(chǔ)上，查閱了大量文獻(xiàn)，認(rèn)為“白芥子”是治療肝纖維化的理想化痰藥[4]。白芥子性味“辛溫”， 入肝、脾、肺、胃、心與胞絡(luò)之經(jīng)(《本草新編》)，“味辛能散，性溫能行”，能“通經(jīng)絡(luò)”(《得配本草》)，治脅下及皮里膜外之痰(《本草求真》)，有搜剔宣通之功，又不耗損肺、胃、肝、心之氣，入于氣分而實(shí)宜，即用于血分而亦當(dāng)者也 (《本草新編》)?？梢?jiàn)白芥子為治療右脅下之肝纖維化的“痰濁阻絡(luò)”之不二良藥。同時(shí)由于肝纖維化屬慢性難治性疾病，臨床用藥時(shí)間較長(zhǎng)，選方用藥應(yīng)以“祛邪不傷正”為基本原則，白芥子沒(méi)有半夏、南星的頻用耗氣之弊，且“無(wú)毒，……安五臟，……能消能降，能補(bǔ)能升，助諸補(bǔ)藥，尤善收功”(《得配本草》)。現(xiàn)代研究[5]亦證實(shí)，白芥子能使試驗(yàn)小鼠前列腺組織中VEGF 和bFGF 表達(dá)顯著降低，而VEGF 和bFGF 在肝纖維化中也是表達(dá)增加，是參與肝纖維化的重要細(xì)胞因子。

為此，我們以化痰中藥“白芥子”為載體，通過(guò)其與補(bǔ)氣中藥黃芪、活血中藥丹參相配伍組成“化痰法”，制備含藥血清，對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6生長(zhǎng)進(jìn)行干預(yù)，初步探討“化痰法”抗肝纖維化的主要作用及其初步機(jī)制。試驗(yàn)結(jié)果表明，化痰法結(jié)合補(bǔ)氣、活血法能夠有效抑制HSC-T6細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，化痰法結(jié)合補(bǔ)氣、活血法可以通過(guò)降低細(xì)胞中抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，提高促凋亡蛋白Bax表達(dá)，調(diào)整Bcl-2/Bax比值來(lái)達(dá)到促進(jìn)HSC-T6細(xì)胞凋亡，抗肝纖維化的目的。而化痰法結(jié)合活血法效果優(yōu)于單純化痰法，亦證明早期肝纖維化“痰瘀互阻”的基本病機(jī)理論。

綜上，化痰法結(jié)合補(bǔ)氣、活血法可通過(guò)抑制Bcl-2蛋白表達(dá)、促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抗肝纖維化作用。此結(jié)論深化了中醫(yī)學(xué)對(duì)肝纖維化“痰瘀互阻，正氣不足”基本病機(jī)理論中“痰阻”的認(rèn)識(shí)，為肝纖維化從“痰”論治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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[2]彭岳，吳光，韋燕飛，等.桂郁金提取物對(duì)人肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡影響的研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2011,38(11):2133-2135.

[3]黃艷，黃成，李俊.肝纖維化病程中Kupffer 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子對(duì)肝星狀細(xì)胞活化增殖、凋亡的調(diào)控[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010,26(1):9-13.

[4]鄭保平，姚乃禮.白芥子抗肝纖維化的理論探討[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011, 22(11):2754-2755.

[5]陳密玉. 白芥子提取物對(duì)小鼠前列腺增生組織生長(zhǎng)因子和雄激素受體表達(dá)的影響[D]. 福州：福建師范大學(xué)，2007.

The Method Resolving Phlegm, combined with Invigorating Qi and Promoting Blood Circulation Promotes Apoptosis of Hepatic Stellate Cell Line HSC-T6

SONGChun-hua1,ZHANGZhi-hua2,CHENTao2,HUANGZhi-hua2,CHANGXin-feng2,YingBao3,CHENHui-ying2,ZHOUHai-qian1,HANLi-ming2

(1.TheFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity;2.GannanMedicalUniversity,GanzhouJiangxi341000;3.HunanUniversityofTraditionalChinesemedicine,ChangshaHunan410007)

Objective: To investigate the effect of a method, Resolving Phlegm, combined with Invigorating Qi and Promoting Blood Circulation, on proliferation and on the expression of apoptosis-related protein Bcl-2 and Bax of hepatic stellate cell line HSC-T6. Methods: The sera of Resolving Phlegm related drug were prepared, and MTT method was used to detect the effect of serum with drug on the proliferation of HSC-T6 cells; Annexin V/PI staining, cell cycle and apoptotic rates were tested by flow cytometry. The protein levels of Bcl-2 and Bax were tested by Western-blot. Results: The method, Resolving Phlegm, Combined with Invigorating Qi and Promoting Blood Circulation, can effectively inhibit proliferation of hepatic stellate cell of HSC-T6 (MTT assay), promote HSC-T6 cell apoptosis (Annexin V/PI double staining), reduce the expression of Bcl-2 protein in the cells,increase the expression of Bax protein,and decreased the rate of Bcl-2/Bax(Western-blot). Conclusion: The method, Resolving Phlegm, Combined with Invigorating Qi and Promoting Blood Circulation, protects against liver fibrosis through inhibiting Bcl-2 protein expression and promoting the expression of Bax protein, thus inducing apoptosis of HSC-T6 cells.

Hepatic fibrosis;Resolving Phlegm;HSC-T6;Bcl-2;Bax

國(guó)家自然科學(xué)基金地方項(xiàng)目(81360521)；贛州市指導(dǎo)性科技計(jì)劃項(xiàng)目(GZ2015ZSF308)

韓立民，男，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：jxhlm@163.com

R965

A

1001-5779(2016)04-0543-05

10.3969/j.issn.1001-5779.2016.04.012

2016-04-13)(責(zé)任編輯：敖慧斌)