葉偉標,李 儀,劉 濤,王 珍,李仲均,黃素然
(1.南方醫(yī)科大學附屬東莞人民醫(yī)院,廣東 東莞 523059;2.廣東省人民醫(yī)院,廣東 廣州 510080)
?
miR-155調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路與IgAN腎小管間質(zhì)纖維化的關(guān)系*
葉偉標1,李儀1,劉濤2,王珍1,李仲均1,黃素然1
(1.南方醫(yī)科大學附屬東莞人民醫(yī)院,廣東東莞523059;2.廣東省人民醫(yī)院,廣東廣州510080)
目的:檢測miR-155在IgA腎病(IgAN)中的表達,探討其與患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性及可能作用機制。方法:應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測腎活檢組織中miR-155的表達水平;利用脂質(zhì)體介導miR-155 mimics瞬時轉(zhuǎn)染人腎近曲小管上皮細胞(HK-2),通過RT-PCR和Western blot檢測β-catenin、snail、fibronectin、E-cadherin的表達情況。結(jié)果:miR-155在IgAN組腎活檢組織中的表達水平顯著高于對照組(P<0.01);腎活檢組織中miR-155表達量與腎小管間質(zhì)纖維化呈正相關(guān)關(guān)系,與腎小球濾過率呈負相關(guān)關(guān)系;體外細胞實驗顯示,上調(diào)miR-155表達可激活Wnt/β-catenin信號通路,間質(zhì)表型標志物fibronectin表達升高,而上皮表型標志物E-cadherin表達下降。結(jié)論:miR-155的表達上調(diào)與IgAN腎小管間質(zhì)纖維化密切相關(guān),其可能通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路參與IgAN的進展。
miR-155;Wnt/β-catenin;IgA腎?。荒I小管間質(zhì)纖維化
IgA腎病(IgA nephropathy, IgAN)是我國最常見的腎小球疾病之一。根據(jù)腎活檢統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,IgAN約占原發(fā)性腎小球腎炎的45.3%~54.3%[1]。IgAN的臨床表現(xiàn)、治療反應(yīng)和預后均存在較大的個體差異,臨床上約有30%~50%的患者在確診后的5~25年內(nèi)進展為終末期腎臟病,給家庭和社會造成沉重的負擔。腎小管間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病進展至終末期腎臟病的共同通路。因此,研究IgAN腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生機制具有重要的現(xiàn)實意義。microRNA(miRNA)是一類廣泛存在于真核生物中的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA,可通過與靶mRNA互補結(jié)合,對靶基因進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。近年的研究發(fā)現(xiàn),miRNA在細胞分化、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)等多種病理生理過程中起重要作用。miR-155在IgAN中的表達及其作用尚未明確。本研究采用實時熒光定量RT-PCR檢測IgAN腎活檢組織中miR-155的表達情況;通過轉(zhuǎn)染miR-155模擬物,觀察miR-155對人腎近曲小管上皮細胞株Wnt/β-catenin信號通路及下游基因表達的影響,探討miR-155在參與IgAN腎小管間質(zhì)纖維化中的可能機制。
1.1材料
1.1.1臨床標本選取2014年6月至2015年6月期間在南方醫(yī)科大學附屬東莞人民醫(yī)院腎內(nèi)科住院并經(jīng)臨床和腎活檢確診為原發(fā)性IgAN患者37例,收集腎活檢石蠟存檔標本。入選的病例均已排除系統(tǒng)性紅斑狼瘡、過敏性紫癜、乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎等繼發(fā)性IgAN。選取因腎腫瘤行腎切除術(shù)患者16例,用18號穿刺針留取距離腫瘤>2 cm處的腎組織作為正常對照。
1.1.2細胞株人腎近曲小管上皮細胞系HK-2購自中國科學院細胞庫。
1.2方法
1.2.1資料收集及病理評估收集患者年齡、性別、體重、血壓、24小時尿蛋白定量(UPE)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)等臨床資料。采用改良簡化MDRD方程[2]計算腎小球濾過率(eGFR)。腎活檢組織經(jīng)固定及包埋切片后常規(guī)行光鏡、免疫熒光和電鏡檢查。參照文獻報道的方法[3],對腎小管間質(zhì)纖維化程度進行量化評估。
1.2.2miR-155表達水平的檢測石蠟包埋腎穿刺組織5 μm厚度切片5張,使用miRNeasy FFPE Kit(Qiagen)提取并純化miRNA。應(yīng)用miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit (TIANGEN)將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;使用miRcute miRNA qPCR Detection Kit(TIANGEN)進行實時定量PCR。miR-155上游引物序列為5’-TTAATGCTAATCGTGATAGGGG-3’;U6上游引物序列為5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’。PCR反應(yīng)條件如下:94 ℃預變性2 min,94 ℃變性20 sec,60 ℃退火、延伸34 sec,共35個循環(huán)。
1.2.3細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染人腎近曲小管上皮細胞HK-2用含10%胎牛血清的DMEM/F12(GIBCO)培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。每2~3天更換培養(yǎng)液。待細胞生長至70%~80%融合時進行傳代。取對數(shù)生長期的細胞以2×105·孔-1的密度接種于6培養(yǎng)孔板中,使用LipofectamineTM2000試劑將miR-155 mimics(miR-155組)、negative control(NC組)轉(zhuǎn)染至HK-2,同時僅以LipofectamineTM2000試劑轉(zhuǎn)染細胞者設(shè)為空白對照組(Blank組)。
1.2.4RT-PCR檢測mRNA表達水平收集細胞加入RNAiso Plus (Takara)提取各組細胞總RNA。使用Nanodrop測定總RNA含量和濃度。使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。應(yīng)用Golden Fast PCR Kit(TIANGEN)進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件:95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,共進行35個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。引物序列如下:β-catenin(上游5’-CTTACACCCACCATCCCACT-3’,下游5’-CCTCCACAAATTGCTGCTGT-3’)、snail(上游5’-AGGATCTCCAGGCTCGAAAG-3’,下游5’-GTAGCAGCCAGGGCCTAGAG-3’)、fibronectin(上游5’-GGACATGCATTGCCTACTCG-3’,下游5’-GAATCCTGGCATTGGTCGAC-3’)、E-cadherin(上游5’-AACAGGATGGCTGAAGGTGA-3’,下游5’-CCTTCCATGACAGACCCCTT-3’)、β-actin(上游 5’-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3’,下游 5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’)。產(chǎn)物經(jīng)過電泳后采用凝膠分析儀掃描分析。
1.2.5Western blot檢測蛋白表達水平收集細胞加入RIPA 裂解液提取各組細胞總蛋白。使用Bradford Protein Assay Kit (Beyotime)測定蛋白濃度。取50 μg總蛋白上樣于SDS-PAGE凝膠中,室溫下垂直電泳,0.3 A、20 V濕法電轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉1.5 h,分別加入TBST稀釋的第一抗體(兔抗人β-catenin多克隆抗體,稀釋度為1∶1 000;兔抗人snail單克隆抗體,稀釋度為1∶1 000;山羊抗人fibronectin多克隆抗體,稀釋度為1∶500;兔抗人E-cadherin多克隆抗體,稀釋度為1∶800;兔抗人β-actin多克隆抗體,稀釋度為1∶1 000),4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次,加入HRP標記的第二抗體(稀釋度1∶1 000),室溫孵育2 h,TBST洗膜3次,ECL化學發(fā)光顯影。
1.3統(tǒng)計學分析采用SPSS 18.0 軟件包進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(mean ± SD)或中位數(shù)(IQR)表示。兩組間比較,若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,采用t檢驗;若非正態(tài)分布,采用Mann-Whitney U檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1研究對象的臨床基線資料本研究納入經(jīng)臨床和腎活檢確診為原發(fā)性IgAN患者37例(IgAN組),因腎腫瘤行腎切除術(shù)患者16例(對照組)。兩組研究對象的臨床基線資料見表1。
表1 研究對象的臨床基線資料
2.2miR-155表達情況及臨床病理參數(shù)分析實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,miR-155在IgAN組腎活檢組織中的表達水平明顯高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(見圖1A)。對入選的37例IgAN患者臨床病理參數(shù)和miR-155表達情況進行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)腎活檢組織中miR-155表達水平與腎小球濾過率呈負相關(guān)關(guān)系(r=-0.3368,P=0.0415),與腎小管間質(zhì)纖維化程度呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.3764,P=0.0217)(見圖1B、1C)。
2.3miR-155對Wnt/β-catenin及下游基因表達的影響轉(zhuǎn)染48 h、72 h后收集細胞分別提取mRNA和蛋白。RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-155 mimics上調(diào)HK-2細胞株內(nèi)miR-155表達后,與陰性對照組或空白對照組相比,β-catenin表達明顯增加,上皮表型標志物E-cadherin表達下降,而間質(zhì)表型標志物fibronectin表達上調(diào)(P<0.05,圖2、圖3)。
A:腎組織中miR-155的相對表達量(**與對照組比較,P<0.01);B:miR-155與eGFR相關(guān)性分析;C:miR-155與腎間質(zhì)纖維化相關(guān)性分析。
圖1miR-155在腎組織中表達及與臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析
*與對照組比較,P<0.05。
*與對照組比較,P<0.05。
IgAN是當前我國終末期腎臟病最主要的病因之一, 其發(fā)病率有逐年上升的趨勢。IgAN的發(fā)病機制迄今尚未完全明確,可能涉及感染、遺傳、免疫和環(huán)境等多種因素。近年研究表明,腎小管間質(zhì)損害尤其是腎小管間質(zhì)纖維化在IgAN疾病發(fā)展過程中起著非常重要的作用。意大利學者D'Amico[4]對多項設(shè)計嚴謹?shù)呐R床研究進行薈萃分析發(fā)現(xiàn),腎小球硬化和間質(zhì)纖維化是IgAN病程進展及預后不良的預測因素。而Mera等[5]的研究顯示,腎小管間質(zhì)損害積分對IgAN預后的預測強度高于腎小球積分。
腎小管間質(zhì)纖維化是腎臟在感染、缺血、損傷以及炎癥免疫反應(yīng)等多種因素刺激下,固有細胞和間質(zhì)受損,炎癥介質(zhì)、細胞因子釋放,導致腎小管上皮-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化、肌成纖維細胞異常增殖和細胞外基質(zhì)過度積聚,最終造成腎臟固有結(jié)構(gòu)破壞、間質(zhì)硬化。腎小管間質(zhì)纖維化的形成和發(fā)展是一個動態(tài)的病理過程,涉及多種細胞因子和信號通路的異常表達調(diào)控,如TGF-β1、IGF及JAK/STAT通路、PI3K通路、Wnt/β-catenin通路等[6]。其中以Wnt/β-catenin信號通路的研究較為深入。利用單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)腎間質(zhì)纖維化的動物模型,研究人員證實了Wnt、β-catenin及其下游靶基因MMP-7、FN等在慢性腎損傷過程中被誘導表達[7-9];而采用ICG-001特異性阻斷Wnt/β-catenin/CBP信號通路可有效抑制鼠腎臟纖維化的進展[10]。我們既往的研究亦發(fā)現(xiàn),β-catenin在伴有腎小管間質(zhì)病變的IgAN 患者腎臟活檢組織中表達水平高于不伴腎小管間質(zhì)病變的IgAN患者,提示W(wǎng)nt/β-catenin通路在IgAN疾病進展過程中被激活,參與IgAN腎小管間質(zhì)纖維化的形成[11]。
隨著研究的深入,miRNA在腎小管間質(zhì)纖維化中的作用受到越來越多的關(guān)注,成為目前研究的熱點之一。2007年Kato等[12]率先報道了miRNA-192可以通過靶向抑制SIP1表達,在調(diào)控TGF-β1誘導糖尿病腎病腎組織內(nèi)膠原的生成中發(fā)揮重要的作用。Oba S等[13]采用UUO腎間質(zhì)纖維化小鼠模型研究發(fā)現(xiàn),miR-200的表達呈時間依賴性上調(diào);靜脈注射miR-200b前體可抑制Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白和纖維連接蛋白的生成,減輕腎間質(zhì)纖維化程度。此外,Wang等[14]檢測發(fā)現(xiàn)IgAN患者尿液中miR-93表達水平高于健康對照組,且與SMAD3表達及腎小球硬化顯著相關(guān),提示miR-93可能通過TGF-β1/SMAD3信號通路調(diào)控,參與IgAN腎臟纖維化進程。在本研究中,我們通過熒光定量PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),IgAN患者腎活檢組織中miR-155表達水平顯著高于對照組(P<0.01),而且miR-155表達量與腎小管間質(zhì)纖維化呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.3764,P=0.0217),這與Wang等[15]的研究結(jié)果相一致。我們利用脂質(zhì)體介導miR-155模擬物瞬時轉(zhuǎn)染進行體外細胞實驗證實,上調(diào)miR-155表達可激活Wnt/β-catenin信號通路,增強間質(zhì)表型標志物fibronectin表達,促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。上述研究結(jié)果提示,miR-155的表達上調(diào)與IgAN腎小管間質(zhì)纖維化密切相關(guān),其可能通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路參與IgAN的進展。miR-155具體的作用靶點及其調(diào)控機制還有待進一步深入研究。
[1]Liu ZH.Nephrology in china[J].Nat Rev Nephrol,2013,9(9):523-528.
[2]全國eGFR課題協(xié)作組.MDRD方程在我國慢性腎臟病患者中的改良和評估[J].中華腎臟病雜志,2006(10):589-595.
[3]Wang G,Kwan BC,Lai FM,et al.Expression of microRNAs in the urinary sediment of patients with IgA nephropathy[J].Dis Markers,2010,28(2):79-86.
[4]D'Amico G.Natural history of idiopathic IgA nephropathy:role of clinical and histological prognostic factors[J].Am J Kidney Dis,2000,36(2):227-237.
[5]Mera J,Uchida S,Nagase M.Clinicopathologic study on prognostic markers in IgA nephropathy[J].Nephron,2000,84(2):148-157.
[6]Farris AB,Colvin RB.Renal interstitial fibrosis: mechanisms and evaluation[J].Curr Opin Nephrol Hypertens,2012,21(3):289-300.
[7]Surendran K,Schiavi S,Hruska KA.Wnt-dependent beta-catenin signaling is activated after unilateral ureteral obstruction,and recombinant secreted frizzled-related protein 4 alters the progression of renal fibrosis[J].J Am Soc Nephrol,2005,16(8):2373-2384.
[8]Surendran K,McCaul SP,Simon TC.A role for Wnt-4 in renal fibrosis[J].Am J Physiol Renal Physiol,2002,282(3):F431-441.
[9]He W,Dai C,Li Y,et al.Wnt/beta-catenin signaling promotes renal interstitial fibrosis[J].J Am Soc Nephrol,2009,20(4):765-776.
[10]Hao S,He W,Li Y,et al.Targeted inhibition of beta-catenin/CBP signaling ameliorates renal interstitial fibrosis[J].J Am Soc Nephrol,2011,22(9):1642-1653.
[11]王珍,冼麗英,葉偉標,等.Wnt/β-catenin在IgA腎病中的表達及意義[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2015(6):506-509.
[12]Kato M,Zhang J,Wang M,et al.MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruli and its function in TGF-beta-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors[J].Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(9):3432-3437.
[13]Oba S,Kumano S,Suzuki E,et al.miR-200b precursor can ameliorate renal tubulointerstitial fibrosis[J].PLoS One,2010,5(10):e13614.
[14]Wang G,Kwan BC,Lai FM,et al.Urinary miR-21,miR-29,and miR-93:novel biomarkers of fibrosis[J].Am J Nephrol,2012,36(5):412-418.
[15]Wang G,Kwan BC,Lai FM,et al.Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy[J].Dis Markers,2011,30(4):171-179.
The Association of Wnt/β-catenin Signaling Pathway Regulated by miR-155 with Renal Interstitial Fibrosis in IgA Nephropathy
YEWei-biao1,LIYi1,LIUTao2,WANGZhen1,LIZhong-jun1,HUANGSu-ran1
(1.DongguanHospitalofSouthernMedicalUniversity,DongguanGuandong523059;2.GuangdongGeneralHospital,GuangzhouGuandong510080)
Objective: To investigate the expression of miR-155 in patients with immunoglobulin A nephropathy (IgAN), and to analyze its role in renal interstitial fibrosis. Methods: The expression levels of miR-155 within kidney biopsies were assessed by real-time quantitative RT-PCR. miR-155 mimics were transiently transfected into human proximal tubule epithelial cells (HK-2). The expression of epithelial and mesenchymal markers as well as transcriptional regulators in Wnt/β-catenin signaling pathway were detected by RT-PCR and Western blotting. Results: Higher miR-155 expression was found in renal biopsy tissues from IgAN patients compared to controls (P<0.01). The expression levels of miR-155 were positively correlated with renal interstitial fibrosis, but were inversely correlated with estimated glomerular filtration rate. Up-regulation of miR-155 induced the activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway, which in turn increased fibronectin and reduced E-cadherin expression. Conclusion: miR-155 was elevated in IgAN patients, and the increased levels were correlated with the severity of renal interstitial fibrosis. This indicates that miR-155 may play a critical role in the pathogenesis of IgAN.
miR-155; Wnt/β-catenin; Immunoglobulin A nephropathy (IgAN); Renal interstitial fibrosis
廣東省教育廳臨床教學基地教學改革研究項目(2014JDB067);東莞市科技計劃醫(yī)療衛(wèi)生類科研一般項目(No.2015105101192、No.2014105101200)
R692.3
A
1001-5779(2016)03-0358-05
10.3969/j.issn.1001-5779.2016.03.007
2016-02-17)(責任編輯:敖慧斌)