補充蛋氨酸對星斑川碟生長、血液指標(biāo)、代謝酶以及體組成的影響

宋志東 李培玉（山東省海洋資源與環(huán)境研究院，煙臺264006）

補充蛋氨酸對星斑川碟生長、血液指標(biāo)、代謝酶以及體組成的影響

宋志東 李培玉
（山東省海洋資源與環(huán)境研究院，煙臺264006）

在含有30%的大豆?jié)饪s蛋白及其酶解物飼料中分別添加晶體蛋氨酸形成4種等氮等能的飼料，分別為大豆?jié)饪s蛋白飼料（SD）、酶解大豆蛋白飼料（ED）、大豆?jié)饪s蛋白補充晶體蛋氨酸飼料（SD-CMET）以及酶解大豆蛋白補充晶體蛋氨酸飼料（ED-CMET），喂養(yǎng)初始體重為4.81±0.01g的星斑川鰈幼魚56天，通過比較其生長、血液生化標(biāo)、消化以及體組成等，來評價補充晶體蛋氨酸對星斑川鰈利用植物蛋白及其酶解物的效果。結(jié)果顯示ED-CMET比ED分別提高幼魚的末重4.7%、增重率7.9%和特定生長率4.6%，且顯著提高星斑川鰈幼魚的血細(xì)胞比容、血紅蛋白含量、血清總蛋白水平以及高密度脂蛋白含量（P＜0.05），并且還增強了肝臟ATP酶活性，提高了全魚的粗蛋白含量（P＜0.05）。而與SD飼料相比，在大豆?jié)饪s蛋白飼料中添加蛋氨酸（SD-CMET）提高了高密度脂蛋白的含量，而對幼魚其它指標(biāo)無明顯的影響（P＜0.05）。本實驗結(jié)果說明在添加蛋氨酸無法改善星斑川鰈幼魚利用大豆?jié)饪s蛋白的效果，而酶解大豆蛋白中添加蛋氨酸能夠提高星斑川鰈幼魚的生長性能，且一定程度的提高機體的細(xì)胞免疫能力和肝臟代謝轉(zhuǎn)運，調(diào)節(jié)血脂代謝，并可改善機體的營養(yǎng)組成。因此推薦在飼料中應(yīng)用一定比例的酶解大豆蛋白，并在此基礎(chǔ)上添加晶體蛋氨酸。

星斑川鰈；蛋氨酸；酶解大豆蛋白；生長；代謝；體組成

餌料中蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值的高低，很大程度上取決于所含的必需氨基酸和非必需氨基酸的數(shù)量和比例即氨基酸的平衡模式，只有餌料中各種氨基酸的數(shù)量與比例同魚體的需要相接近時，才能滿足魚類對于蛋白質(zhì)和氨基酸的需求，反之則會影響?zhàn)D料中蛋白質(zhì)的利用。相對于魚粉含有高含量的蛋氨酸來說，植物蛋白源蛋氨酸含量較低，常常成為第一限制性氨基酸?；诘鞍彼釥I養(yǎng)的重要性，在實際生產(chǎn)中，為了提高豆粕等植物性蛋白源的利用效率，往往考慮在飼料中添加蛋氨酸單體以解決植物性蛋白源氨基酸不平衡的問題。然而單體形式的蛋氨酸并不能被魚類有效利用。其原因是由于晶體氨基酸與飼料中蛋白態(tài)氨基酸的吸收的不同步以及晶體氨基酸在水中的溶失。因此提高蛋氨酸的有效利用是解決植物蛋白高比例添加的關(guān)鍵之一。

相對于完整大豆蛋白，大豆蛋白酶解物的營養(yǎng)價值以及功能特性得到明顯的改善，多元氮營養(yǎng)素形式（游離氨基酸、肽段以及部分消化蛋白）構(gòu)成了多級消化吸收模式，能夠提高動物消化吸收率，這種模式有利于魚類充分利用蛋氨酸。在補充蛋氨酸的情況下，魚類能夠很好的利用酶解植物蛋白，如Song等（2014）在補充蛋氨酸的情況下發(fā)現(xiàn)大豆蛋白酶解物對星斑川鰈的生長作用好于全魚粉飼料。相似的情況也在牙鲆上發(fā)現(xiàn)。本文通過在大豆?jié)饪s蛋白及其酶解物所形成的飼料中補充單體形式的蛋氨酸，通過比較其生長性能、血液生化指標(biāo)、消化能力以及體組成等方面的差異，來評價在補充蛋氨酸的情況下星斑川鰈幼魚利用兩種不同形式的植物蛋白的效果。

1　材料與方法

酶解大豆蛋白的制備參照Song等（2014）的方法制備，其中可溶解性氮采用Mamauaga等（2011）的方法測定為32%（22℃，pH7.5）。分別以大豆?jié)饪s蛋白（購自山東長潤生物有限公司，粗蛋白均為66.1%，粗脂肪為0.8%，粗灰分為5.2%）和酶解大豆蛋白，配合魚粉（購自榮成海達(dá)魚粉有限公司，粗蛋白為67.2%，粗脂肪為10.3%，粗灰分為15.7%）、花生粕（購自莘縣鑫利農(nóng)生物科技有限公司，粗蛋白為47.5%，粗脂肪為0.8%，粗灰分為5.9%）作為主要蛋白源配制4種等氮等能（粗蛋白水平為（45.32±0.17）%，能量水平為（20.08±0.08）kJ/g的實驗飼料。魚油和豆油按1∶1混合后加入1%的卵磷脂做為脂肪源，并調(diào)節(jié)其水平為12.05±0.14%。以α-淀粉和羧甲基纖維素來調(diào)節(jié)各組飼料成分平衡，配方見表1。其中ED為含有大豆蛋白酶解物的飼料，SD為含有大豆?jié)饪s蛋白的飼料，ED-CMET和SD-CMET兩種飼料是在ED和SD飼料的基礎(chǔ)上添加0.5%晶體蛋氨酸形成。所有的原料充分混合，擠壓制成直徑3 mm的顆粒飼料，干燥至水分在8%以下，貯存在-20℃以備使用。實驗飼料的原料及營養(yǎng)組成見表1。

表1　驗飼料配方及營養(yǎng)組成（%）

1.2實驗魚及喂飼管理

星斑川鰈幼魚購自市場，實驗在山東省資源與環(huán)境研究院循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行，480尾幼魚,初始體重（4.81±0.01）g隨機分配到12個養(yǎng)殖塑料桶（400L）中，該循環(huán)系統(tǒng)帶有冷凝和加熱設(shè)備，可控制循環(huán)水系統(tǒng)內(nèi)的問題。實驗開始前，每組魚用對照飼料馴化兩周，使其適應(yīng)整個環(huán)境條件和配合飼料。將4種飼料隨機分配到12桶實驗魚中，每種飼料設(shè)3個平行，喂養(yǎng)試驗持續(xù)8個周，每天投喂兩次（07∶30和16∶00），每次目視魚飽食后不再投喂。投餌20分鐘后，收集殘餌。在養(yǎng)殖期間，控制水溫在（17.0±1.0）℃、鹽度（32.0±1.2）‰、溶氧>5.0 mg L-1、NH4+-N<0.10 mg L-1。

1.3生長指標(biāo)及形體指標(biāo)測定

實驗結(jié)束后，所有的魚禁食24h后稱量每桶魚的總重，用于計算生長和飼料攝入。然后，每桶隨機取15尾魚，用MS-222麻醉，并且每尾魚單獨稱重，測量體長和體寬。用注射器在魚背部血管處取血。在4℃下，離心10 min（3000 g/min）以制備血清，貯存于-80℃用于生化指標(biāo)分析。剖取肝臟、腸道、背部肌肉存放于-80℃下以備營養(yǎng)組成分析。生長指標(biāo)的計算公式如下：

1.4血液生理生化指標(biāo)測定

將注射器沿魚體側(cè)線部位斜向脊椎部分插入，抽出的血液加入生理鹽水進(jìn)行稀釋，在血球計數(shù)板上立即計數(shù)。血細(xì)胞比容的測定采用溫氏法，即取肝素鈉抗凝靜脈血2 mL，加入溫氏管中，用水平離心機以2200×g離心30 min，離心后讀取還原紅細(xì)胞層柱高的毫米數(shù)，乘以0.01，即為每升血液中紅細(xì)胞體積的升數(shù)。血紅蛋白含量采用南京建成血紅蛋白試劑盒測定。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、血清總蛋白、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇等指標(biāo)采用商品化試劑盒（北京利得曼生化股份有限公司，北京）所使用說明書中所指定的參數(shù)在全自動生化分析儀上測定（7020型，Hitachi，日本），血清尿素氮則是采用南京建成試劑盒進(jìn)行測定。

1.5酶活性測定

Research on the Digital Development of the Intangible Cultural Heritage Tourism of Guilin Opera____________________________LI Guanghong,LIANG Minhua 28

消化酶和肝臟代謝酶的活性主要采用南京建成試劑盒進(jìn)行測定。其中,（1）胃蛋白酶活性定義：在pH 2.0、37℃條件下，1g組織每分鐘分解蛋白生成1μg氨基酸相當(dāng)于1個酶活力單位，U/g prot。胰蛋白酶活性定義：在pH 8.0、37℃條件下，1μg蛋白中含有的胰蛋白酶每分鐘使吸光度變化0.03為1個酶活力單位，U/μg prot。（2）脂肪酶活性定義：37℃條件下，1g組織在反應(yīng)體系中與底物反應(yīng)1min，每消耗1μmol底物為1個酶活力單位，U/g prot。（3）淀粉酶活性定義：37℃條件下，1g組織與底物作用30min，水解10mg淀粉定義為1個酶活力單位，U/g prot。（4）Na+-K+ATP酶活性定義：37℃條件下，每小時1mg組織蛋白中ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無機磷的量為1個酶活力單位。（5）堿性磷酸酶活性定義：定義為每1 g組織蛋白在37℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個酶活力單位，U/g prot。

1.6體組成分析

實驗飼料、全魚、腸道、肌肉等樣品的干物質(zhì)含量按照常壓下105℃測定，蛋白采用FP-528燃燒測氮儀（Leco Corp.，Joseph，MI，USA），粗脂肪的測定采用索氏抽提法，能量測定采用Parr 6100型氧彈測能儀（Parr Instrument Co.，Moline，IL，USA）。

1.7統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用 SPSS16.0統(tǒng)計軟件（SPSS Inc., Chicago,IL,USA）.）進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），當(dāng)處理之間差異顯著（P<0.05）時，用Duncan's檢驗進(jìn)行多重比較分析。統(tǒng)計數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Means±SD）形式表示。

2　結(jié)果與分析

2.1星斑川鰈生長性能及飼料利用實驗過程中沒有死亡發(fā)生（表2）。與SD飼料相比，SD-CMET飼料則對幼魚生長性能和餌料利用各指標(biāo)均無顯著影響（P>0.05）。而ED-CMET分別則較ED飼料組提高幼魚末重達(dá)4.7%、增重率7.9%和特定生長率4.6%（P<0.05），對攝食率和餌料系數(shù)無影響（P>0.05）。

表2　攝食不同實驗飼料56天的星斑川鰈生長性能及飼料利用

2.2星斑川鰈幼魚的血液學(xué)指標(biāo)

表3　攝食不同實驗飼料56天后的星斑川鰈幼魚的血液生理生化指標(biāo)

各飼料處理組幼魚的血液學(xué)指標(biāo)見表3。任何飼料處理對紅細(xì)胞數(shù)、血清谷草轉(zhuǎn)氨酶活性、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性以及總膽固醇、甘油三脂和低密度脂蛋白含量無顯著影響（P>0.05），但是ED-CMET飼料較ED飼料顯著提高了星斑川鰈幼魚的血細(xì)胞比容、血紅蛋白含量、血清總蛋白水平以及高密度脂蛋白含量（P<0.05）。而與SD飼料相比，添加蛋氨酸（SD-CMET）提高了高密度脂蛋白含量（P<0.05），而對各項血清學(xué)指標(biāo)并無明顯改變（P>0.05）。

2.3星斑川鰈幼魚胃腸道和肝臟酶活性

如表4所示，與ED飼料相比，ED-CMET對幼魚胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、腸道堿性磷酸酶和ATP酶以及肝臟的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶無顯著影響（P>0.05），但是顯著提高了肝臟ATP酶活性（P<0.05）。而與SD飼料相比，SD-CMET飼料對幼魚胃腸道和肝臟各種酶活均無顯著影響（P>0.05）。

表4　攝食不同實驗飼料56天后的星斑川鰈幼魚的胃腸道和肝臟酶活性

2.4星斑川鰈幼魚的體組織營養(yǎng)組成

攝食不同處理的飼料對幼魚體組成有一定的影響（表5）。與ED飼料相比，ED-CMET飼料能顯著提高全魚的粗蛋白含量（P<0.05），而對其它指標(biāo)無顯著影響（P>0.05）。而SD和SD-CMET飼料組的實驗魚體組成并無明顯差異（P>0.05）。

表5　攝食不同實驗飼料56天后星斑川鰈幼魚全魚和肌肉的營養(yǎng)組成/%（干重）

3　討論

本實驗的結(jié)果表明在含有大豆?jié)饪s蛋白的飼料中添加晶體氨基酸對星斑川鰈幼魚的生長性能和餌料利用并無明顯提高，這與在鯉魚和大西洋鮭上的研究結(jié)果一致，而在大豆蛋白酶解物飼料中添加晶體蛋氨酸對星斑川鰈卻能夠顯著提高魚體的生長性能。這可能與動物體內(nèi)存在一種氨基酸吸收的“內(nèi)穩(wěn)態(tài)”調(diào)節(jié)機制有關(guān)，在大豆?jié)饪s蛋白飼料中直接添加的晶體蛋氨酸促使短時間在腸道內(nèi)形成較高濃度的蛋氨酸，而此時大豆?jié)饪s蛋白的消化還未達(dá)到高峰，導(dǎo)致晶體氨基酸與飼料中蛋白態(tài)氨基酸的吸收的不同步，從而激發(fā)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機制，將晶體氨基酸氧化為能量或者將其轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)消耗掉。同完整的大豆?jié)饪s蛋白相比，大豆蛋白酶解物含有較多的部分消化蛋白、低分子量肽和游離氨基酸，小肽具有較高的吸收速度，且其通過專門的寡肽轉(zhuǎn)運體進(jìn)入體內(nèi)，這樣達(dá)到了與補充的氨基酸同步吸收，避免與補充的氨基酸競爭氨基酸載體，從而形成了一種平衡的吸收利用模式，提高機體蛋白的合成率，促進(jìn)生長，提高餌料的利用效率。

蛋氨酸缺乏能導(dǎo)致動物機體血細(xì)胞免疫學(xué)指標(biāo)的降低。Zhou等l（2006）也報道蛋氨酸水平不影響軍曹魚的紅細(xì)胞數(shù)量，但卻影響血細(xì)胞比容和血紅蛋白含量。Ruchimat等（1997）報道攝食低蛋氨酸的飼料導(dǎo)致黃尾鰤的血細(xì)胞比容、血紅蛋白含量以及紅細(xì)胞數(shù)量均降低。蛋氨酸提高血紅蛋白含量和血細(xì)胞比容的途徑可能與在機體內(nèi)的代謝作用有關(guān)，如蛋氨酸殘基能夠引發(fā)血細(xì)胞珠蛋白的α和β鏈的合成，而蛋氨酸的代謝產(chǎn)物-半胱氨酸能夠促進(jìn)細(xì)胞對微量元素鐵的吸收。本實驗中，在大豆?jié)饪s蛋白飼料中添加晶體蛋氨酸對血細(xì)胞比容和血紅蛋白含量并無影響，而在含有大豆蛋白酶解物的飼料中添加晶體蛋氨酸則提高了血細(xì)胞比容和血紅蛋白含量，可能的原因是大豆蛋白酶解物能夠和補充的蛋氨酸在腸道內(nèi)形成平衡的氨基酸模式從而提高蛋氨酸的有效利用，且酶解物本身也能通過螯合鐵離子，從而增強鐵元素的吸收達(dá)到促進(jìn)血紅蛋白合成作用。另外，血清總蛋白也是肝臟功能的一項主要反映指標(biāo)，其水平高低反應(yīng)了肝臟的合成能力。飼料中的氮營養(yǎng)素質(zhì)量和水平尤其是一些酶解物的添加，直接影響肝臟血清蛋白的合成能力。在本實驗中也發(fā)現(xiàn)大豆蛋白酶解物添加晶體蛋氨酸均能增加血清蛋白的合成，說明加入了蛋氨酸提高了肝臟游離氨基酸庫的平衡性，從而提高了肝臟合成能力，具體的作用機制有待于更為深入的研究。

飼料中蛋氨酸可調(diào)節(jié)動物體的脂肪代謝，這種調(diào)節(jié)作用主要通過提高脂蛋白酯酶的活性和膽汁酸的排泄、調(diào)節(jié)apo A-I和膽固醇7α-羥化酶的基因表達(dá)等實現(xiàn)。本實驗中在含有大豆蛋白酶解物的飼料中添加晶體蛋氨酸明顯并提高了高密度脂蛋白的水平，而在大豆?jié)饪s蛋白的飼料中僅添加晶體蛋氨酸卻無明顯作用。以上現(xiàn)象說明利用酶解大豆蛋白能夠提高魚體對蛋氨酸的有效利用，從而達(dá)到調(diào)節(jié)血脂代謝的作用。而在酶解大豆蛋白中添加蛋氨酸能提高肝臟的ATP酶活性，這可能暗示幼魚肝臟代謝轉(zhuǎn)運活動有所提升，導(dǎo)致Na+-K+ATPase酶泵作用增強，肝細(xì)胞膜磷脂甲基化得到進(jìn)一步提高，這可能與強化肝細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸、谷胱苷肽及?；撬岬暮铣捎嘘P(guān)，具體原因需進(jìn)行更為深入的實驗研究。

有研究表明，在飼料中添加蛋氨酸能增加蛋白片段的合成速度和絕對量，而對降解速度沒有影響，從而達(dá)到改善氮平衡，提高體蛋白合成速度的作用。本實驗中，在含有大豆蛋白酶解物的飼料中添加晶體蛋氨酸提高了全魚的粗蛋白水平，說明大豆蛋白酶解物在提升蛋氨酸的功效方面較大豆?jié)饪s蛋白更有優(yōu)勢，可能的原因是大豆蛋白酶解物形成的多重氮營養(yǎng)素形式能夠在消化過程中不斷的與和蛋氨酸建立吸收代謝的平衡，從而能提高蛋白合成周轉(zhuǎn)效率。

總之，大豆酶解蛋白在提高星斑川鰈幼魚利用晶體蛋氨酸方面優(yōu)于大豆?jié)饪s蛋白，在含有大豆蛋白酶解物的飼料中添加蛋氨酸能提高星斑川鰈幼魚的生長性能，且一定程度的提高機體的細(xì)胞免疫能力，提高肝臟代謝轉(zhuǎn)運，調(diào)節(jié)血脂代謝，并可改善機體的營養(yǎng)組成。因此推薦在飼料中應(yīng)添加一定比例的酶解大豆蛋白，并在此基礎(chǔ)上添加晶體蛋氨酸。

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S963.73

A

1005-8613（2016）09-0025-05

2016-7-22

煙臺市科技發(fā)展計劃項目（2013ZH348）。

宋志東（1978-），男，漢族，博士，水生動物營養(yǎng)與飼料

李培玉