高效液相色譜法測定腰痛丸(Ⅰ)中新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿的含量

朱干紅，仇其原，曹桂萍，吳士龍

(1.鹽城市中醫(yī)院藥劑科，江蘇 鹽城　224001； 2.鹽城市藥品檢驗所藥物分析室，江蘇 鹽城　224001)

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高效液相色譜法測定腰痛丸(Ⅰ)中新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿的含量

朱干紅1*，仇其原2#，曹桂萍1，吳士龍2

(1.鹽城市中醫(yī)院藥劑科，江蘇 鹽城224001； 2.鹽城市藥品檢驗所藥物分析室，江蘇 鹽城224001)

目的：建立腰痛丸(Ⅰ)中新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿含量測定方法，進一步提高腰痛丸(Ⅰ)的質量控制。方法：采用CAPCELL PAK C18(4.5 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，流動相A為乙腈-四氫呋喃(V∶V=25 ∶15)，流動相B為0.1 mol/L醋酸銨溶液，梯度洗脫，檢測波長為235 nm，柱溫為30 ℃，流速為1.0 ml/min。結果：新烏頭堿在0.2～1.6 μg/ml范圍內線性關系良好，r2=0.999 1，平均回收率為97.69%，RSD為0.86%；次烏頭堿在0.2～1.6 μg/ml范圍內線性關系良好，r2=0.998 9，平均回收率為98.17%，RSD為0.93%；烏頭堿在0.2～1.6 μg/ml范圍內線性關系良好，r2=0.999 5，平均回收率為99.50%，RSD為0.45%。結論：本研究測定方法簡便、準確、重復性好，可用于腰痛丸(Ⅰ)的質量控制。

高效液相色譜法； 腰痛丸(Ⅰ)； 新烏頭堿； 次烏頭堿； 烏頭堿

腰痛丸(Ⅰ)是一種中藥藥丸，主要是由獨活、蒼術、干姜、肉桂、陳皮、威靈仙、制川烏、制草烏等中藥藥材加工提煉而成，具有祛風、散寒、溫經(jīng)、通絡、止痛等作用，主治風寒腰痛及關節(jié)炎等癥。新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿等烏頭類生物堿是存在于川烏、草烏、附子等植物中的主要有毒成分[1]，能使神經(jīng)和心臟中毒。研究發(fā)現(xiàn)，口服純?yōu)躅^堿0.2 mg即可中毒，3～5 mg可致死。目前對烏頭類生物堿的研究多采用高效液相色譜法[2-5]、反相高效液相色譜法[6-7]、液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用技術[8]、超高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術[9]、液相色譜-質譜聯(lián)用技術等，其中高效液相色譜法得到的結果更加真實可靠、科學準確[10-11]。烏頭類生物堿不穩(wěn)定，且含量甚微。本研究建立了高效液相色譜法測定腰痛丸(Ⅰ)中新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿的含量的方法，用于腰痛丸(Ⅰ)的質量控制。

1　材料

1.1儀器與設備

Waters 2695型高效液相色譜儀，配置Waters 2996型二極管陣列紫外檢測器、empower處理系統(tǒng)等(美國沃特斯公司)；Waters e2695型高效液相色譜儀，配置Waters 2489型紫外檢測器等(美國沃特斯公司)；減壓干燥器(鄭州園田數(shù)字科技有限公司)；AB204-N型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；DGG-9053A型超聲波清洗器(常州國華電器有限公司)。

1.2藥品與試劑

新烏頭堿對照品(批號：110799-200404，含量：100%)、次烏頭堿對照品(批號：110798-200805，含量：99.5%，置五氧化二磷減壓干燥器中干燥12 h以上使用)、烏頭堿對照品(批號：110720-200410，含量：100%)均購自中國食品藥品檢定研究院；腰痛丸(Ⅰ)(鹽城市中醫(yī)院制劑室，批號：150907、150601、150115，規(guī)格：60 g/瓶)；異丙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯均為分析純；乙腈、四氫呋喃、醋酸銨、冰醋酸均為色譜純；水為重蒸餾水。

2　方法與結果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱：CAPCELL PAK C18(4.5 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-四氫呋喃(V∶V=25 ∶15)為流動相A，0.1 mol/L醋酸銨溶液(含冰醋酸0.05%)為流動相B，按表1中的梯度洗脫比例進行梯度洗脫；流速：1.0 ml/min；檢測波長：235 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μl；采集時間：70 min。

表1　梯度洗脫比例(%)Tab 1　Ratio of gradient elution(%)

2.2溶液的制備

2.2.1對照品儲備液：精密稱取新烏頭堿對照品9.55 mg、次烏頭堿對照品(置于五氧化二磷的減壓干燥器中干燥12 h以上)10.50 mg、烏頭堿對照品10.45 mg，分別置于10 ml容量瓶中，加入異丙醇-三氯甲烷(V∶V=1 ∶1)混合溶液使其溶解，稀釋至刻度，搖勻，即獲得新烏頭堿對照品儲備液、次烏頭堿對照品儲備液、烏頭堿對照品儲備液。

2.2.2對照品混合溶液：分別精密量取新烏頭堿對照品儲備液、次烏頭堿對照品儲備液和烏頭堿對照品儲備液各1 ml，置于100 ml容量瓶中，加入異丙醇-三氯甲烷(V∶V=1 ∶1)混合溶液使其溶解，用異丙醇-三氯甲烷(V∶V=1 ∶1)稀釋至刻度，搖勻，即獲得混合對照品溶液。

2.2.3供試品溶液：稱取腰痛丸(Ⅰ)樣品30 g，精密稱定，于大小適合的研缽中研細，取研細后的細粉10 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入氨試液5 ml，精密加入異丙醇-乙酸乙酯(V∶V=1 ∶1)混合溶液100 ml，精密稱定質量，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz，水溫在25 ℃以下)30 min，放冷，再精密稱定重量，用異丙醇-乙酸乙酯(V∶V=1 ∶1)混合溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，殘渣用異丙醇-乙酸乙酯(V∶V=1 ∶1)混合溶液50 ml分3次(20、20、10 ml)洗滌，合并濾液于40 ℃以下減壓回收溶劑至干，殘渣精密加入異丙醇-乙酸乙酯(V∶V=1 ∶1)混合溶液3 ml使其溶解，密塞，濾過，搖勻，取續(xù)濾液，即獲得供試品溶液。

2.3專屬性考察

精密吸取“2.2”項下對照品混合溶液和供試品溶液各20 μl，按“2.1”項下色譜條件注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。由圖可見，新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿三組分色譜峰完全分離，在測定條件下不受其它組分干擾，表明該方法具有良好的專屬性。

A. 對照品混合溶液；B.供試品溶液A. Control mixed solution; B. Test solution圖1　高效液相色譜圖Fig 1　HPLC chromatogram

2.4線性關系考察

精密量取“2.2.2”項下對照品混合溶液適量，制成質量濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 μg/ml的溶液，按“2.1”項下色譜條件分別進樣測定，記錄峰面積。以對照品質量濃度(X，μg/ml)對測得的峰面積(Y)進行線性回歸，繪制標準曲線。結果表明：新烏頭堿在0.2～1.6 μg/ml濃度范圍內，線性關系良好，回歸方程為：Y=634 897X+2 545.7，r2=0.999 1；次烏頭堿在0.2～1.6 μg/ml濃度范圍內，線性關系良好，回歸方程為：Y=731 225X+1 960.1，r2=0.998 9；烏頭堿在0.2～1.6 μg/ml濃度范圍內，線性關系良好，回歸方程為：Y=488 169X+1 271.9，r2=0.999 5。

2.5精密度試驗

分別取“2.2.2”項下對照品混合溶液20.0 μl，按照“2.1”項下色譜條件重復進樣6次，記錄峰面積，計算RSD。結果，新烏頭堿峰面積的RSD=0.94%(n=6)，次烏頭堿峰面積的RSD=0.86%(n=6)，烏頭堿峰面積的RSD=0.99%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗

取批號150601的樣品適量，按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，室溫(25 ℃)下分別在 0、2、4、8、12、16、18、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算RSD。結果，新烏頭堿峰面積的RSD=0.06%(n=8)，次烏頭堿峰面積的RSD=0.08%(n=8)，烏頭堿峰面積的RSD=0.08%(n=8)，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.7重復性試驗

取批號150601的樣品適量，按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，共6份，分別精密吸取20 μl，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算RSD。結果，新烏頭堿峰面積的RSD=0.16%(n=6)，次烏頭堿峰面積的RSD=0.09%(n=6)，烏頭堿峰面積的RSD=0.21%(n=6)，說明本方法重復性良好。

2.8加樣回收試驗

精密稱取已知含量的批號150601樣品細粉，共9份，分別精密加入0.8、1.0、1.2 ml標準溶液(標準溶液為新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿含量為原樣品100%含量的溶液)，各3份，按照“2.2.3”項下方法制得供試品溶液6 ml，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結果，平均回收率為98.4%，RSD為0.38%，表明加樣回收率良好。

2.9供試品含量測定

取各批樣品適量，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定并計算含量，見表2。

表2　樣品含量測定結果(n=3，μg/g)Tab 2　Results of content determination of samples(n=3，μg/g)

3　討論

查閱相關文獻發(fā)現(xiàn)，烏頭堿的含量測定多選擇230～254 nm作為檢測波長[2-6]，其中采用波長235 nm的色譜圖基線更加平穩(wěn)[12-13]，檢出結果中有干擾作用的的雜質峰少[14-16]。本研究在220～380 nm的波長范圍內對新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿對照品進行光譜掃描，發(fā)現(xiàn)3種對照品在235 nm附近有最大吸收波長，故選擇235 nm作為檢測波長。

分別對甲醇-三乙胺-醋酸銨流動相、乙腈-四氫呋喃-醋酸銨的流動相進行考察，結果表明，以乙腈-四氫呋喃-醋酸銨為流動相時，所得到的色譜峰峰形好，分離效果好。故選擇乙腈-四氫呋喃(V∶V=25 ∶15)作為流動相A，0.1 mol/L醋酸銨溶液(含冰醋酸0.05%)作為流動相B。

本研究建立了高效液相色譜法測定腰痛丸(Ⅰ)中新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿含量的方法，具有以下優(yōu)勢：(1)測定方法操作簡便；(2)線性關系良好，測定方法精密度好；(3)結果準確可靠。

綜上所述，本研究測定方法操作簡便，分離效果佳，精密度、穩(wěn)定性、重復性良好，為腰痛丸(Ⅰ)的質量控制提供了可靠的測定依據(jù)。

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Content Determination of Mesaconitine, Hypaconitine and Aconitine in Yaotong Pills(I) by HPLC

ZHU Ganhong1，QIU Qiyuan2，CAO Guiping1，WU Shilong2

(1.Dept.of Parmacy, Yancheng Traditional Chinese Medicine Hospital, Jiangsu Yancheng 224001，China； 2.Dept.of Pharmaceutical Analysis,Yancheng Institute for Drug Control, Jiangsu Yancheng 224001，China)

OBJECTIVE：To establish the method for the content determination of mesaconitine, hypaconitine and aconitine in Yaotong pills(I), so as to further improve the quality control of Yaotong pills(I). METHODS: CAPCELL PAK C18(4.5 mm×250 mm,5 μm) column was adopted with the mobile phase A of acetonitrile- tetrahydrofuran (V∶V=25 ∶15) and the mobile phase B of 0.1 mol/L ammonium acetate solution by gradient elution at detection wavelength of 235 nm. The column temperature was 30 ℃ and the flow rate was 1.0 ml/min. RESULTS: The linearity ranges for mesaconitine, hypaconitine and aconitine were 0.2-1.6 μg/ml, the correlation coefficients werer2=0.999 1,r2=0.998 9,r2=0.999 5, respectively, and the average recoveries were 97.69% with relative standard deviation (RSD) 0.86%, 98.17% withRSD0.93%, 99.50% withRSD0.45%, respectively. CONCLUSIONS: The method is convenient, accurate with good repetition, which can be used for quality control of Yaotong pills (I).

HPLC; Yaotong pills(I); Mesaconitine; Hypaconitine; Aconitine

副主任藥師。研究方向：藥物分析、藥物有效成分。E-mail：gita_80@126.com

R927.2

A

1672-2124(2016)09-1229-03

10.14009/j.issn.1672-2124.2016.09.030

2016-06-02)

*副主任藥師。研究方向：臨床藥物分析、藥事管理。E-mail：89695388@qq.com