超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定動物肌肉組織中32種β-激動劑、β-阻滯劑和糖肽類抗生素藥物殘留

韓婉清 吳楚森 吳玉鑾 董 浩 王 莉 王 斌 冼燕萍 羅海英

（廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心（廣州），廣州市食品安全檢測技術(shù)重點實驗室，廣州市食品安全風險動態(tài)監(jiān)測與預(yù)警研究中心，廣州 510000）

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定動物肌肉組織中32種β-激動劑、β-阻滯劑和糖肽類抗生素藥物殘留

韓婉清 吳楚森 吳玉鑾 董 浩 王 莉 王 斌 冼燕萍 羅海英*

（廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心（廣州），廣州市食品安全檢測技術(shù)重點實驗室，廣州市食品安全風險動態(tài)監(jiān)測與預(yù)警研究中心，廣州 510000）

建立了同時測定動物肌肉組織中27種β-激動劑、3種β-阻滯劑和2種糖肽類抗生素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）方法。樣品經(jīng)酶解、蛋白沉淀后，以乙酸乙酯-異丙醇（6∶4，V/V）提取，Starata-X-C固相萃取凈化，BEH C18色譜柱分離，乙腈-0.1%甲酸梯度洗脫，串聯(lián)質(zhì)譜ESI+電離，多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測，外標法定量。結(jié)果表明，32種目標物在線性范圍內(nèi)相關(guān)性良好（R2＞0.995），多巴胺、瑞普特羅、萬古霉素和去甲萬古霉素的方法檢出限為5 μg/kg，其它目標物的檢出限為3 μg/kg；平均加標回收率為83.6% ～103%，相對標準偏差（n=6）為3.9%～10.4%，日間精密度為4.5%～9.8%。結(jié)果表明，本方法準確、靈敏，適用于動物肌肉組織中β-激動劑、β-阻滯劑，以及糖肽類抗生素的高通量測定。

β-激動劑；β-阻滯劑；糖肽類抗生素；動物肌肉；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

1 引言

β-激動劑俗稱“瘦肉精”，主要作為促生長劑被添加到動物飼料中，長期食用含此類藥物殘留的畜禽產(chǎn)品可能會引起肌肉振顫、心悸、緊張等癥狀［1，2］，多個國家和地區(qū)已禁止將β-激動劑用于畜禽生產(chǎn)［3～5］。β-阻滯劑是一類能拮抗神經(jīng)遞質(zhì)和兒茶酚胺對β-受體激動作用的藥物，常在動物運輸或屠宰前數(shù)小時內(nèi)使用，以降低動物因應(yīng)激而造成的突然死亡率及對動物肉質(zhì)的影響，殘留風險較大，歐盟和國際食品安全法典委員會已對動物組織中β-阻滯劑卡拉洛爾的殘留做了限量規(guī)定［6，7］（豬肌肉為5 μg/kg，豬肝、腎為25 μg/kg）。萬古霉素和去甲萬古霉素屬于糖肽類抗生素，用于治療細菌感染，我國農(nóng)業(yè)部第560號公告規(guī)定萬古霉素為禁用獸藥［8］。

雖然目前已有動物尿液、血液和肌肉組織中β-激動劑［9～13］、β-阻滯劑［14］和糖肽類抗生素［15］殘留的檢測方法研究，但檢測對象多為單一的一類藥物，沒有同時檢測這3類藥物的研究。因此，建立了同時檢測動物肌肉中β-激動劑、β-阻滯劑和糖肽類抗生素的高通量方法，有利于提高檢測效率，降低檢測成本。

本研究以動物肌肉組織為基質(zhì)，經(jīng)酶解和蛋白沉淀后，以乙酸乙酯-異丙醇混合溶劑提取，固相萃取技術(shù)凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測，建立同時測定動物肌肉組織中27種β-激動劑、3種β-阻滯劑和2種糖肽類抗生素的高通量方法。本方法具有較高的靈敏度和選擇性，不易受基質(zhì)干擾，能實現(xiàn)準確的定性和定量分析，可滿足對肉類食品中β-激動劑、β-阻滯劑和糖肽類抗生素監(jiān)管［3～8］的要求。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

ACQUITYTM超高效液相色譜和Waters XevoTMTQ MS三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC-MS/MS，美國Waters公司）；5418高速離心機（德國Eppendorf公司）；T18均質(zhì)器（德國IKA公司，）；MS3 basic漩渦混合器（德國IKA公司）；N-EVAP 112水浴氮吹儀（美國OA公司）；Milli-Q去離子水發(fā)生器（美國Millipore公司）；20pos固相萃取裝置（美國Waters公司，）；Strata-X-C固相萃取柱（200 mg/3 mL，美國Phenomenex公司）。

β-激動劑（多巴胺、奧西那林、卡布特羅、齊帕特羅、特布他林、沙丁胺醇、西馬特羅、丙卡特羅、瑞普特羅、非諾特羅、賽布特羅、克倫塞羅、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫普羅、福莫特羅、妥布特羅、克倫特羅、溴代克倫特羅、班布特羅、溴布特羅、苯氧丙酚胺、馬布特羅、馬噴特羅、苯乙醇胺A、沙美特羅、噴布特羅），β-阻滯劑（美托洛爾、卡拉洛爾、普萘洛爾），糖肽類抗生素（萬古霉素、去甲萬古霉素），純度均大于98. 0%（德國Dr.Ehrenstorfer公司）。β-葡糖醛酸苷肽酶（98000 unit/mL，美國Sigma公司）；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、異丙醇、甲酸（色譜純，ThermoFisher公司）；HClO4，NaOH，NaCl（分析純，廣州化學試劑廠）。

準確稱取10.0 mg標準物質(zhì)，用甲醇溶解并定容至10.0 mL，配成單標標準儲備液（1.0 mg/mL），-18℃恒溫避光保存。分別吸取適量的單標標準儲備液，用甲醇逐級稀釋成1.0 mg/L的混合標準溶液，置于4℃恒溫避光保存，臨用時，用甲醇稀釋成所需濃度的混合標準工作液。

2.2 樣品提?。?6］

稱取已均質(zhì)的試樣2.0 g于50 mL塑料離心管中，加入8 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH=5.2）和50 μL β-葡糖醛酸苷肽酶，渦旋混勻，37℃振蕩酶解16 h。取出冷卻至室溫，8000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液并加入5 mL 0.1 mol/L HClO4，用HClO4調(diào)節(jié)至pH 1.0±0.2，8000 r/min離心5 min后轉(zhuǎn)移上清液，并用10 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至9.5±0.5，加入2 g NaCl和10 mL乙酸乙酯-異丙醇（6∶4，V/V），渦旋振蕩10 min，8000 r/min離心5 min，收集上清液，40℃水浴氮吹至近干，用5 mL 2%甲酸復(fù)溶殘渣，待凈化。

2.3 樣品凈化

依次用3 mL甲醇、水、2%甲酸溶液活化Strata-X-C固相萃取柱，待凈化液過柱后，依次用3 mL 2%甲酸溶液、甲醇淋洗柱子，負壓抽干，用6 mL 3% 氨水-甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，40℃水浴氮吹至近干，0.1%甲酸甲醇溶液復(fù)溶殘渣并定容至1 mL，過0.22μm濾膜，供UPLC-MS/MS測定。

2.4 測定條件

BEH C18色譜柱（100 mm ×2.1 mm，1.7μm）；流動相：A.0.1%甲酸（體積分數(shù)），B.乙腈，梯度洗脫程序：0.0～1.0 min，95%A；1.0～2.5 min，95%～75%A；2.5～6.0 min，75%～10 A；6.0～7.0 min，10%A；7.0～7.1 min，10% ～95%A；7.1～10 min，95%A。流速：0.25 mL/min；進樣量：2 μL；柱溫：35℃。32種待測物的保留時間見表1。

質(zhì)譜條件：ESI正模式分段掃描，毛細管電壓1.0 kV；離子源溫度150℃；去溶劑氣溫度400℃；去溶劑氣：氮氣，13.3 L/min；錐孔氣：氮氣，0.83 L/min；碰撞氣：高純氬氣，0.15 mL/min；檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；其它質(zhì)譜參數(shù)見表1，離子對駐留時間0.01 s。

3 結(jié)果與討論

3.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)目標物的化學結(jié)構(gòu)，選擇ESI（+）的電離模式，對目標物進行一級質(zhì)譜掃描，β-激動劑和β-阻滯劑可獲得較高響應(yīng)的母離子［M+H］+，糖肽類抗生素則產(chǎn)生雙電荷離子［M+2H］2+。對確定的母離子進行二級質(zhì)譜掃描，通過優(yōu)化碰撞電壓，使選定的特征碎片離子強度達到最大，經(jīng)優(yōu)化的質(zhì)譜條件見表1。根據(jù)目標物的保留時間設(shè)定分段掃描，以增加采集點數(shù)。分析目標物的二級離子碎片可見，β-激動劑和β-阻滯劑產(chǎn)生包括與羥基、叔丁基、異丙基、異丙氨基基團相關(guān)的中性丟失碎片，產(chǎn)生［M+H-18］+、［M+H-56］+、［M+H-74］+等碎片離子；β-阻滯劑結(jié)構(gòu)中均含有-CH2-CH （OH）-CH2-NH-CH-（CH3）2，因此都有m/z=116離子峰。

3.2 液相條件的優(yōu)化

β-激動劑和β-阻滯劑為堿性化合物，萬古霉素和去甲萬古霉素為兩性化合物，實驗比較了BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7μm）、BEH HILIC（100 mm×2.1 mm，1.7μm）和Phenomenex PFP（50 mm×3 mm，2.6μm）色譜柱的分離效果。HILIC柱對含有酚羥基的苯酚型β-激動劑分離效果較好，但其它目標物的峰型較差，部分目標物出現(xiàn)嚴重的拖尾現(xiàn)象，且萬古霉素和去甲萬古霉素的響應(yīng)較低；PFP柱雖能滿足目標物的分離，但沙丁胺醇、苯氧丙酚胺和萊克多巴胺出現(xiàn)色譜峰分裂現(xiàn)象；BEH C18柱以橋式亞乙基雜化硅膠為基質(zhì)，可避免硅醇殘基與目標物的叔胺基發(fā)生氫鍵相互作用而導致色譜峰拖尾、保留時間不穩(wěn)定等現(xiàn)象。因此，本實驗采用BEH C18色譜柱，各目標物的峰型和響應(yīng)都較理想。

表1 32種待測物的保留時間和質(zhì)譜分析條件Table 1 Retention time and MS parameters for the analysis of 32 target compounds

續(xù)表1（Continued to Table 1）

流動相的有機相選擇乙腈，各目標物的響應(yīng)和分離效果比甲醇更理想。水相中加入適當濃度的甲酸（0.1%，V/V），可提高離子化效率。通過優(yōu)化梯度洗脫程序使各目標物的峰型和響應(yīng)值滿足檢測要求。

3.3 提取條件的優(yōu)化

3.3.1 水解方式的選擇動物組織中β-激動劑以游離和軛合物兩種形式存在，其中苯胺型β-激動劑極性中等，軛合反應(yīng)率較低，可直接用溶劑提取；而苯酚型β-激動劑由于含有胺基和酚羥基，極性高，主要以軛合物形式存在，難以被有機溶劑提取，樣品需先水解，使待測物游離。本實驗比較了葡萄糖醛酸酶和5%三氯乙酸的水解效果，結(jié)果表明，酶解和酸解對β-激動劑和β-阻滯劑的加標回收率沒有明顯影響；但對于糖肽類抗生素，酶解的加標回收率更好（酶解為75%～86%，酸解為23%～34%），因此本實驗選擇酶解。

3.3.2 提取溶劑的選擇體系用HClO4沉淀蛋白后，β-激動劑以鹽形式存在，提取前需調(diào)節(jié)體系至堿性，使目標物游離［17］。實驗比較了pH 7～13時，加標20 μg/kg的陰性豬肉基質(zhì)的提取效率（見圖1）。結(jié)果表明，對于苯胺型β-激動劑（圖1A），當pH=8～12時，提取效率均大于75%；對于苯酚型β-激動劑（圖1B），尤其是特布他林等二酚型藥物，只有在pH 9～10間提取效率才能高于80%；對于其它目標物（圖1C），當pH＜10時，提取效率受溶液pH值影響較小。因此，為獲得滿意的提取效率，提取前先調(diào)節(jié)體系至pH 9.5±0.5。

圖1 目標物在不同pH值條件下的萃取效率Fig.1 Extraction effect of target compounds at different pH value

實驗比較了10mL乙酸乙酯（EtAC）、乙酸乙酯-異丙醇（EtAC-IPA，6∶4，V/V）和乙酸乙酯-叔丁基甲醚（EtAC-MTBE，5∶54，V/V）作為提取溶劑對加標20 μg/kg的陰性豬肉樣品的提取效率（見圖2），結(jié)果表明，異丙醇-乙酸乙酯的提取效率優(yōu)于其它兩種溶劑，尤其對沙丁胺醇、特布他林等強極性化合物。因此，本實驗采用乙酸乙酯-異丙醇（6∶4，V/V）作為提取溶劑。提取前在體系中加入NaCl至飽和，可防止體系乳化，促進水相和有機相的分層。

圖2 不同溶劑對目標物（20μg/kg）的提取效率，體系pH=9.5±0.5Fig.2 Extraction effects of different kinds of solvent.Spiked concentration of targets（20 μg/kg），pH 9.5±0.5

3.4 凈化條件的選擇

比較了固相萃取柱Oasis HLB（Waters，150 mg/3 mL）、Strata-X-C（Phenomenex，200 mg/3 mL）和AROMATIC SULFONIC ACID（J.T Baker，200 mg/3 mL）對加標20 μg/kg的陰性豬肉樣品的凈化回收率（見圖3）。結(jié)果表明，糖肽類抗生素在HLB柱的回收率最好，β-激動劑和β-阻滯劑經(jīng)Strata-X-C凈化后的總體回收率最理想。Strata-X-C是混合型陽離子交換反相柱，在酸性條件下，具有苯乙醇胺母核結(jié)構(gòu)的β-激動劑和β-阻滯劑能與H+結(jié)合形成陽離子，被Strata-X-C柱的填料吸附，從而具有較高的選擇性，回收率都較好。因此，綜合考慮，本實驗采用Strata-X-C柱進行凈化。

圖3 目標物（20 μg/kg）經(jīng)不同固相萃取柱凈化的回收率。淋洗液：HLB柱為2%甲酸-甲醇，Strata-X-C 和Aromatic Sulfonic Acid柱為3%氨水-甲醇溶液Fig.3 Recoveries of target compounds（20 μg/kg）after purification with different SPE cartridges.Eluent：methanol with 2%formic acid for HLB column，methanol with 3%ammonium hydroxide for Strata-X-C and Aromatic sulfonic acid columns

3.5 線性關(guān)系，方法檢出限、回收率與精密度

本實驗采用Matusewaki等建立的基質(zhì)效應(yīng)確認方法［18］顯示存在基質(zhì)增強效應(yīng)，因此采用基質(zhì)匹配校準曲線進行定量分析。用陰性豬肉樣品基質(zhì)提取液配制系列基質(zhì)匹配標準工作液，其中多巴胺、瑞普特羅、萬古霉素和去甲萬古霉素的濃度為10，20，50，100，200和500 μg/L，其它目標物的濃度為5，10，20，50，100和200 μg/L，按優(yōu)化的儀器條件進行檢測，以質(zhì)量濃度為橫坐標（x），目標物定量離子對峰面積為縱坐標（y）作標準曲線，得到各目標物的線性方程和相關(guān)系數(shù)（R2），并計算方法檢出限（LOD，S/N=3）。32種目標物的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。結(jié)果表明，各目標物線性相關(guān)系數(shù)大于0.995。多巴胺、瑞普特羅、萬古霉素和去甲萬古霉素的線性范圍為10～500 μg/L，方法檢出限為5 μg/kg，其它目標物的線性范圍為5～200 μg/L，方法檢出限為3 μg/kg，能滿足限量檢測［6，7］要求。

取陰性豬肉樣品進行2個水平的加標回收實驗，6次平行實驗的結(jié)果見表2。各目標物的平均回收率為83.6%～103%；相對標準偏差（RSD，n=6）為3.9%～10.4%，日間精密度為4.5%～9.8%。

表2 回收率和精密度測定結(jié)果Table 2 Determination results of recoveries and precisions

續(xù)表2（Continued to Table 2）

3.6 實際樣品的分析

采用本方法測定了當?shù)厥袌鲣N售的豬、牛、羊、雞肌肉各5例，均未檢出上述32種目標化合物。

4 結(jié)論

本實驗建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）同時測定動物肌肉中27種β-激動劑、3種β-阻滯劑和2種糖肽類抗生素殘留的方法，樣品經(jīng)酶解、蛋白沉淀后，以乙酸乙酯-異丙醇（6∶4，V/V）混合溶液提取，Strata-X-C固相萃取凈化，通過優(yōu)化色譜、質(zhì)譜條件，獲得較高的靈敏度和準確度，本方法回收率和精密度良好，適用于動物肌肉中β-激動劑、β-阻滯劑、糖肽類抗生素的同時測定。

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4 Ministry of Agriculture.No.1519 Bulletin of the Ministry of Agriculture of the People′s Republic of China.http：//www. moa.gov.cn/zwllm/tzgg/gg/201104/t20110422＿1976294.htm

農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第1519號.

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7 Commission Regulation（EU）37/2010

8 Ministry of Agriculture.No.1519 Bulletin of the Ministry of Agriculture of the People′s Republic of China.http：//www. moa.gov.cn/zwllm/tzgg/gg/200511/t20051117＿496523.htm

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河豚魚和鰻魚中阿莫西林、氨芐西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、雙氯西林殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法.中華人民共和國國家標準.GB/T 22952-2008

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The work was supported by the International Science and Technology Cooperation Projects of National（No.2013DFH30070）

Analysis of 32 Kinds of β-Agonists，β-Blockers and Glycopeptide Antibiotics in Animal Meat by UPLC-MS/MS

HAN Wan-Qing，WU Chu-Sen，WU Yu-Luan，DONG Hao，WANG Li，WANG Bin，XIAN Yan-Ping，LUO Hai-Ying*
（Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute，National Centre for Quality Supervision and Testing of Processed Food（Guangzhou），Guangzhou Key Laboratory of Detection Technology for Food Safety，Guangzhou Research Centre of Risk Dynamic Detection and Early Warning for Food Safety，Guangzhou 510000，China）

A high-throughput method was established for the simultaneous determination of 27 kinds of β-agonists，3 kinds of β-blockers and 2 kinds of glycopeptide antibiotics in animal meat by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）.The sample underwent enzymolysis and the protein precipitation treatment was extracted with a mixture of ethyl acetate-isopropanol （6∶4，V/V），and cleaned up at a Strata-X-C solid phase extraction cartridge.The 32 targets were separated on a Waters BEH C18column by gradient elution with acetonitrile-0.1%formaic acid as mobile phase，ionized with positive electrospray ionization（ESI+），detected under multiple reaction monitoring mode，and quantified with external standard method.The results showed that the target compounds displayed excellent linearity in the concentration of 5-500 μg/L with correlation coefficients larger than 0.995.The limits of detection were 5 μg/kg for dopamine，reproterol，vancomycin and norvancomycin，and were 3 μg/kg for the others.The average recoveries were in the range of 83.6%-103.0%at two spiked levels.The intra-day RSDs were ranged from 3.9%to 10.4%，and the inter-day RSDs were no more than 9.8%.The developed method was accurate and sensitive，and was suitable for the high-throughput quantitative and qualitative analysis of β-agonists，β-blockers and glycopeptide antibiotics in animal meat.

β-Agonist；β-Blocker；Glycopeptide antibiotic；Animal meat；Ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

20 October 2015；accepted 13 November 2015）

10.11895/j.issn.0253-3820.150830

2015-10-20收稿；2015-11-13接受

本文系國家科技部港澳臺科技合作專項基金資助（No.2013DFH30070）

*E-mail：tio2yy@126.com