三重PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）檢測雞肉中常見病原菌的研究

潘彤媛，張偉

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000）

三重PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）檢測雞肉中常見病原菌的研究

潘彤媛，張偉*

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000）

建立雞肉中常見3種致病菌即小腸耶爾森氏菌、大腸桿菌O157：H7和沙門氏菌的多重PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）檢測方法。方法：分別選擇小腸耶爾森氏菌、沙門氏菌和大腸桿菌O157：H7基因組中高特異性的ail基因、invA基因和ECs3032，設(shè)計并篩選具有高特異性的引物用于PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）擴(kuò)增。建立一種此3種致病菌的三重PCR檢測方法，并通過人工污染實(shí)驗(yàn)對該法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：3對引物能特異地擴(kuò)增出251、347、469 bp的目的條帶；靈敏度：對這3種致病菌的單菌培養(yǎng)物檢測靈敏度均為101CFU/mL。同時檢測3種菌的靈敏度為103CFU/mL。結(jié)論：該檢測方法高效、精確、特異性強(qiáng)、靈敏度高，6 h～8 h內(nèi)可同時快速檢測多種致病菌，節(jié)省了大量時間。在實(shí)際檢測中具有很好的實(shí)用價值和開發(fā)前景，可在食品檢測和臨床檢驗(yàn)等領(lǐng)域大力推廣。

多重PCR；小腸耶爾森氏菌；大腸桿菌O157：H7；沙門氏菌

食品安全問題一直是一個世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生安全問題。食源性疾病更是越來越引起國際社會的廣泛關(guān)注。導(dǎo)致食源性疾病感染的因素大致可以分為兩大類，一類是食物中毒以及農(nóng)藥超標(biāo)，不合理使用添加劑等，另一類是食品致病菌污染造成的。后者感染者集中，數(shù)量大，占食源性疾病感染者的70%。且微生物在環(huán)境中廣泛存在、不宜發(fā)現(xiàn)，這就導(dǎo)致了致病因素是不可避免的，只能通過有效檢測手段控制致病菌污染。因此，檢測與鑒定食品中病原微生物顯得尤為重要。

沙門氏菌、小腸耶爾森氏菌和大腸桿菌O157：H7是常見的引起肉制品污染的重要致病菌[3]?？赏ㄟ^日常飲食導(dǎo)致人類細(xì)菌性食物中毒，感染疾病。傳統(tǒng)的國標(biāo)檢測法一直被認(rèn)為是病原菌檢測方法的金指標(biāo)。但費(fèi)時費(fèi)力，一般需4 d～7 d。近年來興起的PCR技術(shù)以其特異性強(qiáng)、敏感性好，方便、快速等優(yōu)點(diǎn)逐漸應(yīng)用于食品藥品醫(yī)學(xué)等檢驗(yàn)領(lǐng)域。但PCR方法每次試驗(yàn)只能特異性的檢測一種病原菌，而實(shí)際樣品中往往存在種類繁多的病原細(xì)菌，涉及不同種和型別。多重PCR是在普通PCR基礎(chǔ)上針對這一不足改進(jìn)并發(fā)展起來的，在同一個反應(yīng)中同時完成多個基因擴(kuò)增的一種快捷檢測方法[1]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

收集了小腸耶爾森桿菌（CMCC52302）、腸炎沙門氏菌（CMCC50041）、出血性大腸埃希氏菌EHEC O157：H7（IQCC10102）、金黃色葡萄球菌（ATCC14458）、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（CMCC54001）、副溶血性弧菌（CMCC20001）、阪崎腸桿（ATCC29544）、普通變形桿菌（CMCC49027）、福氏志賀氏菌（CMCC51571）、肉毒梭菌（CMCC64451）、蠟樣芽孢桿菌（CMCC63302）共 11株菌。均來源于中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心；

1.1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀：Whatman T Gradient基因擴(kuò)增儀；電泳儀（DXY-33A型）：北京市六一廠生產(chǎn)；凝膠成像系統(tǒng)（UviteeBTS-20.M型）：英國UVItec公司。

1.1.3 引物及目的基因的選擇

引物由上海生工生物工程公司合成；引物序列如表1。

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌同時快速增殖

將所選菌株接種在LB肉湯斜面培養(yǎng)基，放置于36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h～18 h使其增殖[2]。

1.2.2 靶基因選取與引物設(shè)計

根據(jù)國內(nèi)外現(xiàn)有文獻(xiàn)報道[3-7]，小腸耶爾森氏菌的ail基因、沙門氏菌的invA基因和大腸桿菌O157：H7基因組中的ECs3032序列[3]是具有高特異性的基因序列，用引物設(shè)計軟件Primer 5.0，分別設(shè)計1對引物，由上海生工合成。

1.2.3 DNA模板的制備

采用基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 聚合酶鏈反應(yīng)

1.2.4.1 多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系確立及條件優(yōu)化

針對多重PCR關(guān)鍵影響因素，先設(shè)計正交實(shí)驗(yàn)大致確定其擴(kuò)增條件的范圍，再用單實(shí)驗(yàn)因素對多重PCR反應(yīng)體系及循環(huán)參數(shù)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，以確定該三重PCR的最佳反應(yīng)體系[8]。

1.2.4.2 特異性檢測

分別提取其它11株菌株的基因組DNA，添加3對引物和最佳反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，后用瓊脂糖凝膠（2%）電泳檢測。

1.2.4.3 靈敏度試驗(yàn)

將3種致病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種至LB液體培養(yǎng)基中36℃增菌24 h，用生理鹽水對菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋，得到10-1～10-7倍稀釋的菌液。同時采用稀釋平板計數(shù)法，測定其純培養(yǎng)物活菌數(shù)；每個稀釋度分別取1 mL菌液采用試劑盒法提取細(xì)菌基因組DNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.2.4.4 人工污染試驗(yàn)

將沙門氏菌、小腸耶爾森氏菌和大腸桿菌O157：H7接種至LB液體培養(yǎng)基36℃增菌24 h分別以1∶9的比例接種到從當(dāng)?shù)爻匈徺I的雞肉制成的生理鹽水勻漿中。該雞肉經(jīng)國標(biāo)法檢測證實(shí)不含有沙門氏菌、小腸耶爾森氏菌和大腸桿菌O157：H7。用生理鹽水將雞肉勻漿人工污染后再進(jìn)行10倍梯度稀釋，此稀釋菌液中取1 mL加入至9 mL的滅菌生理鹽水中制成梯度稀釋度滅菌雞肉勻漿。

2 結(jié)果

2.1 三重PCR擴(kuò)增最佳反應(yīng)體系確立

最終確定PCR反應(yīng)體系包括：10×PCR buffer 2.5 μL，Mg2+（25 mmol/L）1.5 μL，模板1.5 μL，dNTPs（25 mmol/L）2 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各 1.4 μL，ddH2O 補(bǔ)齊至 25 μL。預(yù)變性94℃ 5 min；變性 94℃1 min、退火 54.1℃ 1 min、延伸72℃2 min，共進(jìn)行30個循環(huán)；72℃延伸10 min；于4℃下保存。

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

采用試劑盒提取11株致病菌的基因組DNA，并進(jìn)行隨機(jī)3株混合，按優(yōu)化后的最佳PCR反應(yīng)條件擴(kuò)增，產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠（2%）電泳檢測，結(jié)果如圖1。

結(jié)果顯示，3株目的菌均出現(xiàn)特異性條帶，其它非目的菌均未出現(xiàn)特異性條帶。

擴(kuò)增結(jié)果分別為251、347、469 bp的產(chǎn)物片段與預(yù)期大小吻合。測序結(jié)果顯示：沙門氏菌擴(kuò)增片段經(jīng)與GenBank中invA基因序列比對，同源性達(dá)到99.15%；大腸桿菌 O157：H7擴(kuò)增片段經(jīng)與 GenBank中ECs3032基因序列nuc比對，同源性達(dá)99.71%；小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌擴(kuò)增片段經(jīng)與GenBank中ail基因序列比對，同源性達(dá)到97.61%?？梢娺@套PCR引物具有很好的特異性。

圖1 多重PCR反應(yīng)特異性Fig.1 The specificity of multiplex PCR

2.3 三重PCR的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 三重PCR檢測單一菌株的靈敏度

將培養(yǎng)好的沙門氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和大腸桿菌O157：H7菌液分別進(jìn)行梯度稀釋，再提取模板DNA單獨(dú)進(jìn)行三重PCR的擴(kuò)增，確定三重PCR檢測單一致病菌的靈敏度。結(jié)果由圖2～圖4所示，三重PCR檢測這3種菌株中單菌菌液的靈敏度均為101CFU/mL。

圖2 沙門氏菌的單重PCR靈敏度Fig.2 The PCR sensitivity of Salmonella

圖3 大腸桿菌O157：H7的單重PCR靈敏度Fig.3 The PCR sensitivity of E.coli O157：H7

圖4 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的單重PCR靈敏度Fig.4 The PCR sensitivity of Yersinia enterocolitica

2.3.2 三重PCR檢測3種病原菌的靈敏度

選取的3種病原菌36℃培養(yǎng)過夜，菌液等體積混合后，制成系列梯度稀釋液，提取基因組DNA按優(yōu)化好的三重PCR最佳反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，確定三重PCR同時檢測3種致病菌的靈敏度。結(jié)果如圖5所示，同時檢測3種致病菌的靈敏度為103CFU/mL。

2.3.3 人工污染樣品確定檢出限

對本地市場購買的雞肉加熱滅菌，PCR檢測沙門氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、大腸桿菌O157：H7三種病原菌，顯示陰性。人工添加菌液進(jìn)行多重PCR檢測，結(jié)果顯示：建立的三重PCR檢測方法能有效地擴(kuò)增出沙門氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、大腸桿菌O157：H7三種病原菌的目的基因片段，如圖6所示。

圖5 多重PCR的靈敏度結(jié)果Fig.5 The PCR sensitivity of multiplex PCR

人工添加經(jīng)增殖培養(yǎng)后并驗(yàn)證活菌數(shù)的菌液于該雞肉樣品，結(jié)果顯示最低檢出的樣品分別為：沙門氏菌和大腸桿菌O157：H7為103CFU/mL的樣品，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌可達(dá)102CFU/mL的樣品。

3 結(jié)論與討論

本研究，旨在建立一種三重PCR檢測沙門氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和大腸桿菌O157：H7的方法。選擇檢測目的基因直接影響PCR的特異性和敏感性，引物的設(shè)計并篩選更是決定PCR試驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵性因素[9-12]，好的引物可以降低和避免背景及非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生。本試驗(yàn)以介導(dǎo)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的侵襲性的黏附侵襲位點(diǎn)基因[6]的ail基因、只存在于致病性沙門菌中的獨(dú)特保守基因序列[5]—invA基因和大腸桿菌O157：H7基因組中的ECs3032序列[4]為目的基因（有試驗(yàn)表明大腸桿菌O157：H7基因組中的ECs3032序列是具有種群特異性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子序列[4]），故本次試驗(yàn)采用此序列設(shè)計引物。

本研究建立的沙門氏菌、大腸桿菌O157：H7和小腸耶爾森氏菌多重PCR檢測方法，實(shí)現(xiàn)了在同一個反應(yīng)中同時完成多個基因的擴(kuò)增。該檢測方法高效、精確、特異性強(qiáng)、靈敏度高，在日常食品檢測中，具有很好的實(shí)用價值。

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Multiple PCR Rapid Detection for Three Pathogenic Bacteria in Chicken

PAN Tong-yuan，ZHANG Wei*

（College of Food Science and Technology of Hebei Agricultural University，Baoding 071000，Hebei，China）

A multiplex PCR method to detecte the Yersinia enterocolitica，E.coli O157：H7 and Salmonella in chicken meat was Established.The ail gene sequence of Yersinia enterocolitica，the ECs3032 gene sequence of E.coli O157：H7 and the invA gene sequence of Salmonella were designed for primers and chose the high specific primers.A multiplex PCR method and demonstrated the method by artificial contamination experiments was Established.The primers amplified 251bp,347bp,469bp target band specifically.The sensitivity of single bacterial detection was 101CFU/mL.The sensitivity of all bacterial was 103CFU/mL.The method was efficient,accurate,high specificity and sensitivity.The method which detect a variety of pathogens costs 6 h-8 h and saves a lot of time.The method had good practical value and development future in the actual testing.It should promote vigorously in the field of food testing and clinical examination.

multiple PCR；Yersinia enterocolitica；E.coli O157：H7；Salmonella

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.14.036

潘彤媛（1987—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品安全。

*通信作者：張偉，教授，碩士生導(dǎo)師。

2016-01-03