UPLC-MS/MS法測定乳品中L-羥脯氨酸的含量

黃蓓蓓

（三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南三門峽472000）

UPLC-MS/MS法測定乳品中L-羥脯氨酸的含量

黃蓓蓓

（三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南三門峽472000）

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）測定乳制品中L-羥脯氨酸的含量。試樣經(jīng)牛蛋白酶酶解，乙腈萃取，HLB固相萃取柱凈化后，UPLC BEH C18色譜柱分離，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，定量離子對（m/z）：132.1/86.2；定性離子對（m/z）：132.1/68.3。結(jié)果表明：L-羥脯氨酸加標(biāo)回收率在94.53%～98.42%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于7.3%；按信噪比RSN=10計(jì)算，方法定量限（LOQ）為5.0μg/kg。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；L-羥脯氨酸；乳制品；測定

動物水解蛋白是由動物皮革及其制品下腳料等水解得到的蛋白質(zhì)，長期誤食，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)疏松、腫大，造成重金屬中毒。2009年衛(wèi)生部公布《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單（第二批）》中明確規(guī)定：乳及乳制品、含乳飲料中不得添加水解動物蛋白。然而部分違規(guī)企業(yè)為降低生產(chǎn)成本，經(jīng)常會在鮮奶、奶粉等乳品中摻入動物水解蛋白，以期提高乳品中蛋白質(zhì)含量，這嚴(yán)重影響了乳品加工企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量，威脅消費(fèi)者人身健康，尤其是嬰幼兒、孕產(chǎn)婦、病人等特殊人群。L-羥脯氨酸是動物水解蛋白中特征性氨基酸，約占膠原蛋白氨基酸總量的10%，而乳蛋白質(zhì)中不含L-羥脯氨酸[1]。為此，L-羥脯氨酸已作為檢測乳及乳制品中是否非法摻入動物水解蛋白的重要標(biāo)示物。

目前，國內(nèi)外對L-羥脯氨酸的檢測方法主要有分光光度法[2]、液相色譜法[3]、氨基酸分析儀法[4]、毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測法[5]等，而這幾種方法存在樣品前處理復(fù)雜，特異性、靈敏度、準(zhǔn)確度較差等缺點(diǎn)；而液相色譜-質(zhì)譜法是通過液相色譜將待測樣品中的有機(jī)物分離，再利用質(zhì)譜對分開的有機(jī)物逐個的分析，得到有機(jī)物分子量、結(jié)構(gòu)和濃度等信息，顯著提高了檢測方法的準(zhǔn)確度、靈敏度。但目前關(guān)于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）測定乳制品中L-羥脯氨酸含量的相關(guān)研究較少。本文以乳制品為研究對象，探索超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定乳制品中L-羥脯氨酸含量的分析方法，為乳制品行政監(jiān)督部門、檢測機(jī)構(gòu)、乳制品加工企業(yè)提供實(shí)際的檢測方法參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（Waters Acquity UPLC Quattro Premier XE）：美國沃特世公司；電子分析天平（XS-205型）：賽多利斯北京有限公司；超純水器（Milli-Q型）：美國Millipore公司；有機(jī)微孔濾膜（0.22 μm）：島津企業(yè)管理（中國）有限公司；固相萃取裝置（DG-24B型）：美國Supelco公司。

L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/mL）：準(zhǔn)確稱取L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品100 mg（精確至0.1 mg），用0.01 mol/L鹽酸溶解并定容至100 mL，-4℃以下避光保存。

奶粉、酸奶、鮮奶：購自當(dāng)?shù)爻?。所用試劑除特別標(biāo)注外均為分析純試劑，水為超純水。L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（L-Hydroxyproline，C5H9NO3，CAS：51-35-4），純度≥99.5%：購自美國SIGMA公司；乙腈、甲醇、正己烷（色譜純）：德國默克公司；氮?dú)?、氬氣（純度?9.99%）：張家口市宣化燕山氣體有限公司；HLB固相萃取小柱（200 mg/3 mL）：美國Waters公司。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）色譜柱；流動相A：乙腈；流動相B：0.1%甲酸水溶液；流速：0.2 mL/min；柱溫：30℃；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of the mobile phase

1.2.2 質(zhì)譜條件

電離方式：電噴霧電離，正離子模式，ESI（+）；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣：氮?dú)猓?00 L/h，350 ℃；錐孔氣：氮?dú)猓?5 L/h；碰撞氣：氬氣；噴霧電壓：2.5 kV；定性離子對（m/z）：132.1/68.3；定量離子對（m/z）：132.1/86.2；錐孔電壓：20 V；碰撞電壓：25 V。

1.3 樣品前處理

稱取固態(tài)試樣2 g（精確至0.01 g）置于50 mL塑料離心管中，100 mmol/L甲酸銨緩沖鹽溶液5 mL，牛蛋白酶液50 μL，漩渦混合2 min，50℃下酶解3 h后，加入5 mL乙腈，渦旋振蕩2 min，以10 000 r/min離心5 min，上清液用HLB小柱凈化，待自然流干后，用0.1%甲酸-乙腈4 mL清洗上述離心管，并將清洗液依次過柱，收集全部流出液體，35℃水浴氮?dú)獯抵两?，?zhǔn)確加入1.0 mL乙腈-甲酸水溶液超聲2 min后再渦旋溶解，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

稱取相同基質(zhì)的空白試樣6份，每份2 g，分別加入適量的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，制備成含L-羥脯氨酸濃度依次為 5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/kg 的樣品，按 1.2 和1.3節(jié)進(jìn)行操作，以特征離子色譜峰面積為縱坐標(biāo)，L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

L-羥脯氨酸是弱酸性化合物，故采用正離子模式掃描。用乙腈將L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成濃度均為1.0 μg/mL的單標(biāo)溶液，用蠕動泵以10 μg/mL的流速，將L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液注入質(zhì)譜檢測器中，進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描，得到m/z為132.1的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+，優(yōu)化錐孔電壓等參數(shù)使分子離子峰達(dá)到最大強(qiáng)度；對分子離子峰進(jìn)行碰撞碎裂優(yōu)化，選擇多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式采集，離子源溫度為150℃，碰撞氣為氬氣，錐孔電壓為25 V，碰撞電壓為25 V，對分子離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析（子離子掃描），得到較多的碎片離子信息（圖1），定量離子對為m/z 132.1/86.2；定性離子對（m/z）為132.1/68.3。在上述質(zhì)譜條件下，L-羥脯氨酸多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖峰型對稱尖銳，峰型良好，未見明顯的干擾峰（圖2）。

2.2 UPLC色譜條件的優(yōu)化

本試驗(yàn)采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）色譜柱分析，考察了不同比例的乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水作為流動相時，色譜圖基線、L-羥脯氨酸響應(yīng)值、峰型、與干擾雜質(zhì)峰的分離度等因素，試驗(yàn)表明：在水溶液中加入少量甲酸有助于L-羥脯氨酸的離子化，響應(yīng)值更高；乙腈-0.1%甲酸水溶液體系能較好的分離L-羥脯氨酸峰，經(jīng)優(yōu)化篩選獲得較佳的流動相梯度洗脫程序（表1），分離度大于1.5、基線平穩(wěn)、出峰時間適中，半峰寬窄、峰型對稱尖銳（圖2），并且由于使用0.1%甲酸而抑制水相中微生物的滋生，延長了流動相使用期限。故選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相。

圖1 L-羥脯氨酸二級質(zhì)譜掃描圖Fig.1 Two-stage scan spectra of L-Hydroxyproline

圖2 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜-質(zhì)譜圖Fig.2 Chromatography of L-Hydroxyproline by performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

2.3 提取溶劑的選擇

不同溶劑對L-羥脯氨酸提取效果的影響見表2。

表2 不同溶劑對L-羥脯氨酸提取效果的影響（n=6）Table 2 Effects of different solvent on L-Hydroxyproline extraction（n=6）

從表2中可知：二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯、環(huán)己烷等4種試劑均可提取乳制品中的L-羥脯氨酸，其中乙酸乙酯和環(huán)己烷萃取時會帶入大量脂溶性雜質(zhì)和干擾峰，且無法萃取已溶于水相中的部分L-羥脯氨酸，造成L-羥脯氨酸部分提取，引起提取率不高；乙腈可提取乳制品試樣中4-HR，且雜質(zhì)干擾峰較少，故本文選擇乙腈作為提取溶劑。

2.4 凈化方式的選擇

為獲得較好的凈化效果及回收率，本文考察了液液萃取、分散固相萃取、固相萃?。–18柱、中性氧化鋁柱、HLB柱、石墨化碳粉柱、氨基柱、二醇柱等）3種凈化方式對乳制品中L-羥脯氨酸含量測定的影響見表3。

表3 不同凈化方式條件下的加標(biāo)回收率（n=6）Table 3 The recoveries under different purification conditions（n=6）

從表3中可知：采用分散固相萃取法與固相萃取法，L-羥脯氨酸回收率均較高，尤其是HLB固相萃取小柱凈化效果最佳，回收率高達(dá)96.7%，且雜質(zhì)干擾峰少；而采用液液萃取法，L-羥脯氨酸回收率約80%左右，明顯低于采用分散固相萃取法與固相萃取法。故最終凈化方式選擇HLB固相萃取。

2.5 方法線性范圍、檢出限和定量限

稱取基質(zhì)相同的空白試樣6份，每份2 g，分別加入適量的標(biāo)準(zhǔn)工作液，制備成L-羥脯氨酸終濃度依次為 5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/kg 的待測樣，按 1.2 和1.3節(jié)進(jìn)行測定（表4）。

表4 線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限（n=6）Table 4 Linear equation，correlation coefficient，the detection limit and quantitation limit（n=6）

從表4中可知：在不同乳制品中L-羥脯氨酸在5.0 μg/kg～100.0 μg/kg 范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）在 0.998 6～0.999 7之間；按信噪比 RSN＝ 10計(jì)算，方法定量限（LOQ）為5.0 μg/kg，滿足國內(nèi)乳制品中L-羥脯氨酸限量的檢測要求。

在乳制品中依次添加終濃度為5.0、10.0、50.0 μg/kg的L-羥脯氨酸，每個水平設(shè)6個平行，L-羥脯氨酸的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表5。

從表5中可知：在3種乳制品基質(zhì)中，敵百蟲的平均加標(biāo)回收率為94.53%～98.42%，精密度（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD）為 3.7% ～7.3%。

表5 回收率和精密度（n=6）Table 5 Recovery and precision（n=6）

2.6 實(shí)際樣品的測定

隨機(jī)選取30份市售乳制品，采用本文所建立的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法法測定乳制品中L-羥脯氨酸的含量。檢測結(jié)果表明：30份乳制品中，L-羥脯氨酸的含量有所差異，檢出率為6.7%，即2個樣品中檢測出含有L-羥脯氨酸的成份，可判定這2個廠家可能在乳制品中摻入廉價的水解動物蛋白來冒充或替代乳蛋白質(zhì)，以提高乳制品中蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，從而降低成本；而這些摻入的水解動物蛋白可能會影響乳制品風(fēng)味和口感，且因L-羥脯氨酸不易消化，造成營養(yǎng)價值降低，導(dǎo)致人體吸收利用率下降，影響消費(fèi)者的人身健康安全。因此，為了確保乳制品質(zhì)量安全和維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，相關(guān)行政部門有必要加強(qiáng)對乳制品中L-羥脯氨酸行政監(jiān)督與日常監(jiān)測。

3 結(jié)論

動物水解蛋白是由動物皮革及其制品下腳料等水解得到的蛋白質(zhì)，長期誤食，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)疏松、腫大，造成重金屬中毒，目前L-羥脯氨酸已作為檢測乳及乳制品中是否非法摻入動物水解蛋白的重要標(biāo)示物。本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，將試樣經(jīng)牛蛋白酶酶解，乙腈萃取，HLB固相萃取柱凈化后，UPLC BEH C18色譜柱分離，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，定量離子對（m/z）：132.1/86.2；定性離子對（m/z）：132.1/68.3。結(jié)果表明：L-羥脯氨酸加標(biāo)回收率在94.53%～98.42%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于7.3%；按信噪比RSN＝10計(jì)算，方法定量限（LOQ）為5.0 μg/kg。該方法準(zhǔn)確度高、靈敏度好、穩(wěn)定性強(qiáng)，將為乳制品行政監(jiān)督部門、第三方檢測機(jī)構(gòu)、乳制品加工企業(yè)提供實(shí)際的檢測方法指導(dǎo)。

[1] 李景紅,孟祥晨.高效液相色譜法檢測牛乳中摻加的膠原水解蛋白[J].中國乳品工業(yè),2008,36(11)：56-59

[2] 趙天珍,袁秀金,譚貴良,等.比色法快速測定奶粉和含乳飲料中游離L-羥脯氨酸[J].食品研究與開發(fā),2008,29(12)：111-113

[3] 胡華,呂定,杜青,等.高效液相色譜法檢測醬油中羥脯氨酸的含量[J].中國調(diào)味品,2010,35(4)：106-109

[4] Peter Bohlen,Michel Mellet.Automated fluorometric amino acid analysis：The determination of proline and hydroxyproline[J].Analytical Biochemistry,1979,94(2)：313-321

[5] 鄒曉莉,周春艷,黎源倩.毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測肌腱和肌腱細(xì)胞中的羥脯氨酸[J].分析化學(xué),2006,34(10)：1441-1444

Determination of L-Hydroxyproline in Dairy Products by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

HUANG Bei-bei
（Sanmenxia Polytechnic，Sanmenxia 472000，Henan，China）

A method for determining the residues of L-Hydroxyproline in dairy products was established by an ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry.Samples was enzymatic digest of bovine，and ultrasonic extracted with ethyl acetate，and purified with HLB solid phase extraction cartridge，and separated by UPLC BEH C18column，and quantitative analysis was performed by the multi-reaction-monitoring（MRM）mode.The qualitative ion pair （m/z）was 132.1/86.2；the quantitative ion pair （m/z）was 132.1/68.3.The results showed that the recoveries were between 94.53%-98.42%，and the relative standard deviation were less than 7.3%；according to RSN=10，the limit of quantificationn was 5.0 μg/kg.

ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry；L-Hydroxyproline；dairy products；determination

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.14.032

黃蓓蓓（1981—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品分析與發(fā)酵工程。

2016-02-18