雷奈酸鍶對卵巢切除大鼠BMSCs成骨分化及BMP-2表達的影響

劉小坡，馮云波，李曉麗，曹國龍，張　沛

(河北省唐山市工人醫(yī)院：1骨外科；2.老年病科；3.神經(jīng)內(nèi)科　063000)

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雷奈酸鍶對卵巢切除大鼠BMSCs成骨分化及BMP-2表達的影響

劉小坡1，馮云波1，李曉麗2，曹國龍1，張沛3

(河北省唐山市工人醫(yī)院：1骨外科；2.老年病科；3.神經(jīng)內(nèi)科063000)

目的探討雷奈酸鍶(SR)對卵巢切除大鼠骨髓基質(zhì)干細胞成骨分化及骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)表達的影響。方法3月齡SD大鼠24只，分別接受假手術(shù)(Sham組，n=8)和雙側(cè)卵巢切除(OVX，n=16)手術(shù)，術(shù)后8周OVX大鼠分為2組，分別接受安慰劑(OVX+V組)或SR(0.9 g·kg-1·d-1，OVX+SR組)治療 3個月。實驗結(jié)束后處死所有大鼠，檢測第4腰椎骨密度、最大載荷、彈性模量等生物力學性能，取股骨和脛骨骨髓細胞進行體外培養(yǎng)并向成骨細胞誘導(dǎo)分化，第25天共聚焦顯微鏡觀察BMP-2的表達及分布，第28天提取細胞RNA及蛋白，RT-PCR及Western blot 法檢測BMP-2的表達，細胞培養(yǎng)第32天von kossa 染色觀察細胞外基質(zhì)礦化能力。結(jié)果(1)骨密度：OVX+V組顯著低于Sham組和OVX+SR組(P<0.05)，OVX+SR組顯著低于Sham組。(2)最大載荷：OVX+V組顯著低于OVX+SR組(P<0.05)，OVX+SR組顯著低于Sham組(P<0.05)；彈性模量：OVX+V組顯著低于Sham組和OVX+SR組(P<0.05)。(3)共聚焦顯微鏡觀察各組細胞BMP-2的表達及胞內(nèi)分布無明顯差異。(4)RT-PCR及Western blot 法檢測BMP-2在各組的表達差異無統(tǒng)計學意義。(5)von kossa 染色觀察各組礦化面積百分比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論SR可部分改善卵巢切除大鼠骨量丟失和力學性能，對其骨髓基質(zhì)干細胞體外成骨分化能力及BMP-2的表達無顯著影響。

卵巢切除術(shù)；骨質(zhì)疏松；骨密度；雷奈酸鍶；骨髓基質(zhì)干細胞；骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2

隨著我國人口老齡化的加劇，骨質(zhì)疏松等骨關(guān)節(jié)退行性疾病的發(fā)病率呈現(xiàn)快速上升的趨勢[1]，選擇行之有效的干預(yù)措施顯得愈發(fā)重要。雷奈酸鍶(SR)由一個有機酸及兩個非放射性鍶原子組成。研究表明，SR同時具有促進成骨細胞增殖和抑制破骨細胞活性的雙重生理功能，進而表現(xiàn)出既能促進骨形成，又可以抑制骨吸收的雙重功效[2-4]。已有臨床和基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，SR對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松具有一定的療效[5]，但作用機制尚有待進一步研究。

骨髓基質(zhì)干細胞(BMSCs)具有多向分化潛能[6-7]，其成骨分化能力可影響甚至決定骨量及骨骼的力學性能。因此，BMSCs可以用來篩選促進骨形成藥物或探索個別干預(yù)措施促進骨形成的作用機制。本研究擬通過去勢手術(shù)建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠模型，并分別給予一定劑量的SR干預(yù)，在驗證SR對雌激素衰退誘導(dǎo)的大鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型骨密度、生物力學性能影響的基礎(chǔ)上，進一步探討SR對大鼠BMSCs成骨分化及特異性標志蛋白表達的影響，以期明確其作用機制。

1　材料與方法

1.1材料本實驗采用雌性3月齡SD大鼠，共計24只，體質(zhì)量(245±20)g，購自北京維通利華有限公司，于清潔級動物實驗室飼養(yǎng)，期間自由進食水。SR[國藥準字J20080098，施維雅(天津)制藥有限公司]。

1.2方法

1.2.1動物分組及處理所有大鼠分別接受假手術(shù)(Sham組，n=8)和雙側(cè)卵巢切除(OVX，n=16)手術(shù)，術(shù)后8周OVX大鼠隨機分為2組，分別給予安慰劑(OVX+V組)或SR(0.9 g·kg-1·d-1，OVX+SR組)治療，持續(xù)3個月，實驗結(jié)束后，采用脫頸法處死動物取材。

1.2.2標本的采集和處理取第4腰椎采用雙能X線法檢測骨密度，壓縮實驗檢測其最大載荷和彈性模量；取股骨和脛骨骨髓細胞體外培養(yǎng)并向成骨細胞誘導(dǎo)分化，第25天共聚焦顯微鏡觀察骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)的表達及分布，第28天提取細胞RNA及蛋白，RT-PCR及Western blot法檢測BMP-2的表達，細胞培養(yǎng)第32天von kossa染色觀察細胞外基質(zhì)礦化能力。

1.2.3骨密度檢測剔除待檢測椎體附著肌肉等軟組織，采用小動物模式應(yīng)用Norland-XR36雙能X線骨密度測量儀(DEXA，美國)測量第4腰椎骨密度。

1.2.4生物力學檢測首先去除第4腰椎橫突、上下關(guān)節(jié)突、椎弓根及椎板等椎體附件，并經(jīng)手工打磨將椎體制作成高度約為 5 mm 的標準件，椎體上下面保持平行，與椎體縱軸垂直，并根據(jù)每個椎體的前后徑，計算出標準件的平均直徑和體界面積。將椎體下端固定于測試平臺上，以 5 mm/min的速度進行椎體軸向壓縮，直至椎體出現(xiàn)斷裂，記錄最大壓縮載荷及能量吸收值，根據(jù)載荷-位移曲線讀取最大載荷，并經(jīng)公式計算得到彈性模量。

1.2.5BMSCs的提取和誘導(dǎo)培養(yǎng)無菌條件下取大鼠右側(cè)股骨和脛骨，去除兩端，暴露髓腔，10 mL注射器吸取用完全DMEM培養(yǎng)液(青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL，100 mL/L胎牛血清)反復(fù)沖洗骨髓腔，收集骨髓細胞，離心重懸后接種于培養(yǎng)瓶中，50 mL/L(體積分數(shù))CO2，37 ℃溫箱中培養(yǎng)。24 h后換液，以后每2～3 天更換培養(yǎng)液，棄掉未貼壁的懸浮細胞。第2次換液后加入條件培養(yǎng)基，向成骨細胞(維生素C 50 μg/mL，β-甘油磷酸鈉10 mmol/L)誘導(dǎo)。

1.2.6激光共聚焦分析BMP-2的表達分布細胞培養(yǎng)至第25天(第4代細胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿中后36 h)，行共聚焦顯微鏡檢測，實驗過程如下：取出共聚焦皿，用吸管吸出共聚焦培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，每次10 min；用新鮮配制的4%多聚甲醛室溫固定1 h；固定并洗滌完畢后，加適量新鮮配制的0.1%的TriTon-x-100打孔液，將共聚焦培養(yǎng)皿置于37 ℃孵箱中打孔15 min；吸出打孔液并洗滌后，將其置于37 ℃孵箱中孵育10 min；吸出過氧化氫，加適量5%的BSA封閉液，于37 ℃孵箱中孵育10 min；傾去后加入50 μL的BMP-2一抗，4 ℃過夜；次日加入FITC標記的二抗50 μL，放于密閉遮光的盒子內(nèi)，一同置于37 ℃孵箱中孵育30 min；孵育二抗結(jié)束前1 min，在避光條件下加入適量碘化丙碇(PI)繼續(xù)置于密閉遮光的盒子內(nèi)于37 ℃孵箱中孵育15 min，進行染核；染核完成后，在避光條件下用預(yù)冷的PBS洗滌3遍，每次15 min，以將FITC標記的二抗和染核的PI完全清洗干凈。最后1次洗滌完成后，在共聚焦培養(yǎng)皿中加上適量的PBS后用共聚焦顯微鏡進行檢測。

1.2.7RT-PCR檢測BMP-2的表達細胞培養(yǎng)至第28天(第4代細胞長滿)，采用Trizol一步法提取細胞總RNA，行RT-PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系：總體積50 μL，包括：Realtime PCR MasterMix 25 μL，引物各2 μL，cDNA模板5 μL，去DEPC水16 μL。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃15 s，60 ℃ 1 min，50個循環(huán)。溶解曲線法分析產(chǎn)物特異性。通過Rotor-Gene 3000軟件運用ΔΔCt法分析OCN mRNA的表達。各組OCN Ct值與管家基因(GAPDH)Ct值之差為ΔCt值，B、C組與A組之間ΔCt值的差為ΔΔCt，基因表達的Fold chang = 2(-ΔΔCt)，以比值作統(tǒng)計學處理。引物由北京博麥德生物技術(shù)公司合成，序列：GAPDH：上游引物 5′-TGC TGA GTA TGT CGT GGA G-3′，下游引物 5′-GTC TTC TGA GTG GCA GTG AT-3′； BMP-2：上游引物5′-AAG GCA CCC TTT GTA GTG TGT GG-3′,下游引物5′-CAT GCC TTA GGG ATT TTG GA-3′。

1.2.8蛋白印跡法(Western blot)分析BMP-2的表達水平提取第4代細胞總蛋白，喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，根據(jù)測得的蛋白含量，計算含30 μg蛋白的溶液體積即為上樣量，常規(guī)電泳及轉(zhuǎn)膜后，將PVDF膜在TBST中漂洗3次，每次10 min，然后移至含有BSA的平皿中室溫搖動封閉2 h，封閉結(jié)束后將膜與BMP-2抗體孵育，4 ℃過夜。次日加入二抗(1∶1 000稀釋)稀釋液中，37 ℃搖床孵育2 h，用TBST緩沖液洗膜后，加入適量BCIP/NBT顯色液在避光環(huán)境下進行顯色。待蛋白條帶清晰后立刻取出PVDF膜，置于清水中終止顯色。

2　結(jié)　果

2.1骨密度檢測結(jié)果各組第4腰椎骨密度：OVX+V組骨密度顯著低于Sham組和OVX+SR組(P<0.05)，OVX+SR組顯著低于Sham組(P<0.05)，見表1。

2.2生物力學檢測結(jié)果經(jīng)壓縮實驗分析，OVX+V組最大載荷顯著低于OVX+SR組(P<0.05)，OVX+SR組最大載荷顯著低于Sham組(P<0.05)；彈性模量：OVX+V組彈性模量顯著低于Sham組和OVX+SR組(P<0.05)，Sham組和OVX+SR組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1　骨密度及生物力學檢測結(jié)果±s)

a：P<0.05,與Sham組比較；b：P<0.05,與OVX+V組比較。

2.3細胞培養(yǎng)結(jié)果第1天懸浮細胞較多，24 h換液后去除大部分懸浮細胞，并有少數(shù)細胞貼壁生長，逐漸伸角變形。隨培養(yǎng)時間延長和傳代，細胞形態(tài)由典型梭形或多角形的成纖維細胞樣生長，逐漸變?yōu)槿切位蚨噙呅危倚误w逐漸變大，傳至第4代時可見有細胞外基質(zhì)分泌。見圖1。

2.4激光共聚焦檢測結(jié)果細胞培養(yǎng)25 d，各組細胞經(jīng)共聚焦顯微鏡檢測，BMP-2由FITC標記為綠色熒光，PI標記核為紅色熒光，BMP-2在胞質(zhì)和胞核均有表達，各組間比較無明顯差異。見圖2。

2.5RT-PCR檢測結(jié)果Sham組設(shè)定為1，OVX+V組1.07±0.24，OVX+SR組1.20±0.40，各組BMP-2 mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

A:Sham組；B:OVX+V組；C:OVX+SR組。

圖1第4代骨髓基質(zhì)干細胞(×100)

A：Sham組；B：OVX+V組；C：OVX+SR組。

圖2激光共聚焦觀察BMP-2的表達分布 (×100)

A：Sham組；B：OVX+V組；C：OVX+SR組。

圖3Western blot檢測BMP-2表達

2.6Western blot 檢測結(jié)果Sham組0.75±0.16，OVX+V組0.83±0.16，OVX+SR組0.69±0.17，經(jīng)與內(nèi)參GAPDH作比后，各組BMP-2表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.7von kossa染色經(jīng)von kossa染色證實，各組細胞培養(yǎng)至35 d，細胞外基質(zhì)均具有礦化能力，著黑色結(jié)節(jié)，各組鈣化點數(shù)量及大小無明顯差別。

A：Sham組；B：OVX+V組；C：OVX+SR組。

圖4細胞培養(yǎng)32 d von kossa染色結(jié)果(×100)

3　討　論

去勢手術(shù)建立大鼠骨質(zhì)疏松模型是目前模擬人類絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的最為常用且普遍認可的動物模型[8-10]。該模型卵巢切除后導(dǎo)致雌激素突然衰退，誘使骨轉(zhuǎn)換率增高，而且骨吸收活性大于骨形成能力，導(dǎo)致機體骨量和骨質(zhì)量的下降，這些改變和表現(xiàn)都類似于人類女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的病理進程。而通過進一步研究證實，以雌激素替代治療該模型大鼠，可抑制其骨量丟失，這也與臨床試驗中絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥女性患者接受雌激素替代治療的表現(xiàn)相吻合。本研究骨密度檢測和生物力學分析結(jié)果提示，3個月齡大鼠切除雙側(cè)卵巢后8周可成功建立大鼠骨質(zhì)疏松模型。

SR因具有促進骨形成與抑制骨吸收雙重作用而備受關(guān)注。研究證實，SR可以促進前成骨細胞的分化，增加成骨細胞的功能活性，促進基質(zhì)分泌和礦化；與此同時，SR可以抑制破骨細胞分化和破骨細胞活性并刺激破骨細胞凋亡[2-5]。本研究證實，SR干預(yù)3個月可顯著阻止卵巢切除大鼠骨量的丟失，但與健康大鼠相比，其骨密度仍未恢復(fù)至正常水平，一方面可能與該劑量下SR藥效有限有關(guān)，另一方面，為更好模擬人類治療選擇時機，本研究設(shè)計藥物干預(yù)時間為手術(shù)后8周，并未選擇術(shù)后立即給藥，干預(yù)時間較造模時間滯后也是原因之一。

BMSCs在特定誘導(dǎo)條件下可向多種細胞分化，并表現(xiàn)出一定的特異性生物學行為或表達相關(guān)基因。細胞外基質(zhì)礦化能力的出現(xiàn)是成骨細胞的特異性生物學行為之一。BMPs是轉(zhuǎn)化生長因子超家族成員之一，作為BMPs成員之一，BMP-2是公認的BMSCs成骨分化的關(guān)鍵蛋白。為全面探討SR對該模型BMSCs成骨分化過程中BMP-2的影響，本研究采用免疫熒光標記并激光共聚焦顯微鏡、RT-PCR和Western blot技術(shù)多層次多角度分析了BMP-2的分布和表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SR體內(nèi)干預(yù)該模型3個月，并未顯著影響B(tài)MP-2的表達水平，而通過對BMSCs成骨誘導(dǎo)分化第4代細胞的細胞外基質(zhì)鈣化能力的分析，該模型BMSCs體外分化能力與健康大鼠并無明顯差別，SR干預(yù)后同樣沒有顯著影響。以往有研究證實，雙側(cè)卵巢切除大鼠BMSCs的成骨分化能力會受到一定程度抑制[11]。作者分析，造成結(jié)果不同的原因可能是本研究檢測時間點較晚，在體刺激經(jīng)體外多次傳代培養(yǎng)后效應(yīng)減弱，且檢測指標時間點單一，難以全面反映其表達水平的變化和差異。

綜上所述，本研究證實SR可有效阻止卵巢切除大鼠骨量丟失和骨質(zhì)量下降，但在本研究選擇的觀測時間點，體內(nèi)干預(yù)對該模型BMSCs的體外分化能力及BMP-2的表達水平無顯著影響，SR對該模型的干預(yù)機制是否與調(diào)控BMSCs的成骨分化有關(guān)，尚有待進一步研究。

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Effects of strontium ranelate on the osteogenic differentiation and expression level of BMP-2 in BMSCs from ovariectomized rat

Liu Xiaopo1,Feng Yunbo1,Li Xiaoli2,Cao Guolong1,Zhang Pei3

(1.DepartmentofOrthopaedic;2.DepartmentofGeriatrics;3.DepartmentofNeurology,TangshanWorkers′Hospital,Tangshan,Hebei063000,China)

ObjectiveTo reveal the effects of strontium ranelate on the osteogenic differentiation and expression level of BMP-2 in BMSCs from ovariectomized rat.MethodsA total of 24 SD rats were randomly divided into 3 groups of 8 animals in each:Sham group (n=8),the other 16 rats were subjected to ovariectomized(OVX) groups,8 weeks after ovariectomy operation,OVX rats were administered with strontium ranelate (0.9 g·kg-1·d-1,OVX+SR) or vehicle as control(OVX+V),all rats were sacrificed 3 months later.The bone mineral density and biomechanical properties were analyzed in 4th lumbar vertebrae.Bone marrow cells were harvested and cultured in vitro in osteogenic-differentiation induced medium,the expression and cellular distribution of bone morphometric protein-2 were analyzed by confocal microscope on 25th day,realtime PCR and Western blot were used to assess the expression levels of BMP-2 on 28th day,von kossa staining was performed on 32th day to observe the extracellular minerlization.Results(1)BMD:OVX rats showed markedly decreased BMD comparing to Sham and OVX+SR group(P<0.05).(2)Biomechanical test:The maximal load in OVX+V group was significantly lower than OVX+SR group(P<0.05),and the maximal load in OVX+SR group was significantly lower than Sham group(P<0.05).Elastic modulus in OVX+V group was significantly lower than Sham and OVX+SR groups.(3)No significant difference between any two groups were found of the distribution of BMP-2 by confocal microscope(P>0.05),similar results were found in real-time PCR and Western blot analysis for the expression levels of BMP-2,as well as the detection of extracellular matrix mineralization by von kossa staining.ConclusionStrontium ranelate could partially prevent the bone loss and the deterioration of the biomechanical properties in OVX rat,but could not affect the osteogenic differentiation and expression level of BMP-2 in BMSCs.

ovariectomy;osteoporosis;bone density;strontium ranelate;BMSCs;BMP-2

劉小坡(1980-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事骨質(zhì)疏松的研究與治療。

論著·基礎(chǔ)研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.26.009

R332

A

1671-8348(2016)26-3627-04

2016-02-22

2016-05-26)