甲酰肽受體shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞系的構(gòu)建*

楊　華，劉學(xué)英，楊風(fēng)琴，楚元奎

(寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)系，銀川 750004)

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論著·基礎(chǔ)研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.26.005

甲酰肽受體shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞系的構(gòu)建*

楊華，劉學(xué)英，楊風(fēng)琴，楚元奎△

(寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)系，銀川 750004)

目的構(gòu)建靶向甲酰肽受體(FPR)基因的shRNA 慢病毒表達(dá)載體，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的U87細(xì)胞系。方法設(shè)計(jì)并合成FPR基因特異性的shRNA序列，構(gòu)建PDS019_pL/shRNA/GFP/F-FPR慢病毒載體，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝成FPR慢病毒顆粒，感染U87細(xì)胞。熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果，實(shí)時(shí)熒光定量PCR及蛋白免疫印跡法(Western blot)法檢測(cè)FPR干擾效率。結(jié)果成功構(gòu)建FPR基因shRNA慢病毒表達(dá)載體。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞后，熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光蛋白。實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot證實(shí)PDS019_pL/shRNA/GFP/F-FPR慢病毒載體具有良好的干擾效果。結(jié)論成功構(gòu)建FPR shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的U87細(xì)胞系。

慢病毒屬；甲酰肽受體；短發(fā)夾RNA；U87細(xì)胞

甲酰肽受體(formyl peptide receptor,FPR)屬于G-蛋白偶聯(lián)受體家族，在機(jī)體的炎癥反應(yīng)和天然免疫進(jìn)程中起重要的作用。N-甲?；琢蝓?亮氨酰-苯丙氨酰胺(N-formyl-methionyl-leueyl-phenylalanine,fMLF)和來(lái)源于腫瘤細(xì)胞或其他宿主細(xì)胞線粒體的一些多肽，均能通過(guò)與FPR結(jié)合，進(jìn)而介導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞的遷移和增殖，在腫瘤的發(fā)生、演進(jìn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能起重要作用[1-2]。RNA干擾(RNA interence，RNAi)可特異性地阻斷靶基因表達(dá)，是研究基因功能的有效技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)構(gòu)建并鑒定表達(dá)FPR基因的RNA 干擾靶點(diǎn)慢病毒載體，為進(jìn)一步研究FPR在惡性腫瘤生物學(xué)行為中的影響及可能的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料PDS019_pL/shRNA/GFP慢病毒載體購(gòu)于上海諾百生物科技有限公司。EcoRⅠ內(nèi)切酶、BsmbⅠ內(nèi)切酶和T4DNA ligase均購(gòu)自Fermentas公司。質(zhì)粒抽提試劑盒及凝膠回收試劑盒購(gòu)自Ayxgen公司。大腸埃希菌STBL3 菌種購(gòu)自TaKaRa公司。LipofactamineTM2000及包裝質(zhì)粒Packaging Mix購(gòu)自Invitrogen 公司。293FT與U87細(xì)胞均由上海諾百生物科技有限公司提供。DMEM、胎牛血清(FBS)均購(gòu)自HyClone公司。Opti-MEM購(gòu)自Gibco公司。Trizol Reagent、QuantScript RT Kit、RealMasterMix(SYBR Green)均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司等。

1.2方法

1.2.1shRNA序列設(shè)計(jì)與合成在GenBank 中查找人類FPR的基因序列(NM_001193306.1)，其序列全長(zhǎng)為1 371 bp，其編碼序列(coding sequences，CDS) 位于147～1 199 bp。在線軟件設(shè)計(jì)并合成3對(duì)參數(shù)最好的干擾靶序列(表1)。

表1　FPR-shRNA引物序列

1.2.2慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定PDS019_Pl/shRNA/GFP載體經(jīng)BsmbⅠ和EcoRⅠ兩種內(nèi)切酶雙酶切后切膠回收，并將退火后的3對(duì)shRNA序列與膠回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)生長(zhǎng)出的克隆用菌檢PCR方法檢測(cè)，然后挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3慢病毒載體的包裝及滴度測(cè)定將包裝質(zhì)粒Packaging Mix和3種慢病毒表達(dá)質(zhì)粒加入Opti-MEM混勻后與LipofectamineTM2 000共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液并濃縮，-80 ℃保存。濃縮上清液感染HEK293細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察各孔中熒光細(xì)胞數(shù)量。取熒光細(xì)胞數(shù)最少的2個(gè)培養(yǎng)孔的平均數(shù)值，分別計(jì)算滴度后取其平均值即為該病毒液滴度。病毒滴度為表達(dá)熒光的細(xì)胞數(shù)/該孔稀釋的病毒液相當(dāng)于原病毒的體積。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR detecting system,RT-qPCR)檢測(cè)慢病毒FPR基因干擾效率病毒侵染293細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞。Trizol提取各組細(xì)胞的總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度，按試劑盒操作說(shuō)明合成第1 鏈cDNA，最后以cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，分析干擾效果，并確定最優(yōu)干擾慢病毒。引物序列為FPR上游引物：5′-GGG TGA TGG CTC TGC TCC TC -3′；下游引物：5′-CGT TGG TCC AGG GCG AAA -3′；β-actin 上游引物：5′-AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT -3′；下游引物：5′-GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT-3′。

1.2.5重組慢病毒感染U87細(xì)胞及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的篩選培養(yǎng)U87細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按照孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)過(guò)夜后感染病毒。以合適的MOI的病毒液侵染靶細(xì)胞，培養(yǎng)4～6 h后更換新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24～72 h，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)開(kāi)始進(jìn)行BSD(濃度分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12 μg/mL)篩選，篩選10 d，建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。

1.2.6RT-qPCR及蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞FPR基因的表達(dá)收集篩選成功的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，提取總RNA及總蛋白，RT-qPCR及Western blot檢測(cè)FPR基因在U87細(xì)胞中的表達(dá)情況。

2　結(jié)　果

2.1PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR表達(dá)載體的序列鑒定將陽(yáng)性表達(dá)載體進(jìn)行DNA序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的合成的FPR靶基因序列完全一致。結(jié)果表明，合成的寡核苷酸片段成功插入到慢病毒載體PDS019_Pl/shRNA/GFP中，PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖1)。

2.2shRNA慢病毒包裝和滴度測(cè)定3種PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞24 h后，熒光顯微鏡下可見(jiàn)大部分細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白(圖2)。3種PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR慢病毒滴度分別為1.3×109、1.1×109、1.3×109TU/mL。

2.3RT-qPCR結(jié)果分析RT-qPCR數(shù)據(jù)結(jié)果顯示慢病毒侵染293T細(xì)胞48 h后，干擾效果均大于90%，PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR-1慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的干擾效果最好。

2.4穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建與鑒定感染時(shí)將病毒按不同MOI數(shù)加入到U87細(xì)胞中，MOI=30～60時(shí)感染效率最好。用4 μg/mL BSD維持篩選建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，熒光顯微鏡下可見(jiàn)熒光強(qiáng)度達(dá)90%以上(圖3)。提取細(xì)胞總RNA及總蛋白后行Q-PCR及Western blot檢測(cè)。結(jié)果顯示，干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中FPR基因及蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組(圖4)，證明穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建成功。

A：PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR-1表達(dá)載體測(cè)序；B：PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR-2表達(dá)載體測(cè)序；C：PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR-3表達(dá)載體測(cè)序。

圖1PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR表達(dá)載體測(cè)序結(jié)果

A：PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR-1；B：PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR-2；C：PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR-3。

圖2熒光顯微鏡觀察慢病毒包裝(×100)

A:PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR；B:PDS019_Pl/shRNA/GFP-NC。

圖3熒光檢測(cè)FPR蛋白在U87細(xì)胞中的表達(dá)(×100)

A：RT-qPCR檢測(cè)FPR基因表達(dá)結(jié)果；B：Western blot檢測(cè)FPR蛋白表達(dá)結(jié)果。

圖4FPR在U87細(xì)胞中的表達(dá)

3　討　論

甲酰肽受體屬于G-蛋白偶聯(lián)受體家族，由FPR1、FPR2(FPRL1)和FPR3(FPRL2)3個(gè)成員組成[3]。在氨基酸組成上，F(xiàn)PR1與FPR2具有69%的同源性，F(xiàn)PR1與FPR3的同源性為56%[4]。FPR作為G-蛋白偶聯(lián)受體家族，能夠被不同結(jié)構(gòu)的配體激活，包括肽、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。FPR與激動(dòng)劑結(jié)合后，能夠觸發(fā)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)參與調(diào)節(jié)血管生成，細(xì)胞增殖，防止凋亡等[5-6]。fMLF是一種分泌的病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated-molecular patterns,PAMPs)，在細(xì)胞損傷后，可以誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的趨化作用[7]。fMLF作為FPR的激動(dòng)劑，能介導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的趨化移動(dòng)[8]。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，F(xiàn)PRs可能通過(guò)自分泌或旁分泌方式與局部刺激相互作用，在促進(jìn)血管生成和腫瘤生長(zhǎng)方面起到非常重要的作用[9-10]。而且，F(xiàn)PR1可以反式激活EGFR，二者共同作用促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的惡性表型[10-11]。膜聯(lián)蛋白1(annexin 1,AnxA1)是FPR、FPRL1和FPRL2 3種受體的激動(dòng)劑[12]，可通過(guò)激活FPRs促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)[13]、結(jié)腸直腸癌(SKCO-15細(xì)胞)的浸潤(rùn)能力[14]。Cheng等[15]的研究也表明，AnxA1能夠通過(guò)FPR激活ERK/ITGB1BP1通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲。而且在AnxA1過(guò)表達(dá)的胃癌組織中FPR1的表達(dá)顯著增加，是影響胃癌患者總體生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[16]。FPR在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用越來(lái)越備受關(guān)注，有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)之一。

為進(jìn)一步研究FPR在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用，本實(shí)驗(yàn)以FPR基因?yàn)榘谢?，?yīng)用RNAi技術(shù)，設(shè)計(jì)3種針對(duì)FPR基因的特異性shRNA序列，構(gòu)建3對(duì)慢病毒干擾載體。經(jīng)PCR鑒定陽(yáng)性克隆及DNA測(cè)序證實(shí)合成的寡核苷酸片段成功插入PDS019_Pl/shRNA/GFP，且插入片段與設(shè)計(jì)的靶序列一致，因此確定本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了3種針對(duì)FPR基因RNA干擾靶點(diǎn)慢病毒載體。慢病毒包裝后可成功轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，通過(guò)RT-qPCR證實(shí)，設(shè)計(jì)包裝的3種序列的慢病毒載體均可明顯干擾293T細(xì)胞中的FPR基因表達(dá)，其中PDS019_Pl/shRNA/GFP-FPR-1序列沉默表達(dá)效果最佳。本研究成功構(gòu)建FPR基因慢病毒干擾載體，并建立了FPR shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的U87細(xì)胞系，為進(jìn)一步研究FPR在人膠質(zhì)瘤中的作用及作用機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Construction of U87 cell line transfected by FPR shRNA*

Yang Hua,Liu Xueying,Yang Fengqin,Chu Yuankui△

(DepartmentofLaboratoryMedicine,ClinicalMedicineSchoolofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan,Ningxia750004,China)

ObjectiveTo construct shRNA lentiviral vector for FPR gene,and establish stable transfection of U87 cell lines.MethodsThe shRNA sequences for FPR gene was synthesized and inserted into PDS019 lentiviral vector.Liposome was used to package PDS019 lentiviral particles into 293T cells and used to infect U87 cells.The green fluorescent protein (GFP) and the silencing effects of the recombinant vectors were detected with the fluorescence microscope and Q-PCR,Western blot.ResultsThe recombinant vectors were successfully constructed.In the U87 cells transfected with the recombinant vectors,the expression of GFP were detected and the interference efficiency of the recombinant vectors were confirmed.ConclusionThe constructed FPR shRNA lentiviral vectors could interfere the expression of FPR in U87 cells.

lentivirus;FPR;shRNA;U87 cells

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81301499,81460324)。作者簡(jiǎn)介：楊華(1974-)，副教授，博士，主要從事腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制及臨床作用研究?！?/p>

，E-mail:chuyuankui@163.com。

R730.2

A

1671-8348(2016)26-3616-03

2016-02-14

2016-04-06)