欽州市欽南區(qū)HIV-1流行亞型及基因變異特征研究*

沈　平，蘇齊鑒，黃毅毅，蔣麗萍，張達(dá)燕，郭繼昌，徐鴻莊，韋建立

(1．廣西壯族自治區(qū)欽州市欽南區(qū)疾病預(yù)防控制中心　535000；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，南寧 530011)

?

·論著·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.26.002

欽州市欽南區(qū)HIV-1流行亞型及基因變異特征研究*

沈平1，蘇齊鑒2△，黃毅毅1，蔣麗萍1，張達(dá)燕1，郭繼昌1，徐鴻莊1，韋建立1

(1．廣西壯族自治區(qū)欽州市欽南區(qū)疾病預(yù)防控制中心535000；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，南寧 530011)

目的調(diào)查流行于欽南區(qū)的HIV-1亞型種類并分析其基因變異特征。方法抽取100例未抗病毒治療的HIV-1感染者，從血樣中提取病毒RNA或前病毒DNA，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增HIV-1 gag基因和pol基因片段并測序，用系統(tǒng)進(jìn)化樹分析其亞型，并計(jì)算gag和pol區(qū)的基因離散率。結(jié)果97份血樣獲得gag基因序列或pol基因序列，4份血樣的gag與pol分型不一致，其他93份分型明確，其中CRF01_AE重組型、CRF07_BC重組型、CRF08_BC重組型及G亞型分別占76.34%(71/93)、9.68%(9/93)、12.90%(12/93)和1.07%(1/93)。CRF08_BC的gag基因離散率為0.059±0.005，高于CRF07_BC的0.053±0.005(P<0.01)和CRF01_AE的0.049±0.004(P<0.01)。CRF01_AE的pol基因離散率為0.044±0.003，高于CRF07_BC的0.035±0.004(P<0.01)和CRF08_BC的0.033±0.003(P<0.01)。結(jié)論欽南區(qū)HIV-1存在至少3種流行亞型，其中CRF01_AE是最主要的亞型，不同基因區(qū)的變異程度有所不同。

HIV-1；基因,gag；基因,pol；亞型；離散率；變異

自2010年起，廣西實(shí)施的為期5年的艾滋病攻堅(jiān)工程已初顯成效，研究顯示2008～2013年新報(bào)告的人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者、艾滋病患者呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，而晚發(fā)現(xiàn)比例仍然呈逐年上升趨勢[1]。雖然廣西新報(bào)告的艾滋病病例在2011年之后有所下降，但是此下降趨勢在欽州市的某些地區(qū)并不明顯[2]。欽州市是廣西北部灣沿海正在建設(shè)的新興城市之一，交通便利，艾滋病的流行因素廣泛存在，艾滋病防治形勢嚴(yán)峻。為了解該地區(qū)的HIV-1分子流行病學(xué)特征，本研究以欽州市欽南區(qū)未治療艾滋病感染者為研究對(duì)象，對(duì)HIV-1的 gag和pol基因進(jìn)行分析，探討流行于該地區(qū)的HIV-1亞型，并分析其基因變異情況。

1　資料與方法

1.1一般資料在艾滋病綜合防治數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)中查詢欽南區(qū)所有未經(jīng)抗病毒治療的HIV感染者，在查詢到的361例中，利用隨機(jī)數(shù)字表抽取100例，轄區(qū)內(nèi)12個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)均有病例被抽中。對(duì)抽中的研究對(duì)象進(jìn)行流行病學(xué)資料并抽取外周靜脈血10 mL。

1.2方法

1.2.1病毒核酸提取分離血漿和血細(xì)胞，保存于-80 ℃冰箱。用RNA 提取試劑盒 (high pure viral RNA kit，Roche公司產(chǎn)品)從血漿中提取病毒RNA。當(dāng)PCR擴(kuò)增或測序失敗時(shí)，用全血基因組DNA提取試劑盒(北京艾德萊公司)由血細(xì)胞提取前病毒DNA。

1.2.2gag和pol區(qū)基因序列擴(kuò)增前病毒DNA通過巢式PCR分別擴(kuò)增gag和pol基因，RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行巢式PCR。gag和pol區(qū)擴(kuò)增引物及反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[3-4]。

1.2.3擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定與測序第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，對(duì)出現(xiàn)目的條帶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序，其中，gag區(qū)產(chǎn)物送北京天一輝遠(yuǎn)生物公司測序，pol區(qū)產(chǎn)物送至北京博邁德生物公司進(jìn)行測序。

1.2.4序列亞型分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析序列經(jīng)拼接、校正，用在線亞型分析工具Genotyping(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/)對(duì)序列進(jìn)行亞型分析，用 MEGA 5.03 軟件構(gòu)建鄰接系統(tǒng)進(jìn)化樹(重復(fù)運(yùn)算 1 000 次)分析亞型和計(jì)算基因離散率(堿基替代模型為Kimura-2 parameter model)，進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)用Bootstrap法檢驗(yàn)。gag和pol區(qū)參考序列來自HIV Database(http://www.hiv.lanl.gov)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)用SPSS 16.0進(jìn)行處理。不同亞型基因離散率的比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1流行病學(xué)資料3例研究對(duì)象的血樣因嚴(yán)重溶血而排除，最后納入97例。研究對(duì)象年齡9～89歲，其中20～49歲占62.8%；男性占67.0%；異性性傳播占86.60%；職業(yè)以農(nóng)民、工人及民工為主。CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)平均為每微升415個(gè)。見表1。

表1　研究對(duì)象的流行病學(xué)資料

2.2基因亞型鑒定及分布在97份血樣中，獲得72株HIV-1的gag基因序列和95株HIV-1的pol基因。對(duì)序列進(jìn)行Genotyping分型及進(jìn)化樹驗(yàn)證(圖1、2)，規(guī)定某樣本在gag基因和pol基因的分型中一致，或僅在1個(gè)基因測得其分型，則可確定其分型，若兩基因分型不一致則不進(jìn)行進(jìn)一步分析。結(jié)果4份血樣gag基因分型與pol基因分型不一致，其他93份血樣Genotyping分型明確(表2)，其中，CRF01_AE占76.34%(71/93)，CRF07_BC占9.68%(9/93)，CRF08_BC占12.90%(12/93)，G亞型占1.07%(1/93)。本研究獲得的G亞型毒株(QN100)與在廣西發(fā)現(xiàn)的首例G亞型毒株(G.CN.2008.GX_2084_08.JN106043)成簇，Bootstrap達(dá)100%。

圖1gag基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

圖2pol基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

表2　HIV-1基因亞型分布

2.3基因離散率CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC在gag及pol區(qū)的離散率見表3。經(jīng)方差分析，gag基因離散率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；SNK檢驗(yàn)顯示，CRF08_BC的gag基因離散率大于CRF01_AE(P<0.01)和CRF07_BC(P<0.01)。3種重組型的pol基因離散率的差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；SNK檢驗(yàn)顯示，CRF01_AE的離散率大于CRF07_BC(P<0.01)和CRF08_BC(P<0.01)。

表3　HIV-1 gag基因及pol基因的基因離散率

a：q=9.79，P<0.01，與CRF01_AE比較；q=4.61，P<0.01，與CRF07_BC比較。b：q=11.62，P<0.01,與CRF07_BC比較；q=16.09，P<0.01,與CRF08_BC比較。

3　討　論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，截至2009年，我國HIV-1流行亞型最多的是CRF01_AE(占30%)[5]。CRF01_AE也是近年來廣西最主要的流行亞型，所占比例超過70%[6-8]。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)欽南區(qū)有CRF01_AE重組型(76.34%)、CRF07_BC重組型(9.68%)、CRF08_BC重組型(12.90%)和G亞型(1.07%)，亞型分布特點(diǎn)與廣西其他地區(qū)相似。從歷年的監(jiān)測數(shù)據(jù)來看，CRF01_AE所占的比例在廣西地區(qū)呈逐步上升的趨勢。經(jīng)分析，CRF01_AE的廣泛流行可能與其Gp120蛋白獨(dú)特的N連接糖基化位點(diǎn)分布有關(guān)，該毒株的N連接糖基化位點(diǎn)(PNGSs)總數(shù)量尤其在V2和V4區(qū)的數(shù)量明顯較其他亞型的毒株少，而V5區(qū)的N連接糖基化位點(diǎn)數(shù)量又明顯更多[9]。N連接糖基化具有維持Gp120蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)和回避宿主免疫攻擊的作用，并且有可能影響HIV-1病毒的傳染性[10-11]。

經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，G亞型在國內(nèi)較為罕見，只有個(gè)別報(bào)道[12-13]。2008年廣西發(fā)現(xiàn)的G亞型感染病例是北海市的1例靜脈吸毒者[14]；本研究中發(fā)現(xiàn)的唯一1例G亞型樣本與該毒株形成一簇，Bootstrap達(dá)100%。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查資料，本研究發(fā)現(xiàn)的G亞型感染病例及其配偶未曾在北海發(fā)生過高危行為，提示G亞型可能已經(jīng)在北海和欽州的某些人群中小范圍流行。

系統(tǒng)樹分析發(fā)現(xiàn)4份樣本的gag和pol基因區(qū)分型結(jié)果不一致。其中，QN005的gag區(qū)為CRF08_BC亞型，pol區(qū)為CRF01_AE區(qū)；QN058的gag區(qū)為CRF07_BC區(qū)，pol區(qū)為CRF08_BC；QN068的gag區(qū)為CRF07_BC區(qū)，pol區(qū)為CRF08_BC區(qū)；QN073的gag區(qū)為CRF07_BC區(qū)，pol區(qū)為CRF01_AE區(qū)?？紤]到HIV-1高度的變異性和活躍的重組特性，分型的不一致可能是由于所感染的毒株發(fā)生了新的重組。

基因離散率分析通過計(jì)算序列間的變異程度來估計(jì)HIV-1在當(dāng)?shù)亓餍袝r(shí)間的長短。本研究發(fā)現(xiàn)，在gag區(qū)，CRF08_BC的基因離散率高于CRF07_BC和CRF01_AE，而在pol區(qū)，CRF01_AE的基因離散率高于CRF07_BC和CRF08_BC。兩基因區(qū)離散率不一致的原因有待進(jìn)一步分析，不排除兩個(gè)基因區(qū)得到的序列數(shù)量不一致對(duì)此造成的影響。本研究的pol基因區(qū)離散率分析結(jié)果與王敏連等[15]的研究相吻合，目前各種證據(jù)比較傾向于CRF01_AE是廣西流行時(shí)間最早的HIV-1毒株之一，而且目前已經(jīng)成為不同傳播途徑的最主要流行亞型。

本次調(diào)查覆蓋了轄區(qū)內(nèi)所有鄉(xiāng)鎮(zhèn)，而且各鄉(xiāng)鎮(zhèn)的民族構(gòu)成、生活方式和地方習(xí)俗等，以及影響艾滋病流行的因素基本一致，因此，抽取的樣本有較好的代表性。本次調(diào)查獲得了欽南區(qū)HIV-1分子流行病學(xué)特征的第一手資料，為追溯當(dāng)?shù)匕滩〉牧餍惺泛脱葑冓厔?，了解艾滋病的流行現(xiàn)狀，以及為今后開展HIV-1流行監(jiān)測提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，這對(duì)于當(dāng)?shù)氐陌滩》揽毓ぷ饔兄匾闹笇?dǎo)作用。

[1]王學(xué)燕,葛憲民,唐振柱,等.廣西壯族自治區(qū)2008～2013年艾滋病流行趨勢分析[J].應(yīng)用預(yù)防醫(yī)學(xué),2015,21(4):217-222.

[2]黃齊華.2005～2012年廣西壯族自治區(qū)欽州市欽北區(qū)艾滋病流行病學(xué)分析[J].職業(yè)與健康,2014,30(1):90-93.

[3]Chen M,Ma Y,Su Y,et al.HIV-1 genetic characteristics and transmitted drug resistance among men who have sex with men in Kunming,China[J].PLoS One,2014,9(1):e87033.

[4]沈平,蘇齊鑒,黃毅毅,等.欽州市欽南區(qū)HIV-1原發(fā)性耐藥及其影響因素的研究[J].中國熱帶醫(yī)學(xué),2015,15(10):1181-1185.

[5]金艷濤,郭會(huì)軍,姜楓,等.中國HIV-1基因亞型分布文獻(xiàn)分析[J].衛(wèi)生研究,2011,40(5):645-648.

[6]劉偉,梁淑家,楊進(jìn)業(yè),等.廣西壯族自治區(qū)2008-2009年HIV-1流行毒株基因型及其分布[J].中華流行病學(xué)雜志,2013,34(1):53-56.

[7]孔衍琳,張帥,王雪雯,等.廣西三城市HIV-1型流行毒株gag基因亞型分析[J].廣西師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2015,33(1):127-133.

[8]王洪,梁冰玉,周波,等.2010～2012年廣西壯族自治區(qū)HIV-1流行株pol基因亞型的分布情況[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2016,50(1):79-84.

[9]Shi Y,Feng Y,Ding X,et al.Short communication:the distribution of potential N-linked glycosylation sites in Gp120 differs among major HIV-1 subtypes circulating in China[J].AIDS Res Hum Retroviruses,2016,32(1):101-108.

[10]Huang X,Barchi JJ Jr,Lung FD,et al.Glycosylation affects both the three-dimensional structure and antibody binding properties of the HIV-1 ⅢB GP120 peptide RP135[J].Biochemistry,1997,36(36):10846-10856.

[11]Clark GF.The role of glycans in immune evasion:the human fetoembryonic defence system hypothesis revisited[J].Mol Hum Reprod,2014,20(3):185-199.

[12]褚小剛,詹發(fā)先,彭國平,等.湖北省HIV-1流行株gag基因序列測定及亞型分析[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志,2012,26(6):460-463.

[13]周成林,楊啟生,殷竹君,等.江蘇省HIV-1流行株env和pol基因亞型及其系統(tǒng)分析[J].新醫(yī)學(xué),2012,43(4):253-255.

[14]李天一,梁淑家,陳立力,等.廣西首例HIV-1G亞型毒株的發(fā)現(xiàn)和近似全長基因組序列分析[J].軍事醫(yī)學(xué),2012,36(3):192-195.

[15]王敏連,梁冰玉,葉力,等.廣西HIV-1流行株env基因C2V3區(qū)序列特征和亞型研究[J].中華疾病控制雜志,2015,19(12):1191-1194.

HIV-1 subtype distribution and genetic variation in Qinzhou South district of Qinzhou city*

Shen Ping1,Su Qijian2△,Huang Yiyi1,Jiang Liping1,Zhang Dayan1,Guo Jichang1,Xu Hongzhuang1,Wei Jianli1

(1.QinzhouSouthDistricCenterforDiseasePreventionandControl,Qinzhou,Guangxi535000,China;2.AffiliatedRuikangHospitalofGuangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanning,Guangxi530011,China)

ObjectiveTo investigate HIV-1 subtypes circulating in Qinzhou South District and understand the features of genetic variation of the virus.MethodsBlood samples were collected from 100 HIV-1 antiretroviral treatment(ART)-patients from Qinzhou South District of Qingzhou city.Viral RNA and proviral DNA was extracted and amplified.The gag and pol gene fragments of HIV-1 were amplified by polymerase chain reaction (PCR) and were sequenced,then phylogenetic tree was constructed and genetic distance was calculated for each genetic region.ResultsGag or pol gene sequences were successfully amplified from blood samples.4 samples had different subtyping results in the two genetic region.There were 76.34% of CRF01_AE(71/93),9.68% of CRF07_BC(9/93),12.90% of CRF08_BC(12/93) and 1.07% of subtype G(1/93).The genetic distance of the gag gene for CRF08_BC was 0.059±0.005，higher than CRF07_BC (0.053±0.005,P<0.01) and CRF01_AE (0.049±0.004,P<0.01).But in the pol gene,the distance for CRF01_AE was 0.044±0.003,higher than CRF07_BC (0.035±0.004,P<0.01) and CRF08_BC (0.033±0.003,P<0.01).ConclusionThere are at least three subtypes circulating in Qinzhou South District,and CRF01_AE is the most predominant strain.The levels of genetic variation are different in the two genetic regions.

HIV-1;gene,gag;gene,pol;subtype;genetic distance;variation

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360258)；欽州市欽南區(qū)科技局資助項(xiàng)目(20140101)。作者簡介：沈平(1956-)，主任醫(yī)師，本科，主要從事流行病學(xué)研究?！?/p>

，E-mail:agansue@163.com。

Q786

A

1671-8348(2016)26-3605-03

2016-02-21

2016-05-06)