姜黃素抗腎纖維化的分子生物學(xué)機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究*

朱方強(qiáng)，陳民佳，朱　明，徐　祥，趙洪雯，劉　宏，余榮杰，吳雄飛，黃　宏△

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所第一研究室/創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400042；2.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院腎內(nèi)科，重慶 400038)

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·論著·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.26.001

姜黃素抗腎纖維化的分子生物學(xué)機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究*

朱方強(qiáng)1，陳民佳1，朱明1，徐祥1，趙洪雯2，劉宏2，余榮杰2，吳雄飛2，黃宏1△

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所第一研究室/創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400042；2.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院腎內(nèi)科，重慶 400038)

目的探討姜黃素抗腎纖維化的分子生物學(xué)機(jī)制，為臨床治療提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法以人腎小管上皮細(xì)胞(HKC)為研究對(duì)象，采用不同濃度的姜黃素(0、0.780、1.563、3.125、6.250、12.500、25.000、50.000和100.000 μmol/L)刺激HKC 72 h，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)姜黃素對(duì)HKC生長(zhǎng)的影響；應(yīng)用不同濃度TGF-β1(0、1、5、10 ng/mL)單獨(dú)或聯(lián)合姜黃素(6.250、12.500、25.000、50.000 μmol/L和100.000 μmol/L)共同刺激HKC細(xì)胞72 h，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測(cè)TGF-β1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BMP-7)和Ⅰ型膠原基因表達(dá)變化。結(jié)果HKC貼壁生長(zhǎng)，呈鋪路石樣外觀。姜黃素刺激對(duì)細(xì)胞形態(tài)無(wú)影響；TGF-β1刺激能明顯促進(jìn)細(xì)胞由上皮樣形態(tài)向纖維樣細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化，且發(fā)生形態(tài)轉(zhuǎn)變的細(xì)胞數(shù)量和TGF-β1基因表達(dá)呈TGF-β1濃度依賴性增加(P<0.05，P<0.01)；MTT結(jié)果顯示：姜黃素在3.125～25.000 μmol/L濃度范圍內(nèi)，能顯著促進(jìn)HKC增殖(P<0.05，P<0.01)；姜黃素能對(duì)抗TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，以12.500～50.000 μmol/L的姜黃素作用最明顯，同時(shí)，下調(diào)TGF-β1基因和蛋白的表達(dá)，相反上調(diào)BMP-7基因和蛋白表達(dá)，并伴隨著Ⅰ型膠原基因和蛋白的表達(dá)下降(P<0.05，P<0.01)。 結(jié)論姜黃素能促進(jìn)HKC增殖并維持其表型，能對(duì)抗TGF-β1誘導(dǎo)的HKC向梭形細(xì)胞轉(zhuǎn)化，抑制細(xì)胞上皮TGF-β1和Ⅰ型膠原的表達(dá)，而促進(jìn)BMP-7表達(dá)。

腎疾??；纖維化；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β；姜黃素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7;Ⅰ型膠原

大量研究已證實(shí)，TGF-β1是促進(jìn)各種腎臟疾病纖維化以及移植腎纖維化密切相關(guān)的一種細(xì)胞因子，是誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞(HKC)向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)的關(guān)鍵誘因[1-2]。而骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(bone morphogenetic proteins-7，BMP-7)是腎臟或其他臟器TGF-β1的內(nèi)源性拮抗劑，是細(xì)胞內(nèi)TGF-β1信號(hào)的競(jìng)爭(zhēng)者，它不僅能對(duì)抗TGF-β1誘導(dǎo)的小管細(xì)胞增殖抑制，也是維持小管上皮細(xì)胞功能和表型的關(guān)鍵細(xì)胞因子。此外，研究證實(shí)BMP-7能逆轉(zhuǎn)由TGF-β1誘導(dǎo)的EMT而抑制腎臟上皮管狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化成間質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)小管上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，恢復(fù)損傷的腎小管的功能的作用,減少腎臟纖維化的Ⅰ型膠原產(chǎn)生[3-5]。目前研究證實(shí)，姜黃素具有抗肺、肝、腎纖維化作用，但其抗腎纖維化作用的機(jī)制并不十分清楚[6-8]。筆者推測(cè)姜黃素的抗纖維化作用可能與姜黃素對(duì)HKC生長(zhǎng)，以及對(duì)TGF-β1和BMP-7基因表達(dá)的影響有關(guān)。為此，本實(shí)驗(yàn)欲通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討姜黃素抗腎纖維化的分子生物學(xué)機(jī)制。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器人腎小管上皮細(xì)胞株(human kidney cells,HKCs)購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院；TGF-β1、姜黃素、四甲基偶氮唑鹽(MTT)和胰酶(Sigma)；RT-PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；DMEM 培養(yǎng)基和優(yōu)質(zhì)胎牛血清(Hyclone)。

1.2方法

1.2.1姜黃素對(duì)HKC增殖的影響采用MTT比色分析法檢測(cè)細(xì)胞增殖。HKC用含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)，將細(xì)胞接種于96孔板，加入不同濃度姜黃素：0.780、1.563、3.125、6.250、12.500、25.000、50.000、100.000、200.000 μmol/L，每組設(shè)5個(gè)平行孔及空白對(duì)照孔，培養(yǎng)2 h后吸棄上清液，加入20 μL MTT(5 g/L PBS)，再培養(yǎng)4 h，棄上清液，加入DMSO 溶液100 μL作用10 min，不停振蕩，用自動(dòng)酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)定波長(zhǎng)492 nm的吸光度(A)值。A值越高表明細(xì)胞增殖活性越強(qiáng)。

1.2.2TGF-β1對(duì)HKC細(xì)胞TGF-β1和BMP-7蛋白表達(dá)的影響將傳代的HKC接種于6孔板，實(shí)驗(yàn)分4組，正常對(duì)照組和不同濃度的TGF-β1(1、5、10 ng/mL)刺激組，作用72 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，收集細(xì)胞，提取RNA，采用RT-PCR檢測(cè)TGF-β1基因表達(dá)。

1.2.3TGF-β1和姜黃素聯(lián)合作用對(duì)HKC細(xì)胞 TGF-β1、BMP-7和Ⅰ型膠原基因和蛋白表達(dá)的影響將培養(yǎng)傳代的HKC接種于6孔板內(nèi)，實(shí)驗(yàn)分7組，正常對(duì)照組(僅加培養(yǎng)基)，單純TGF-β1刺激組(5 ng/mL)，其余組為5 ng/mL TGF-β1聯(lián)合不同濃度姜黃素聯(lián)合處理(6.250、12.500、25.000、50.000和100.000 μmol/L)72 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，收集細(xì)胞，提取總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和蛋白免疫印跡法(Wersten blot)檢測(cè)腎小管上皮TGF-β1、BMP-7和Ⅰ型膠原基因和蛋白的表達(dá)。

1.2.4PCR檢測(cè)采用異硫氫酸胍一步法提取成纖維細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，取三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)對(duì)照基因。采用RT-PCR對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。所用引物如下：人TGF-β1(339 bp)，P1：5′-GGG ACT ATC CAC CTG CAA GA-3′,P2:5′-CGG AGC TCT GAT GTG TTG AA-3′；人BMP-7(304 bp)，P1：5′-ATG TTC ATG CTG GAC CTG TAC-3′，P2：5′-GGA TGT AGT CCT TGT AGA TCC-3′；Ⅰ型膠原(α1鏈,214 bp)，P1:5′-CCA AAT CTG TCT CCC CAG AA-3′，P2:5′-TCA AAA ACG AAG GGG AGA TG-3′；GAPDH(591 bp)，P1：5′-GGC AAA TTC CAT GGC ACC GTC -3′，P2：5′-TTC TAG ACG GCA GGT CAG GTC-3′。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物10 μL在1×電泳緩沖液Tris-乙酸(TAE)制備2.0%瓊脂糖凝膠中電泳，加入濃度為0.5 μg/mL的溴化乙啶(EB)染色，取10 μL PCR產(chǎn)物，用DL2000做分子量標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判斷PCR產(chǎn)物片段大小，恒壓5 V/cm電泳，然后用凝膠掃描儀觀察并掃描。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以檢測(cè)條帶與GAPDH條帶的總灰度值的比值(IOD)作為檢測(cè)目的片段的相對(duì)值。

1.2.5Wersten blot檢測(cè)HKC細(xì)胞TGF-β1和BMP-7基因以及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)HKCs經(jīng)不同濃度TGF-β1單獨(dú)或聯(lián)合姜黃素處理72 h后，提取細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。各組取等量總蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂牛奶-PBS封閉后，分別加入一抗：TGF-β1、BMP-7和Ⅰ型膠原(均為1∶500稀釋)，β-actin (1∶5 000稀釋)，4 ℃搖床上孵育過(guò)夜。次日洗膜，加入二抗(羊抗兔，1∶10 000稀釋)，室溫孵育2～3 h。洗膜后，采用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光法顯色，顯影于X線片上。采用Lab Works 4.6軟件對(duì)目的條帶和β-actin條帶行灰度值分析，計(jì)算兩者比值代表目的蛋白表達(dá)的相對(duì)量。

2　結(jié)　果

2.1不同濃度姜黃素和TGF-β1共同作用對(duì)HKC細(xì)胞形態(tài)變化的影響HKC為貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，呈鋪路石樣外觀。單純姜黃素作用對(duì)HKC細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯影響，高濃度姜黃素100.000 μmol/L刺激能使HKC細(xì)胞之間的黏附性下降，部分細(xì)胞呈梭形改變，部分細(xì)胞分離、懸浮，見(jiàn)圖1。不同濃度TGF-β1(1、5、10 ng/mL)刺激HKC，都能顯著促進(jìn)HKC由上皮樣形態(tài)向梭形樣形態(tài)轉(zhuǎn)化，并且細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，少部分細(xì)胞脫落、懸浮，隨著TGF-β1濃度和刺激時(shí)間的增加，發(fā)生形態(tài)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞數(shù)量也增加。當(dāng)姜黃素和TGF-β1共同作用時(shí)，隨著姜黃素濃度(6.250、12.500、25.000、50.000、100.000 μmol/L)的增加，細(xì)胞向梭形形態(tài)轉(zhuǎn)化的數(shù)量逐漸減少。當(dāng)姜黃素濃度為12.500～50.000 μmol/L(B、C、D組)時(shí)，絕大部分小管上皮細(xì)胞維持著上皮樣形態(tài)(鵝卵石形)，細(xì)胞間連接緊密，并且細(xì)胞數(shù)量較多。由此表明姜黃素在一定的濃度范圍內(nèi)能夠?qū)筎GF-β1 誘導(dǎo)的HKC向梭形樣形態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而維持腎小管上皮形態(tài)特征(圖1)。

N：正常對(duì)照組；NT：?jiǎn)渭僒GF-β1(5 ng/mL)刺激組；A：姜黃素6.25 μmol/L+TGF-β1 5 ng/mL；B：姜黃素12.5 μmol/L+TGF-β1 5 ng/mL；C：姜黃素25 μmol/L+TGF-β1 5 ng/mL；D：姜黃素50 μmol/L+TGF-β1 5 ng/mL；E：100 μmol/L+TGF-β1 5 ng/mL。刺激72 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化(×200)。

圖1不同濃度姜黃素和TGF-β1共同作用對(duì)HKC細(xì)胞形態(tài)變化的影響

2.2姜黃素對(duì)HKC細(xì)胞增殖的影響MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較(圖2)，0.780、1.563 μmol/L姜黃素刺激HKC對(duì)細(xì)胞增殖活性沒(méi)有顯著影響(P>0.05)，但在3.125～25.000 μmol/L濃度范圍內(nèi)，姜黃素能顯著促進(jìn)HKC增殖(P<0.05)，6.250 μmol/L時(shí)，HKC增殖達(dá)峰值，隨后隨姜黃素濃度進(jìn)一步增加，細(xì)胞增殖活性卻逐漸下降，12.500、25.000 μmol/L濃度時(shí)，細(xì)胞增殖活性仍顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，50 μmol/L濃度時(shí)對(duì)HKC增殖活性沒(méi)有影響，100.000 μmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖活性顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。

a:P<0.05,b:P< 0.01，與正常對(duì)照組比較。

圖2MTT法檢測(cè)姜黃素對(duì)HKC細(xì)胞增殖的影響

2.3不同濃度TGF-β1作用后HKC細(xì)胞TGF-β1基因表達(dá)變化與正常對(duì)照組(0 ng/mL TGF-β1)不同濃度TGF-β1 作用于腎小管上皮細(xì)胞株HKC 72 h后，均能顯著促進(jìn)其表達(dá)TGF-β1(P<0.05)；并且隨著TGF-β1濃度的增加，TGF-β1基因的表達(dá)水平也顯著增加，于10 ng/mL濃度時(shí)，HKC表達(dá)TGF-β1基因的水平達(dá)峰值(P<0.01，圖3)。

a：P<0.05,b：P<0.01，與正常對(duì)照組比較。

圖3不同濃度TGF-β1作用于HKC細(xì)胞72 h后，其TGF-β1基因的表達(dá)變化

2.4TGF-β1和姜黃素聯(lián)合作用對(duì)HKC細(xì)胞 TGF-β1和BMP-7基因和蛋白表達(dá)的影響與正常對(duì)照組比較，TGF-β1刺激能顯著上調(diào)HKC細(xì)胞TGF-β1、而下調(diào)BMP-7的基因和蛋白的表達(dá)(P<0.01)；然而，當(dāng)TGF-β1與不同濃度姜黃素聯(lián)合刺激HKC時(shí)，在12.500～50.000 μmol/L濃度范圍內(nèi)的姜黃素則能對(duì)抗TGF-β1誘導(dǎo)的TGF-β1基因和蛋白的上調(diào)和BMP-7基因和蛋白的下調(diào)(P<0.05)，抑制TGF-β1的表達(dá)，相反促進(jìn)BMP-7的表達(dá)，基因呈低水平表達(dá)。與正常對(duì)照組比較，單純刺激組(5 ng/mL，NT組)處理HKC后，可以顯著促進(jìn)基因表達(dá)上調(diào)；當(dāng)TGF-β1與不同濃度姜黃素聯(lián)合刺激HKC時(shí)，6.250 μmol/L姜黃素仍不能對(duì)抗TGF-β1誘導(dǎo)的HKC細(xì)胞TGF-β1基因的表達(dá)上調(diào)，但隨姜黃素濃度的逐漸增加，則對(duì)HKC細(xì)胞TGF-β1基因表達(dá)的抑制作用也逐漸增加(P<0.05)。當(dāng)姜黃素為100.000 μmol/L濃度時(shí)，這種抑制作用有所減弱，但仍然顯著高于NT組(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

2.5TGF-β1和姜黃素聯(lián)合作用后HKC細(xì)胞Ⅰ膠原mRNA的表達(dá)變化體外培養(yǎng)的HKC細(xì)胞表達(dá)極低水平的Ⅰ型膠原，5 ng/mL TGF-β1單獨(dú)作用細(xì)胞72 h后，Ⅰ型膠原基因表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.01)。但如果加入不同濃度的姜黃素與TGF-β1共同作用后，姜黃素在12.500～50.000 μmol/L濃度范圍內(nèi)可見(jiàn)Ⅰ型膠原基因表達(dá)明顯受抑制(P<0.05,P<0.01)。姜黃素為25.000 μmol/L時(shí)，Ⅰ型膠原基因表達(dá)水平最低(P<0.01)，隨后隨著姜黃素濃度的逐漸增加，Ⅰ型膠原基因表達(dá)有上調(diào)趨勢(shì)，但仍然顯著高于5 ng/mL TGF-β1對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

a:P<0.05,b:P<0.01，與正常對(duì)照組比較；c:P<0.05，與單純TGF-β1刺激組比較。

圖4TGF-β1和姜黃素聯(lián)合處理對(duì)HKC細(xì)胞TGF-β1和BMP-7基因和蛋白的表達(dá)變化

a:P<0.01,與正常對(duì)照組比較；b:P<0.01,c:P<0.05,與單純TGF-β1刺激組比較。

圖5TGF-β1和姜黃素聯(lián)合處理對(duì)HKC細(xì)胞Ⅰ型基因和蛋白的表達(dá)變化

3　討　論

腎間質(zhì)纖維化的主要病理表現(xiàn)為腎間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)累積、腎小管萎縮、腎間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞 (kidney myofibroblasts，KMF)增多等。而腎間質(zhì)KMF是合成細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞，在間質(zhì)纖維化的發(fā)病中起重要作用。研究表明，TGF-β1誘導(dǎo)的HKC向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化是腎間質(zhì)纖維化KMF的重要來(lái)源，也是腎纖維化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵誘因[1-2]。因而，維持HKC特性、抑制EMT的發(fā)生、發(fā)展，已成為控制腎間質(zhì)纖維化的重要途徑之一。內(nèi)源性致纖維化因子TGF-β1和抗纖維化因子BMP-7是一對(duì)對(duì)EMT發(fā)生、發(fā)展起著關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子，其表達(dá)水平的平衡對(duì)于維持腎內(nèi)微環(huán)境的穩(wěn)定起著關(guān)鍵作用。作為具有抗纖維化作用的中藥單體姜黃素可能對(duì)這兩個(gè)因子在腎臟的合成分泌產(chǎn)生重要影響。

姜黃素具有多種藥理功效，除可抗炎、抗細(xì)胞增殖、抗血管增生外，還具有抗組織器官纖維化作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),姜黃素具有抗肝、肺、腎纖維化作用[6-9],證實(shí)姜黃素能顯著改善纖維化大鼠的肝功能和抑制梗阻性腎病大鼠腎纖維化,但對(duì)于姜黃素抗腎纖維化的分子生物學(xué)機(jī)制并不十分清楚。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：姜黃素對(duì)HKC具有明顯的促增殖作用，姜黃素在3.125～25.000 μmol/L濃度范圍內(nèi)，能顯著促進(jìn)HKC增殖(P<0.05)，但高濃度姜黃素 (100.000 μmol/L)則對(duì)HKC增殖表現(xiàn)為抑制作用。同時(shí)，倒置顯微鏡下發(fā)現(xiàn)此時(shí)細(xì)胞有分離、懸浮改變，提示單純這一濃度姜黃素可能對(duì)細(xì)胞具有毒性作用。相反，中、低濃度姜黃素作用于細(xì)胞，細(xì)胞呈現(xiàn)小管上皮典型的鵝卵石形態(tài)，提示此作用濃度姜黃素對(duì)HKC沒(méi)有毒性作用。不同濃度的TGF-β1均能誘導(dǎo)HKC向梭形細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并且隨時(shí)間和濃度的增加，促進(jìn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的數(shù)量也增加。而當(dāng)姜黃素與TGF-β1共同作用時(shí)，姜黃素在12.500～50.000 μmol/L濃度范圍內(nèi)，表現(xiàn)出對(duì)抗TGF-β1的誘導(dǎo)的形態(tài)變化而維持小管上皮樣形態(tài)；由此表明，姜黃素在一定的濃度范圍內(nèi)能促進(jìn)HKC增殖，并且能對(duì)抗TGF-β1誘導(dǎo)的上皮向間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化而維持其上皮樣形態(tài)特征，提示姜黃素可能具有對(duì)抗TGF-β1誘導(dǎo)的EMT的作用，因?yàn)镋MT也是促進(jìn)移植腎纖維化的重要機(jī)制。

BMP-7是TGF-β超家族中的一個(gè)成員，是一種內(nèi)源性腎內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定調(diào)節(jié)因子和重要的腎纖維化拮抗因子，它和TGF-β的平衡影響著腎組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性[4]。外源性給予人工重組BMP-7 可明顯抑制腎間質(zhì)纖維化進(jìn)展，刺激小管上皮細(xì)胞的再生，改善腎功能[10]；BMP-7 能夠促進(jìn)急性腎損傷的修復(fù)[3-4]，以及改善單側(cè)輸尿管梗阻模型、糖尿病腎病、MRL lpr/lpr 狼瘡小鼠模型慢性腎纖維化的進(jìn)展[1-3]。TGF-β1是各種腎臟纖維化過(guò)程中致纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞因子[1-2]。它能直接刺激細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分的合成，能通過(guò)減少蛋白酶的合成和刺激蛋白酶抑制劑(如PAI-1) 阻止ECM 降解。實(shí)驗(yàn)性腎纖維化模型的發(fā)展和小管間質(zhì)纖維化的不斷加重過(guò)程中，BMP-7的表達(dá)進(jìn)行性減少，而TGF-β1則進(jìn)行性增加，二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，由于二者是腎臟小管間質(zhì)纖維化重塑過(guò)程中一對(duì)重要的多功能調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)比值對(duì)于維持腎組織結(jié)構(gòu)和正常生理功能起著重要作用。

在纖維化腎組織內(nèi)BMP-7表達(dá)下調(diào)，而促進(jìn)腎BMP-7合成分泌，不僅可以對(duì)抗TGF-β1誘導(dǎo)的EMT，促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而且有助于維持小管上皮細(xì)胞表型，而且還能促進(jìn)其再生[3-4]。研究證實(shí)，補(bǔ)充外源性BMP-7有助于延緩腎功能不全的進(jìn)展和腎纖維化的形成[3]。Zeisberg等[4]研究發(fā)現(xiàn)，給予rHuBMP-7 (100 ng/mL) 能逆轉(zhuǎn)TGF -β1誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的遠(yuǎn)端腎小管上皮細(xì)胞株和近端腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生的EMT，重新表達(dá)E-鈣黏蛋白、ZO-1 蛋白和細(xì)胞形態(tài)的恢復(fù)。TGF-β1作為強(qiáng)效致纖維化因子，不僅能誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，它還能促進(jìn)腎小管細(xì)胞進(jìn)一步合成分泌TGF-β1，由此可以形成惡性循環(huán)[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HKC呈TGF-β1濃度依賴性地上調(diào)TGF-β1表達(dá)；同時(shí)，倒置顯微鏡下觀察也發(fā)現(xiàn)隨TGF-β1濃度增加，向梭形形態(tài)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞數(shù)量也相應(yīng)顯著增加。但如果再加入不同濃度的姜黃素共同作用，不僅能顯著減少向梭形形態(tài)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞數(shù)量，絕大部分細(xì)胞維持小管上皮樣形態(tài)；同時(shí)，也能顯著減少TGF-β1基因和蛋白的表達(dá)上調(diào)，相反顯著促進(jìn)HKC BMP-7基因和蛋白的表達(dá)。其中，尤其是姜黃素為25.000 μmol/L濃度時(shí)，這一效應(yīng)最為顯著，表明該濃度可能是姜黃素抗纖維化的最佳藥物濃度，對(duì)于臨床用藥有一定的指導(dǎo)意義，并揭示姜黃素作用上調(diào)腎小管細(xì)胞BMP-7/TGF-β1水平，可能是其抗纖維化效應(yīng)重要的分子生物學(xué)機(jī)制。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，姜黃素能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的小管細(xì)胞Ⅰ型膠原基因和蛋白的表達(dá)，以25.000 μmol/L姜黃素的作用最強(qiáng)，表明姜黃素可能通過(guò)抑制TGF-β1誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而減少了Ⅰ型膠原表達(dá)。

由此認(rèn)為，姜黃素一方面可能是通過(guò)促進(jìn)BMP-7表達(dá)，從而促進(jìn)小管上皮細(xì)胞增生、維持上皮樣形態(tài)；另一方面可能對(duì)抗TGF-β1誘導(dǎo)的EMT發(fā)生，從而發(fā)揮抗纖維化效應(yīng)。因此，盡管小管間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病，以及移植腎腎病的一個(gè)顯著特征，控制腎臟纖維化發(fā)展至終末期腎衰竭目前仍然沒(méi)有特異性的治療方法，但姜黃素作為一種中藥有效成分，可能為其治療帶來(lái)新希望。

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To investigate the anti-fibrotic molecular mechanisms of curcumine in kidney*

Zhu Fangqiang1,Chen Minjia1,Zhu Ming1,Xu Xiang1,Zhao Hongwen2,Liu Hong2,Yu Rongjie2,Wu Xiongfei2,Huang Hong1△

(1.StateKeyLaboratoryofTrauma,BurnandCombinedInjury,InstituteofSurgeryResearchofDapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China;2.DepartmentofNephrology,SouthwestHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China)

ObjectiveIn order to provide experiment evidences for clinical therapy,we investigate the molecular biologic mechanisms of anti-kidney fibrosis of curcumine.MethodsThe effect of curcumin on the proliferation of HKC was measured by MTT.The morphology of cells was observed by phase contrast microscopy,and the expressions of TGF-β1,BMP-7 and type Ⅰ collagen were analyzed by reverse transcription polymerase chain reaction and Wersten blot.ResultsHKC cells showed a classic cobblestone morphology.Exposure of HKC to TGF-β1 for 72 h induced a complete conversion of the epithelial cell to myofibroblast.Low dose curcumine could effectively promote HKC cells proliferation(P<0.05,P<0.01).When HKC were co-incubated with TGF-β1 and different concentration curcumine for 72 h,curcumin could maintain the epithelial morphology in a dose-dependent manner concomitantly with decreased expression of TGF-β1and type Ⅰ collagen,and increased expression of BMP-7.ConclusionCurcumine can promote the proliferation of kidney tubular epithelial cells,and may be a potent inhibitor of TGF-β1 induced EMT.Curcumine could inhibits TGF-β1 induced upregulating BMP-7 expression and donwregulating TGF-β1 and type Ⅰ collagen expression,which may be the anti-fibrotic mechanisms of curcumine in kidney.

kidney diseases;fibrosis;transferming growth factor beta;curcumine;bone morphogenetic protein-7;typeⅠcollagen

創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金資助(200717);國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展973項(xiàng)目(2012CB518104)。作者簡(jiǎn)介：朱方強(qiáng)(1965-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事腎臟再生與修復(fù)的研究?！?/p>

，E-mail:huanghongcq@163.com。

R363.2

A

1671-8348(2016)26-3601-04

2016-03-18

2016-06-15)