雷公藤紅素對IgA腎病大鼠腎臟組織中Notch信號通路表達的影響研究

劉　丹，王彩麗

(包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，內(nèi)蒙古包頭 014010)

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·論著·

雷公藤紅素對IgA腎病大鼠腎臟組織中Notch信號通路表達的影響研究

劉丹，王彩麗

(包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，內(nèi)蒙古包頭 014010)

目的探討雷公藤紅素對IgA腎病大鼠腎臟組織中Notch信號通路表達的影響。方法建立IgA腎病大鼠模型，觀察雷公藤紅素治療后大鼠血尿、蛋白尿情況，采用免疫組織化學和實時熒光定量PCR檢測Notch1、Jagged1及其下游靶基因Hes1、Hey1的表達。結果與對照組比較，IgA腎病模型組血尿及24 h尿蛋白定量明顯增高(P<0.05)；第16、20周末與模型組比較，貝那普利組及雷公藤紅素干預組血尿、24 h尿蛋白定量明顯下降(P<0.05)，且貝那普利組及高劑量組較低劑量組下降明顯(P<0.05)。各組大鼠尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、谷丙氨基酸轉移酶(ALT)、谷草氨基酸轉移酶(AST)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。對照組大鼠腎小球、腎小管細胞質中Notch1、Jagged1僅有少量表達，在模型組大鼠腎臟組織的腎小球及腎小管細胞質中表達明顯增加，貝那普利組、低劑量組、高劑量組Notch1、Jagged1的表達較模型組減弱，但仍高于對照組。而Hes1、Hey1在對照組大鼠腎小球、腎小管細胞質中基本無表達，在模型組大鼠腎臟組織的腎小球細胞核表達增加，貝那普利組、低劑量組、高劑量組Hes1、Hey1的表達較模型組減弱，但仍高于對照組。結論雷公藤紅素可以通過抑制IgA腎病大鼠腎組織中Notch信號通路的表達，減少血尿、蛋白尿的生成，從而對大鼠IgA腎病起到治療作用。

腎小球腎炎，IgA；大鼠；Notch信號通路；雷公藤紅素

IgA腎病是一種進展性腎病，臨床表現(xiàn)多種多樣，15%～40%的患者在發(fā)病后10～20年內(nèi)發(fā)展為終末期腎病(ESRD)[1]，給家庭及社會造成巨大經(jīng)濟負擔。目前因其病因和發(fā)病機制仍不明確，治療僅以對癥及免疫抑制為主[2]。近年來，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)Notch信號通路不僅僅在腎臟發(fā)育過程中起重要作用，還參與了腎小球疾病的發(fā)生[3]。陳燕[4]通過對38例IgA腎病患者研究發(fā)現(xiàn)，Notch1和Jagged1參與了IgA腎病的腎間質纖維化的發(fā)生和發(fā)展，其表達隨著腎間質纖維化程度的加重而增加。雷公藤制劑是已知的中藥類免疫抑制劑，其抗炎及免疫抑制作用已通過大量實驗被證實，應用于腎臟疾病中可減輕血尿、蛋白尿情況[5]。雷公藤紅素也是雷公藤多甙的有效成分之一[6]。本研究通過建立IgA腎病大鼠模型，給予雷公藤紅素干預治療，檢測Notch信號通路家族成員的表達，觀察雷公藤紅素是否影響IgA 腎病大鼠腎臟組織中Notch信號通路的表達，緩解腎間質纖維化，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1材料SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[合格證號：SCXK(京)2012-0001]；牛血清清蛋白(BSA)購自美國Sigma公司；四氯化碳(CCL4)購自天津化學試劑有限公司；脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司；兔抗Notch1多克隆抗體購自美國Cell Signal公司；兔抗Jagged1多克隆抗體、 兔抗Hey1多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；兔抗Hes1多克隆抗體購自美國Abcam公司；組織RNA提取試劑盒及real-time PCR試劑盒購自上海諾倫生物醫(yī)藥技術有限公司；鹽酸貝那普利片由北京諾華制藥有限公司提供；雷公藤紅素購自成都普菲德生物技術有限公司。

表1　各組大鼠不同時相尿紅細胞計數(shù)比較±s，個/HP，n=10)

*：P<0.05，與第16周末比較；□：P<0.05，與模型組第16周末比較；△：P<0.05，與低劑量組第16周末比較；■：P>0.05，▲：P<0.01，○：P<0.05，與模型組第20周末比較；▼：P<0.05，與低劑量組第20周末比較；▽：P>0.05，與高劑量組比較；#：P<0.05，與第20周末比較。

表2　　各組大鼠不同時相24 h尿蛋白定量的比較

△：P<0.05，與對照組比較；▲：P<0.05，與模型組比較；■：P>0.05，與貝那普利組比較；□：P<0.05，與低劑量組比較。

1.2方法

1.2.1IgA腎病動物模型建立及分組參考湯穎等[7]模型制備方法，選取SPF級別的SD雄性大鼠60只，分為對照組(14只)和造模組(46只)。造模組通過BSA 600 mg/kg隔日灌胃，持續(xù)12周，皮下注射CCL40.1 mL+蓖麻油0.5 mL，每周1次，持續(xù)12周，并于第6、8周尾靜脈注射LPS(每只0.05 mg)的方法造模；對照組以等量蒸餾水灌胃及等量生理鹽水注射。實驗第13周，在造模的大鼠中抽取6只、對照組抽取4只處死，取腎臟進行光鏡及免疫熒光檢測，評價造模是否成功，造模成功后分為模型組、貝那普利組、雷公藤紅素1 mg-1·kg-1·d-1干預組(低劑量組)、雷公藤紅素10 mg-1·kg-1·d-1干預組(高劑量組)，每組各10只。于實驗第13周開始給予雷公藤紅素及貝那普利干預，直至20周末。

1.2.2標本采集各組大鼠分別于第12、16、20周末，用代謝籠收集尿液，用于尿沉渣、蛋白尿的測定。實驗結束后，各組大鼠由10%水合氯醛麻醉后，開腹，腹主動脈采血行生化檢測，取腎組織行免疫熒光、免疫組織化學、實時熒光定量PCR檢測。

1.2.3免疫熒光檢測大鼠腎臟組織取出后用組織包埋劑OCT包埋后，放入液氮速凍，然后將冰凍切片制成3 μm厚的切片。用冷風機將冰凍切片吹干，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次3 min。滴加FITC標記的IgA抗體(1∶50稀釋)，37 ℃恒溫箱孵育30 min，PBS洗滌3次，每次3 min。甘油封片，熒光顯微鏡讀片。免疫熒光強度分級半定量標準參照國內(nèi)外通用的5級法分級：低倍鏡下不能顯示，高倍鏡下似乎可見，為±；低倍鏡下似乎可見，高倍鏡下可見，為+；低倍鏡下可見，高倍鏡下清晰可見，為++；低倍鏡下清晰可見，高倍鏡下耀眼，為+++；高倍鏡下刺眼，為++++。

1.2.4免疫組織化學檢測采用免疫組織化學SP染色法，檢測腎臟組織中Notch1、Jagged1、Hes1、Hey1的表達。將蠟塊包埋固定的腎臟組織切片后脫蠟至水，采用高壓修復法進行抗原修復，加入正常山羊血清封閉內(nèi)源性生物素，甩掉血清滴加第一抗體(Notch1 1∶200、Jagged1 1∶200、Hes1 1∶200、Hey1 1∶200)，4 ℃過夜，次日取出切片，室溫下復溫平衡后加生物素標記的二抗及鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡進行觀察。

1.2.5實時熒光定量PCR檢測應用Total RNA Extraction Kit提取試劑盒提取總RNA。反轉錄反應體系總體積為20 μL，按照反轉錄說明書合成cDNA。引物序列分別為：Actb，上游引物5′-CGT AAA GAC CTC TAT GCC AAC A-3′，下游引物5′-GTT GGT GTC GCA GTT GGA G-3′；Notch1，上游引物5′-GAC CGT GTG GCT TCC TTC TA-3′，下游引物5′-GTT GGT GTC GCA GTT GGA G-3′；Jagged1，上游引物5′-CAT GGC CTC CAA CGA TAC TC-3′，下游引物5′-GGT GAA TTT GCC TCC TGA CT-3′；Hes1，上游引物5′-GTG GGT CCT AAC GCA GTG TC-3′，下游引物5′-TGA TTA GCA GTG GCC TGA GC-3′；Hey1，上游引物5′-GGC TGA AGT TGC CCC TTA T-3′，下游引物5′-GCT GGG ATG CGT AGT TGT TG-3′，均由上海生工生物工程公司合成。反應條件：95 ℃ 3 min 預變性；95 ℃ 12 s 變性、60 ℃ 40 s 退火，40個循環(huán)結束。每個樣本每個基因3個重復。每個樣本的基因拷貝數(shù)以Ct值表示，各個基因的相對表達用2-△△Ct進行統(tǒng)計。

2　結　　果

2.1血尿、尿蛋白比較與對照組比較，模型組血尿及24 h尿蛋白定量明顯增高(P<0.05)；第16、20周末與模型組比較，貝那普利組及雷公藤紅素干預組血尿、24 h尿蛋白定量明顯下降(P<0.05)，且貝那普利組及高劑量組較低劑量組下降明顯(P<0.05)。見表1、2。

2.2血生化指標分析各組大鼠尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、谷丙氨基酸轉移酶(ALT)、谷草氨基酸轉移酶(AST)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3　　各組大鼠血生化指標比較

A：對照組；B：模型組。

圖1大鼠腎臟組織免疫熒光檢測(×400)

2.3腎臟組織免疫熒光檢測對照組腎小球系膜區(qū)無IgA沉積。模型組大鼠腎臟組織系膜區(qū)可見彌漫性顆粒狀IgA沉積，熒光強度為++～+++，造模成功。見圖1。

A：對照組；B：模型組；C：貝那普利組；D：低劑量組；E：高劑量組。

圖2各組大鼠腎臟組織 Notch1免疫組織化學檢測(×400)

A：對照組；B：模型組；C：貝那普利組；D：低劑量組；E：高劑量組。

圖3各組大鼠腎臟組織Jagged1免疫組織化學檢測(×400)

A：對照組；B：模型組；C：貝那普利組；D：低劑量組；E：高劑量組。

圖4各組大鼠腎臟組織Hes1免疫組織化學檢測(×400)

A：對照組；B：模型組；C：貝那普利組；D：低劑量組；E：高劑量組。

圖5各組大鼠腎臟組織Hey1免疫組織化學檢測(×400)

2.4腎臟組織免疫組化檢測免疫組織化學染色以腎小球、腎小管及間質出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達。對照組大鼠腎小球、腎小管細胞質中Notch1、Jagged1僅有少量表達，在模型組大鼠腎臟組織的腎小球及腎小管細胞質中表達明顯增加，貝那普利組、低劑量組、高劑量組Notch1、Jagged1的表達較模型組減弱，但仍高于對照組。而Hes1、Hey1在對照組大鼠腎小球、腎小管細胞質中基本無表達，在模型組大鼠腎臟組織的腎小球細胞核表達增加，貝那普利組、低劑量組、高劑量組Hes1、Hey1的表達較模型組減弱，但仍高于對照組。見圖2～5。

2.5Notch1、Jagged1、Hes1、Hey1 mRNA表達實時熒光定量PCR結果顯示：與對照組比較，模型組大鼠腎臟組織Notch1、Jagged1、Hes1、Hey1 mRNA表達水平增加(P<0.01)；貝那普利組、低劑量組、高劑量組大鼠腎臟組織Notch1、Jagged1、Hes1、Hey1 mRNA表達水平較模型組降低(P<0.05)，但仍高于對照組，其中貝那普利組、高劑量組大鼠腎臟組織Notch1、Jagged1、Hes1、Hey1 mRNA表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但與低劑量組比較Hey1 mRNA表達水平降低明顯(P<0.05)。見圖6。

A:對照組；B:模型組；C:貝那普利組；D:低劑量組；E:高劑量組；*：P<0.01，與對照組比較；**：P<0.05，與模型組比較；#:P<0.05,與貝那普利組、高劑量組比較；##：P>0.05，與高劑量組比較。

圖6Notch1、Jagged1、Hes1、Hey1 mRNA在各組大鼠腎臟組織中的表達

3　討　　論

IgA腎病發(fā)病率相對較高，是全球范圍內(nèi)常見的一種原發(fā)性腎小球腎炎。在我國，IgA腎病占原發(fā)性腎小球疾病的40.0%～47.2%，而且有報道稱該比例仍有明顯的上升趨勢[1，8]。部分IgA腎病患者在出現(xiàn)首發(fā)癥狀后，每年約有1.5%發(fā)展為ESRD[9]，但因其發(fā)病機制不明，臨床和病理表現(xiàn)多樣，沒有公認、統(tǒng)一的治療規(guī)范[10]。因此，了解其發(fā)生、發(fā)展規(guī)律，并以此作為依據(jù)制訂科學的預防和治療措施，可更好地控制該病的發(fā)生、發(fā)展，避免或延緩患者發(fā)展至ESRD階段。

Notch信號通路是一條相對保守的但廣泛存在于細胞間的信號傳導通路，在哺乳動物體內(nèi)，它參與了腎臟發(fā)育全過程。近年來，對于Notch信號通路的研究不僅僅是其在腎臟發(fā)育過程中的作用，更多的是其在腎小球疾病中的作用?，F(xiàn)已有其與急性腎損傷、糖尿病腎病、腎小管間質纖維化、腎臟腫瘤等疾病的相關性研究報道[11]。但其與IgA腎病的發(fā)生和發(fā)展研究甚少。本實驗通過聯(lián)合應用BSA、CCl4、LPS的方法成功建立了IgA腎病大鼠模型。觀察Notch信號通路中重要組成成員Notch1和Jagged1及其下游靶基因Hes1、Hey1在IgA腎病大鼠腎臟組織中的表達，證明Notch信號通路在IgA腎病大鼠模型中被激活，參與疾病的發(fā)生。此結果在臨床研究及治療中提供了一個新的信息，可以通過阻斷或抑制Notch信號傳導途徑來減緩疾病的進展[12]。

雷公藤紅素是我國傳統(tǒng)中藥雷公藤的一種活性成分，雷公藤制劑具有抗炎免疫調節(jié)作用，不僅對類風濕關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、癌癥等有獨特療效，在腎臟疾病中也發(fā)揮一定作用，可以使腎臟病變減輕，血尿、蛋白尿減輕，但其治療機制尚不明確。本實驗通過建立IgA腎病大鼠模型，應用雷公藤紅素干預后Notch1、Jagged1、Hes1、Hey1 mRNA的表達明顯減少，其中高劑量組在下調Notch1、Jagged1、Hes1、Hey1 mRNA的表達上與貝那普利組無差別，但其作用優(yōu)于低劑量組。由此可見，在IgA腎病的治療上，雷公藤紅素可以通過調節(jié)Notch信號通路的表達起到治療作用。并且在2012年IgA腎病的KDIGO指南也對腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)阻斷劑在IgA腎病治療中的作用給予了充分的肯定[13]。因此，本實驗選用貝那普利作為對照藥物，前瞻性評價雷公藤紅素在IgA腎病中的治療療效及安全性，通過實驗對比，證明雷公藤紅素與貝那普利在治療大鼠IgA腎病中有相同療效。

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Effect of celastrol on the expression of Notch signaling pathway in rats with IgA nephropathy

LiuDan,WangCaili

(DepartmentofNephrology,theFirstAffiliatedHospitalofBaotouMedicalCollege,Baotou,InnerMongolia014010,China)

ObjectiveTo investigate the effect of celastrol on expression of Notch signaling pathway in renal tissues of IgA nephropathic rats.MethodsRat model of IgA nephropathy was established to observe the hematuria and proteinuria statuses in rats after celastrol treatment.Expression levels of Notch1,Jagged1 and downstream target genes Hes1,Hey1 were detected by immunohistochemistry and real-time fluorescence quantitative PCR.ResultsCompared with control group, hematuria and 24 hour urinary protein quantitative in IgA nephropathy model group was significantly increased (P<0.05)；At the end of sixteenth, the 20 week, compared with the model group, hematuria, 24 hour urinary protein quantitative in benazepril group and tripterine intervention group were decreased significantly(P<0.05),compared with low dose group ,benazepril group and high dose group were decreased significantly(P<0.05).The difference of urea nitrogen (BUN), serum creatinine (Scr), alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) among groups had no statistically significant(P>0.05).The Notch1 Jagged1 in glomerular and renal tubular cells in cytoplasm of control group had only a small amount of expression, the expression of Notch1 and Jagged1 in glomerular and tubular cells in the renal tissue of the rats in the model group were significantly increased;compared with the model group,the expression of Notch1, Jagged1 in benazepril group, low dose group, high dose group were decreased, but still higher than the control group.While Hes1 and Hey1 in glomerular and renal tubular cell nucleus in cytoplasm of model group had no expression ,the expression increased in glomerular cell nucleus of the model group,the expression of Notch1, Jagged1 in benazepril group, low dose group, high dose group were decreased, but still higher than the control group.ConclusionCelastrol can reduce the production of hematuria and proteinuria by inhibiting the expression of Notch signaling pathway in renal tissues of IgA nephropathic rats,and thereby exerts a therapeutic effect in rat IgA nephropathy.

Glomerulonephritis,IgA;rats;Notch signaling pathway;celastrol

劉丹(1984-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事腎小球疾病的發(fā)病機制及治療研究。

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.25.001

R692.31

A

1671-8348(2016)25-3457-05

2016-03-18

2016-05-06)