9種蔬菜中紅細胞凝集素的提取與凝集活性研究*

姜　旭，戚　揚，于子瑤，閆　婧，劉　佳，張　聰，趙佳琪，趙　臣

(1．吉林醫(yī)藥學院2011級臨床輸血本科班，吉林吉林 132013；2.吉林醫(yī)學院2014級檢驗技術本科班，吉林吉林 132013；3．吉林醫(yī)藥學院檢驗學院血液檢驗教研室，吉林吉林 132013)

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論著·基礎研究

9種蔬菜中紅細胞凝集素的提取與凝集活性研究*

姜旭1，戚揚1，于子瑤1，閆婧1，劉佳1，張聰1，趙佳琪2，趙臣3△

(1．吉林醫(yī)藥學院2011級臨床輸血本科班，吉林吉林 132013；2.吉林醫(yī)學院2014級檢驗技術本科班，吉林吉林 132013；3．吉林醫(yī)藥學院檢驗學院血液檢驗教研室，吉林吉林 132013)

目的提取9種常見蔬菜中的凝集素，對其凝集紅細胞效應進行研究，并分析溫度和pH對其生物活性的影響。方法以新鮮蔬菜為材料，經(jīng)硫酸銨沉淀、透析，得到蛋白質(zhì)提取液，用人的A型、B型和O型血細胞檢測凝集活性。通過耐熱、耐酸堿實驗比較9種不同蔬菜的紅細胞凝集素的生物活性。結果除大白菜外其余蔬菜均可凝集人類紅細胞，且對不同血型紅細胞的凝集活性各不相同；其中，豆角和土豆對人類紅細胞的凝集強度最強，且對A、B和O型紅細胞都有較強的凝集作用；植物凝集素活性對溫度敏感，隨溫度升高，凝集活性明顯降低；此外，不同種類植物凝集素對酸堿耐受程度不同，堿性更適合凝集素的保存。結論蔬菜“血型”并不同于人類紅細胞血型，可將植物凝集素的特性用于醫(yī)學研究領域。

蔬菜；血型抗原；凝集素

眾所周知，人類紅細胞血型抗體可引起紅細胞凝集[1]，比如A型血人的血漿可以使B型紅細胞發(fā)生凝集，因為A型血人的血漿里含有抗-B抗體，這種抗體可以特異性的與B型紅細胞表面抗原結合，將多個紅細胞聚集在一起，從而引起紅細胞凝集；同理，B型血人的血漿可以使A型紅細胞發(fā)生凝集，O型血人的血漿可以使AB型紅細胞發(fā)生凝集，而O型血人的紅細胞不發(fā)生凝集，這是人類A、B、O血型的遺傳特點。但是研究發(fā)現(xiàn)，每天吃的蔬菜、水果也可以引起紅細胞的凝集，與血型抗體引起的紅細胞凝集非常相似，說明在部分植物體內(nèi)也存在著能凝集紅細胞的物質(zhì)。日本法醫(yī)山本茂對150種蔬菜和500多種水果進行化驗，發(fā)現(xiàn)其中有79種植物具有“血型”反應。例如桃樹葉為A型，枝狀水藻等為B型，蘋果、草莓和西瓜等為O型，李子、桃子和蕎麥等為A、B型。本研究以日常生活中常見的蔬菜為材料，對其進行初步研究。

1　材料與方法

1.1材料黃豆、西紅柿、蔥、土豆、小白菜、大白菜、豆角、香菇、茄子9種新鮮蔬菜均購自農(nóng)貿(mào)市場；2%人標準紅細胞懸液(A型、B型、O型)由吉林醫(yī)藥學院血液檢驗教研室提供；硫酸銨，聚乙二醇20000，碳酸氫鈉，氯化鈉，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，檸檬酸，磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀，氫氧化鈉，甘氨酸，EDTA為國產(chǎn)分析純試劑，由吉林醫(yī)藥學院血液檢驗教研室提供。

1.2方法

1.2.1蔬菜凝集素的分離和提取蔬菜洗凈、晾干(土豆去皮，豆角去皮取豆角豆)，各取50 g剪碎，按1∶2加入0.9%生理鹽水，用組織搗碎機搗碎勻漿，4 ℃ 4 000 r/min離心40 min取上清液，加入硫酸銨達到60%飽和度，4 ℃過夜。4 ℃ 4 000 r/min離心50 min后收集沉淀，用磷酸鹽緩沖液(PBS)pH 7.4溶解，4 000 r/min離心10 min除去不溶物，取上清液在PBS中透析過夜，轉(zhuǎn)入蒸餾水中透析3 h，再置于聚乙二醇20000中吸水濃縮，得到粗品溶液，用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，用PBS調(diào)整濃度至10 mg/mL，置于4 ℃?zhèn)溆肹2]。

1.2.2血細胞凝集活力試驗在96孔板中加入30 μL PBS，在第1孔中加入凝集素樣品30 μL，混勻后取30 μL加入第2孔進行倍比稀釋。每孔加入15 μL 2%人標準紅細胞懸液(A型、B型、O型)，混勻靜置5 min后觀察凝集強度，肉眼觀察與顯微鏡觀察相結合判斷結果。以樣品稀釋度最高且有顯著凝集現(xiàn)象的稀釋倍數(shù)判定為凝集效價，記錄2n。

1.2.3凝集素熱穩(wěn)定性檢測在96孔板中加入30 μL PBS，取凝集素樣品30 μL進行倍比稀釋后，置于4 ℃、20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃水浴中保溫5 min后取出，待其冷卻至室溫，加入15 μL 2%人標準紅細胞懸液(O型)，混勻靜置10 min后，鏡檢觀察凝集強度。以樣品稀釋度最高且有顯著凝集現(xiàn)象的稀釋倍數(shù)判定為凝集效價，記錄2n。

1.2.4凝集素耐酸、堿能力檢測在96孔板中分別加入30 μL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 5.0～6.0)或甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 8.5～9.0)，取凝集素樣品30 μL進行倍比稀釋后，加入15 μL 2%人標準紅細胞懸液(O型)，混勻靜置10 min后，鏡檢觀察凝集強度。以樣品稀釋度最高且有顯著凝集現(xiàn)象的稀釋倍數(shù)判定為凝集效價，記錄2n。

2　結　　果

2.1不同蔬菜中植物凝集素活力檢測除大白菜外其他蔬菜對人紅細胞均產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。黃豆、土豆、豆角、豆角豆、西紅柿、小白菜和蔥對A型、B型和O型3種紅細胞均產(chǎn)生凝集現(xiàn)象；以黃豆、土豆、豆角和西紅柿的凝集強度最強，而小白菜和蔥凝集活性較低；此外，香菇對B型和O型紅細胞有弱凝集現(xiàn)象，對A型血細胞無凝集；茄子對O型紅細胞有弱凝集現(xiàn)象，對A型和B型血細胞均無凝集。見圖1、表1。

A:凝集強度4+；B：凝集強度3+；C：凝集強度2+；D：凝集強度1+；E:凝集強度-。

圖1不同凝集強度圖(×10)

2.2植物凝集素的熱穩(wěn)定性分析黃豆、土豆、西紅柿、豆角中凝集素熱穩(wěn)定性較好，在80 ℃高溫仍有凝集活性；而蔥、小白菜、香菇、茄子在40 ℃即失去凝集活性，顯示其熱穩(wěn)定性較差。見表2。

表1　　植物凝集素對紅細胞凝集活力的檢測

-：凝集反應陰性。

表2　　溫度對植物凝集素凝集活力的影響

-：凝集反應陰性。

2.3凝集素耐酸、堿能力分析黃豆、土豆、西紅柿和豆角、豆角豆中植物凝集素在pH為5.0～6.0和8.5～9.0的酸、堿環(huán)境中均保持較強凝集活性，具有較強的耐酸、堿能力；蔥在pH為5.0～6.0的酸性環(huán)境中仍有凝集活性，但是在堿性環(huán)境下凝集活性消失；小白菜、香菇和茄子在酸、堿環(huán)境下凝集活性均完全消失，表明其耐酸、堿能力較差。見表3。

表3　　pH值對植物凝集素凝集活力的影響

-：凝集反應陰性。

3　討　　論

本研究中除大白菜外其余蔬菜都可以凝集紅細胞，黃豆、西紅柿、蔥、土豆、小白菜、豆角和豆角豆均可凝集A型、B型和O型紅細胞，香菇能凝集B型和O型紅細胞，茄子可以凝集O型紅細胞，那是不是說明上述蔬菜就分別相當于人類的A型、B型或者O型血呢？很顯然不是，上述幾種蔬菜凝集紅細胞的特征不同于人類A、B、O血型的抗原抗體凝集的規(guī)律性，因而不能說某種蔬菜是A型血或者B型血。植物之所以能凝集紅細胞是因為其體內(nèi)存在著能與紅細胞表面糖鏈結合的蛋白成分，稱為植物凝集素[3]，與人類血型抗體功能類似，但并非同一種物質(zhì)，也不具有人類血型遺傳的規(guī)律性。

植物凝集素是來源于植物的一類能凝集細胞和沉淀單糖或多糖復合物的非免疫來源的非酶蛋白質(zhì)[4]。一個凝集素分子通常具有兩個以上的糖結合位點，因而能同時與多個細胞結合，使游離的單細胞聚集成團，起到類似于紅細胞血型抗體的作用。植物凝集素是一種天然的生物活性物質(zhì)，不但能凝集紅細胞，還可凝集其他細胞，如精子、淋巴細胞、細菌等[5]，是分離純化和研究糖復合物結構與功能的重要的工具，是闡明糖和蛋白質(zhì)相互作用機制的理想模型。在免疫學上，植物凝集素是促淋巴細胞有絲分裂劑；在神經(jīng)學科上，可用于研究神經(jīng)元表面結構，外周神經(jīng)元損傷帶來的后果及其修復機制，細胞神經(jīng)遞質(zhì)受體等[6]；在生殖醫(yī)學上，植物凝集素可通過降低精子生存期或?qū)е戮油耆苿硬l(fā)生不可逆致死來達到避孕和抗早孕的目的[7]，還可通過引起胎盤組織組織壞死、細胞凋亡或副凋亡途徑達到終止小鼠中晚期妊娠[8]。

植物凝集素還可用于構成免疫毒素和作為有效的免疫佐劑及靶向性運載工具等[9]。此外，有報道稱植物凝集素對小鼠骨髓細胞微核發(fā)生率有一定影響[10-11]。

本研究通過對蔬菜的凝集素的研究發(fā)現(xiàn)，不同蔬菜中植物凝集素的水平不同，不同蔬菜的凝集素活力也不同。黃豆、西紅柿、土豆和豆角的凝集強度最強，茄子、小白菜和蔥的凝集活性最弱，大白菜則沒有凝集紅細胞的活力。本研究中，香菇對A型血細胞無凝集，茄子對A型、B型血細胞均無凝；豆角豆對O型紅細胞凝集強度最強，對A型和B型紅細胞的凝集強度較弱，而完整的豆角對A型、B型和O型紅細胞都有較強的凝集現(xiàn)象，證明豆莢和豆中都有凝集素，且豆莢的凝集素活力比豆角豆的凝集活力強。在熱穩(wěn)定性方面，黃豆、土豆、西紅柿和豆角在80 ℃高溫仍有凝集活性，表明其植物凝集素的熱穩(wěn)定性較好，而蔥、小白菜、香菇、茄子在40 ℃即失去凝集活性，顯示其熱穩(wěn)定性較差。此外，西紅柿、蔥、土豆在酸、堿性環(huán)境下凝集活性無變化。豆角在酸性環(huán)境下變化較大，在堿性環(huán)境無變化，香菇在酸、堿性環(huán)境下凝集活性消失，黃豆在酸、堿性環(huán)境下凝集活性減弱。

有研究表明，有些凝集素對紅細胞的凝集作用具有種屬專一性，有的則沒有種屬專一性[6]。例如，狗脊蕨凝集素對人的A型、B型和O型血細胞的凝集活性相差不大，對其他種屬來源的紅細胞凝集活性有較大的差異，而紅花菜豆凝集素對多種動物的紅細胞具有凝集作用。在本研究中，不同蔬菜對A型、B型和O型紅細胞表現(xiàn)出不同的凝集效應，黃豆對A型和O型紅細胞凝集活力更強，香菇對B型和O型血細胞具有凝集效應，茄子只表現(xiàn)出對O型血細胞的凝集效應，而西紅柿、蔥、土豆、小白菜和豆角對3種紅細胞凝集活力基本相同。上述結果表明，不同的植物凝集素凝集紅細胞效應是基于其對紅細胞表面不同糖鏈的結合，不同蔬菜之間具有不同的種屬特異性，由于不同的凝集素的糖結合特異性不會因環(huán)境而異，因此其對于不同細胞的凝集能力的不同能表明不同細胞表面糖受體組成的差異，這與人類A、B、O血型抗體結合紅細胞表面的A抗原或B抗原而產(chǎn)生的紅細胞凝集效應類似，但并不同于人類血型抗體。

總之，凝集素雖能凝集人紅細胞，但并不同于人類紅細胞血型抗體。不同種類植物凝集素凝集紅細胞的活力不同，糖結合位點也不同，對溫度、酸堿度等變化的耐受程度也不同。明確其生物活性特質(zhì)對研究其生物學功能及開發(fā)其醫(yī)用、藥用價值具有重要作用。

[1]韓蕊，劉裔軍，張明娟．A亞型的血型鑒定與安全輸血[J]．中國衛(wèi)生檢驗雜志，2015，25(14)：2446-2448．

[2]王慶忠，張鷺，吳耘紅，等．14種蔬菜中凝集素的提取和生物活性研究[J]．中國熱帶醫(yī)學，2008，8(5)：749-752,757．

[3]Peumans WJ,Vandamme EJ.Lectins as plant defense proteins[J].Plant Physiol,1995,109(2):347-352.

[4]張廣慧，吳紅英，靳瑾，等．植物凝集素PHA-L對小鼠急性輻射防護作用[J]．輻射研究與輻射工藝學報，2016，34(2)：1-6．

[5]鮑錦庫．植物凝集素的功能[J]．生命科學，2011，23(6)：533-540．

[6]董朝蓬，杜林方，段真．植物凝集素研究進展[J]．天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2003，15(1)：71-76．

[7]王昌梅，張麗芬，楊明潔．白蕓豆植物凝集素對不同物種精子的凝集作用與抗孕效果研究[J]．中國計劃生育學雜志，2010，18(5)：272-276．

[8]楊成煥，楊姚，李闊． 紅蕓豆植物凝集素終止小鼠中晚期妊娠對胎盤組織的影響研究[J]．中國計劃生育學雜志，2010，23(8)：524-529．

[9]王海燕，白曉春，羅深秋．植物凝集素與醫(yī)學應用[J]．生命的化學，2003，23(3)：224-226．

[10]牟龍妹，劉宜子，李佳楠．菜豆植物凝集素對小鼠骨髓細胞微核發(fā)生率的影響[J].江漢大學學報(自然科學版)，2014，42(6)：78-81．

[11]王昌梅，張麗芬，楊明潔，等．蕓豆植物凝集素對小鼠骨髓細胞微核發(fā)生率的影響[J].毒理學雜志，2010，24(3)：211-214．

Extraction and analysis of lectin in 9 vegitables and its biological activity*

JiangXu1,QiYang1,YuZiyao1,YanJing1,LiuJia1,ZhangCong1,ZhaoJiaqi2,ZhaoChen3△

(1.The2011ClinicalTransfusionProfessionalofJilinMedicalUniversity，Jilin，Jilin132013，China；2.The2014MedicalLaboratoryofJilinMedicalUniversity,Jilin,Jilin132013,China;3.DepartmentofBloodTestofJilinMedicalUniversity，Jilin，Jilin132013，China)

ObjectiveTo extract lectins from 9 kinds of vegetables and the red blood cell effect was studied,and the effects of temperature and pH on the biological activity were analyzed.MethodsCrude proteins were extracted from fresh vegetable after ammonium sulfate precipitation and dialysis.Their agglutination activities were screened with type A,type B,and type O erythrocytes of humanbeing.The biological activity were compared by serials of tests including heat-tolerance and pH-tolerance.ResultsIn addition to the Chinese cabbage,the other eight kinds of vegetables can be aggregated human red blood cells,and the agglutination activity of red blood cells of different blood type was different.Among them,the beans and potatoes had the strongest agglutination on human red cells,and also had a strong aggregation effect on type A,B and O red blood cells.The activity of plant lectin was sensitive to temperature,with the increase of temperature,the aggregation activity was obviously decreased;In addition,different kinds of plant lectin was different to the degree of acid and alkali tolerance,and the alkaline was more suitable for the preservation of the lectin.ConclusionThe vegetable "blood type" is different from the human red blood cell type,which can be used in the field of medical research.

vegetables；blood group antigens；lectin

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.25.003

吉林省科技廳自然科學基金項目(20160101179JC)；吉林省衛(wèi)生計生科研計劃項目(2015Z071)。

姜旭(1993-)，本科，主要從事臨床輸血研究。

,E-mail:s2209503@sina.com。

Q945

A

1671-8348(2016)25-3466-03

2016-03-14

2016-06-01)