CCM聯(lián)合HCPT對人膀胱癌BIU-87細胞YAP、TEAD1表達及生物學(xué)功能的影響*

何　江，曹建佳，陳柯宏，王德林△，盛　夏,李文賓,黃亮亮

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院消化神經(jīng)中心　401331;2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科　400016)

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論著·基礎(chǔ)研究

CCM聯(lián)合HCPT對人膀胱癌BIU-87細胞YAP、TEAD1表達及生物學(xué)功能的影響*

何江1，曹建佳2，陳柯宏2，王德林2△，盛夏2,李文賓2,黃亮亮2

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院消化神經(jīng)中心401331;2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科400016)

目的探討姜黃素(CCM)聯(lián)合羥基喜樹堿(HCPT)對人膀胱癌BIU-87細胞中YAP、TEAD1表達及凋亡的作用。方法CCM和HCPT分別單獨與聯(lián)合用藥處理膀胱癌BIU-87細胞。免疫組織化學(xué)檢測膀胱癌組織及癌旁組織中YAP和TEAD1表達情況，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況；RT-PCR和Western blot檢測YAP及TEAD1基因的mRNA和蛋白的表達變化。結(jié)果YAP和TEAD在膀胱癌組織及癌旁組織中均有陽性表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示CCM和HCPT均可有效誘導(dǎo)膀胱癌細胞BIU-87的凋亡。CCM組和HCPT組BIU-87細胞中YAP及TEAD1 mRNA和蛋白表達顯著降低(P<0.05)，聯(lián)合用藥組YAP及TEAD1 mRNA和蛋白表達更低(P<0.05)。結(jié)論CCM和HCPT聯(lián)合用藥抗癌機制可能是通過抑制Hippo信號通路中YAP癌基因表達，下調(diào)TEAD1，并誘導(dǎo)膀胱癌細胞凋亡產(chǎn)生。

姜黃素；膀胱腫瘤；羥基喜樹堿；YAP；TEAD1

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率占90%～95%，居全球惡性腫瘤的第9位[1]。治療主要以早期手術(shù)或聯(lián)合膀胱灌注化療、晚期姑息化療為主，但目前化療機制尚不清楚，化療緩解率較低，因此，尋找抑制膀胱癌生長的藥物及探討其抑癌機制成為當務(wù)之急。

姜黃素(CCM)為姜黃的重要活性物質(zhì)之一，具有多種藥物價值，如抗炎、抗突變、抗腫瘤[2-4]。喜樹堿中提取出的羥基喜樹堿(HCPT)為抗癌作用最強的化合物，具有抗癌特性獨特，高效低毒，抗癌譜面廣，與多種抗腫瘤藥無交叉耐藥等特點，并對某些具有耐藥性的腫瘤仍具有抗癌性。新發(fā)現(xiàn)的Hippo信號通路異常調(diào)控與人類腫瘤密不可分[5]，YAP是Hippo信號通路中下游的關(guān)鍵因子之一，YAP不能直接調(diào)控轉(zhuǎn)錄，需結(jié)合共轉(zhuǎn)錄因子TEAD1影響細胞增殖和凋亡[6]。目前姜黃素與羥基喜樹堿聯(lián)合用藥對膀胱癌BIU-87細胞的研究報道較少，因此，本研究將探討姜黃素與羥基喜樹堿聯(lián)合對人膀胱癌BIU-87細胞中癌基因YAP、下游轉(zhuǎn)錄因子TEAD1增殖和凋亡的影響，旨在為臨床化療提供新的方法，并闡明其抑癌機制。

1　材料與方法

1.1組織學(xué)資料標本為重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科2009年2月至2012年6月36例患者手術(shù)切取的膀胱癌組織及癌旁組織(切取距腫瘤組織大于3 cm的正常膀胱黏膜為癌旁組織)。男25例，女11例，平均年齡57.3歲，均為無放化療治療史的初發(fā)病例。膀胱癌組織病理類型：乳頭狀膀胱癌27例，浸潤性膀胱癌9例。

1.2實驗材料BIU-87細胞受贈于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科王德林教授；CCM、二甲基亞砜(DMSO)均為美國Sigma公司生產(chǎn)；HCPT由重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)實驗室曹維國副教授惠贈；CCK-8試劑盒購自重慶海韻生物公司；胎牛血清購自Gibco公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司。YAP、TEAD1及GADPH引物由博培生物工程技術(shù)有限公司合成；總RNA提取試劑RNAiso、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及Tap酶購自Takara大連寶生物工程有限公司；兔抗人YAP、TEAD1抗體購自Santa Cruz公司；兔抗人β-actin抗體、HRP標記羊抗兔IgG、RIPA蛋白裂解液等試劑均購自四正柏生物技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1細胞培養(yǎng)及藥物處理BIU-87用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在5% CO237 ℃飽和濕度的環(huán)境下培養(yǎng)，待細胞生長密度約至90%時，用0.25%的胰酶將培養(yǎng)瓶中的細胞消化、傳代。實驗分為4組：對照組(未加藥)、CCM組(CCM 10 μmol/L)、HCPT組(HCPT 1 μg/mL)和聯(lián)合用藥組(CCM 10 μmol/L +HCPT 1 μg/mL)。

1.3.2免疫組織化學(xué)標本首先用4%多聚甲醛固定，再經(jīng)梯度乙醇和二甲苯脫水，石蠟包埋后連續(xù)切片，厚度為3～4 μm，選擇鏈霉素抗生物素-過氧化物酶三步法進行YAP、TEAD1表達水平檢測。具體步驟：石蠟切片脫蠟，70%～100%梯度乙醇脫水，枸櫞酸緩沖液高溫修復(fù)3次，冷卻至室溫，洗片3 min×3次；3%H2O2室溫孵育20 min，洗片，5%山羊血清37 ℃封閉30 min，傾去不洗；滴加一抗工作液，4 ℃過夜，洗片，加二抗工作液， 37 ℃孵育30 min，洗片，滴加少許辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液，37 ℃ 孵育30 min，洗片；DAB顯色，自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。結(jié)果以細胞核和(或)細胞質(zhì)中棕黃色出現(xiàn)為陽性染色：細胞中胞質(zhì)棕黃色范圍大于50%，胞核棕黃色范圍大于10%和胞質(zhì)胞核中均有棕黃色反應(yīng)3種情況為高表達(++)；單純胞質(zhì)棕黃色范圍小于50%，胞核棕黃色范圍小于10%為低表達(+)；胞核和胞質(zhì)棕黃色范圍均小于10%的為不表達(-)[7]。

1.3.3細胞凋亡率檢測待培養(yǎng)瓶細胞密度為90%左右時，棄掉培養(yǎng)液， 0.25%胰酶適度消化，吹打均勻，接種2×105/mL于培養(yǎng)瓶。在前期預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)在CCM濃度為10 μmol/L、HCPT濃度為1 μg/mL時抑制膀胱癌BIU-87細胞效率較高。各組培養(yǎng)24 h后，用胰酶消化細胞成單細胞懸液,調(diào)整細胞密度為1×106/mL。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，均勻吹打成細胞懸液轉(zhuǎn)移到1.5 mL的EP管中，分別加入AnnexinⅤ和PI，室溫避光孵育15 min后，F(xiàn)CM測定凋亡率。實驗重復(fù)3次。

1.3.4RT-PCR檢測YAP及TEAD1的mRNA收集上述各組細胞，用RNAiso按說明書提取各組約106個細胞總RNA，用紫外線分光光度計檢測純度和濃度后，將RNA濃度調(diào)成一致并取等量模板，將逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進行PCR反應(yīng)。YAP上游引物：5′-TGA ACA AAC GTC CAG CAA GAT AC-3′,下游引物：5′-CAG CCC CCA AAA TGA ACA GTA G-3′，165 bp;GAPDH內(nèi)參上游引物：5′-ACC ACC ATG GAG AAG GCT GG-3′，下游引物：5′-CTC AGT GTA GCC CAG GAT GC-3′,500 bp ；TEAD1上游引物：5′-TGA ATC AGT GGA CAT TCG TCA-3′，下游引物：5′-GCC ATT CTC AAA CCT TGC ATA-3′,280 bp。擴增基因條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)，72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠進行電泳，以YAP或TEAD1與內(nèi)參GADPH片段的條帶光密度(OD)作半定量值比較作為YAP或TEAD1 mRNA相對表達水平，實驗重復(fù)3次。

1.3.5Western blot檢測YAP及TEAD1的蛋白表達提取各處理組細胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量。每孔上樣60 μg在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進行電泳分離后，將含有目的蛋白的凝膠條帶轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗(1∶200稀釋)于4 ℃冰箱中過夜。TBST洗膜10 min，共3次，然后加HRP標記的二抗(1∶5 000)稀釋，37 ℃ 2 h，再次用TBST洗膜10 min，共3次，放置于凝膠成像儀中免疫印跡化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影，暗室下曝光，以YAP或TEAD1與內(nèi)參β-actin條帶密度比值表示YAP或TEAD1相對蛋白表達量，實驗重復(fù)3次。

2　結(jié)　　果

2.1免疫組織化學(xué)檢測YAP、TEAD1在膀胱癌和癌旁組織中表達36例膀胱癌組織中YAP的陽性率為83.3%(30/36)，棕黃色樣陽性表達見于胞核和胞質(zhì)，染色深；癌旁組織的陽性率為13.9%(5/36)，染色淺，表達多為胞質(zhì)內(nèi)，YAP在膀胱癌和癌旁組織中的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；TEAD1的陽性表達率為63.9%(23/36)，主要位于胞核，染色明顯且深，癌旁組織的陽性表達率為13.9%(3/36)，染色較淺，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表1。

A:YAP在膀胱癌組織的表達；B：YAP在癌旁組織的表達;C:TEAD1在膀胱癌組織的表達；D:TEAD1在癌旁組織的表達。

圖1免疫組織化學(xué)檢測YAP、TEAD1在膀胱癌和癌旁組織中表達(×400)

A：對照組;B：CCM組;C：HCPT組;D：聯(lián)合用藥組。

圖2　　流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況

2.2流式細胞儀檢測細胞凋亡率細胞凋亡率：對照組(3.82±0.11)%，CCM組(12.18±0.33)%，HCPT組(10.83±0.14)%，聯(lián)合用藥組(37.25±1.88)%。各組細胞凋亡率均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，聯(lián)合用藥組顯著高于其他組(P<0.05)。見圖2。

2.3RT-PCR檢測YAP、TEAD1 mRNA表達水平CCM組、HCPT組及聯(lián)合用藥組中YAP、TEAD1 mRNA表達均顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合用藥組中YAP、TEAD1 mRNA表達顯著低于CCM組、HCPT組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、4。

1：對照組；2：CCM組；3；HCPT組；4：聯(lián)合用藥組。

圖3各組YAP mRNA表達變化

2.4Western blot檢測YAP、TEAD1蛋白表達水平與對照組相比，其余3組YAP和TEAD1蛋白表達均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，聯(lián)合用藥組比單獨用藥組下降更明顯(P<0.05)。見圖5。

1：對照組；2：CCM組；3；HCPT組；4：聯(lián)合用藥組。

圖4各組TEAD1 mRNA表達變化

圖5　　各組YAP、TEAD1蛋白表達變化

3　討　　論

膀胱癌發(fā)病率位居泌尿系惡性腫瘤首位，其發(fā)生的具體機制不明。Hippo信號通路可能參與膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展。Li等[8]用免疫組織化學(xué)法檢測發(fā)現(xiàn)YAP在膀胱癌組織中主要表達于細胞核和細胞質(zhì)，不同病例表達強度也不同，陽性表達率高達86.8%，在癌組織及正常組織中的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示YAP在移行上皮細胞腫瘤中發(fā)揮致癌作用。本研究通過免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)YAP和TEAD1在膀胱癌及癌旁組織中分別為高表達和低表達，說明YAP和TEAD1在膀胱癌中具有腫瘤特異性,其可能參與了膀胱癌細胞的增殖調(diào)控作用。

目前膀胱癌主要治療方法仍依靠手術(shù)切除，對于保留膀胱的患者，術(shù)后灌注化療是一種可預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)的有效、可靠手段[9]。臨床上，CCM治療腫瘤主要通過干擾腫瘤細胞增殖和促進腫瘤細胞凋亡來實現(xiàn)，這在以前有類似報道。Chauhan等[10]研究發(fā)現(xiàn)，長期食用姜黃的地區(qū)，其大腸癌及尿路上皮細胞癌的患病率顯著低于其他地區(qū)。HCPT是發(fā)現(xiàn)的喜樹堿衍生物，具有抗癌活性高、毒性低等價值，是臨床上用于膀胱癌化療的重要藥物。羥基喜樹堿影響生物體內(nèi)TopⅠ的活性能力，此酶在調(diào)節(jié)超螺旋、連鎖、去連鎖等一系列包括核酸解節(jié)作用方面發(fā)揮作用，作用于DNA拓撲結(jié)構(gòu)，引起相關(guān)細胞走向死亡。凋亡與基因的激活、表達和調(diào)控等有關(guān)，所以說是生物清除危害機體細胞的主要手段，在生物發(fā)育成長、免疫系統(tǒng)成熟、穩(wěn)定組織及衰老中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。中藥是目前研究腫瘤機制及治療的熱點，開發(fā)抑制增殖、促腫瘤細胞凋亡的中藥是未來研究方向。研究表明，化療藥物通過誘導(dǎo)細胞凋亡這一抗癌機制將會被認為是控制癌癥生長及增殖的最佳途徑[12-13]。本實驗發(fā)現(xiàn)CCM和HCPT誘導(dǎo)膀胱癌細胞凋亡的可能機制，為膀胱癌的聯(lián)合用藥方案提供了可行性實驗研究依據(jù)。

本實驗結(jié)果顯示，單藥組及聯(lián)合用藥組均可誘導(dǎo)膀胱癌BIU-87細胞凋亡，聯(lián)合用藥組細胞凋亡率顯著高于單藥組(P<0.05)，說明CCM和HCPT聯(lián)合用藥方案對膀胱癌可產(chǎn)生更好的療效。在RT-PCR與Western blot檢測中觀察到單藥組和聯(lián)合用藥組，YAP、TEAD1表達量均下降明顯(P<0.05)。CCM和HCPT都干擾了YAP、TEAD1的表達，而聯(lián)合用藥作用更明顯。其機制可能為藥物通過作用癌基因YAP，進而干擾下調(diào)TEAD1的表達來實現(xiàn)抑制膀胱癌細胞的增殖，促進其凋亡。

綜上所述，Hippo信號通路中YAP和TEAD1表達與膀胱癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可能成為腫瘤新的生物標志物之一，為膀胱癌基因靶向治療提供實驗依據(jù)，指明新的方向。CCM和HCPT均能誘導(dǎo)膀胱癌BIU-87細胞凋亡，兩藥聯(lián)用具有疊加效應(yīng)，其機制可能為通過抑制YAP進而阻斷TEAD1的表達來抑制膀胱癌細胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡。至于CCM和HCPT如何抑制Hippo信號通路核心因子YAP，以及對下游產(chǎn)生連鎖的一系列影響，從而誘導(dǎo)膀胱癌凋亡，以后將進一步去深究證實。

[1]Oudard S.Progress in emerging therapies for advanced prostate cancer[J].Cancer Treat Rev，2013，39(3)：275-289.

[2]Gota VS,Maru GB,Soni TG,et al.Safety and pharmacokinetics of a solid lipid volcurcumin particle formulation in osteosarcoma patients and healthy unteers[J].Agric Food Chem,2010,58(4):2095-2099.

[3]Walters DK,Muff R,Langsam B,et al.Cytotoxic effects of curcumin on osteosarcoma cell lines[J].Invest New Drugs,2008,26(4):289-297.

[4]Epstein J,Sanderson IR,Macdonald TT,et al.Curcumin as a therapeutic agent:the evidence from in vitro,animal and human studies[J].Br J Nutr,2010,10(3):1545-1557.

[5]Zhao B,Lei QY,Guan KL.The Hippo-YAP pathway:new connections between regulation of organ size and cancer [J].Curr Opin Cell Biol,2008,20(6):638-646.

[6]Kessler CA,Bachurski CJ,Schroeder J,et al.TEAD1 inhibits prolactin gene expression in cultured human uterine decidual cells [J].Mol Cell Endocrinol,2008,295(1):32-38.

[7]Steinhardt AA,Gayyed MF,Klein AP,et al.Expression of Yes-associated protein in common solid tumors [J].Hum Pathol,2008,39(11):1582-1589.

[8]Li N,Xiao H,Zheng HX,et al.The expression of Yes-associated protein in urothelial tumors of ladder and its clinical significance [J].Shanxi Med Univ,2011,42(5):383-386.

[9]Clark PE,Agarwal N,Biagioli MC,et al.Bladder cancer [J].J Natl Compr Canc Netw,2013,11(4):446-475.

[10]Chauhan DP.Chemotherapeutic potential of curcumin for colorectal cancer [J].Curr Pharm Des,2002,8(19):1695-1706.

[11]Nitiss JL.Investigating the biological functions of DNA topo-isomerases in eukaryotic cells [J].J Biochim Biophys Acta,1998,1400(1/2/3):63-81.

[12]Fishel ML,Newell DR,Griffin RJ,et al.Effect of cell cycle inhibition on Cisplatin-induced cytotoxicity [J].J Pharmacol Exp Ther,2005,312(1):206-213.

[13]McKnight JJ,Gray SB,O′Kane HF,et al.Apoptosis and chemotherapy for bladder cancer [J].J Urol,2005,173(3):683-690.

Effects of curcumin combined with hydroxycamptothecin on the expression of YAP，TEAD1 gene and biological function in human bladder cancer cell line BIU-87*

HeJiang1,CaoJianjia2,ChenKehong2,WangDelin2△,ShengXia2,LiWenbin2,HuangLiangliang2

(1.GastroenterologyandNeurologyCenter,University-TownHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing401331,China;2.DepartmentofUrology,theFirstAffiliatedHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

ObjectiveTo investigate the expression of curcumin (CCM) combined with hydroxycamptothecin (HCPT) on YAP，TEAD1 and apoptosis in human bladder cancer cell line BIU-87.MethodsCCM and HCPT were separately treatment and combined treatment of bladder cancer BIU-87 cells.Immunohistochemical(IHC) method was used to detect expression of YAP and TEAD1 in bladder cancer and tissue adjacent to carcinoma;Apoptosis rate of the human bladder cancer cell BIU-87 was detected by flow cytometry(FCM) instruments after CCM and HCPT were administered alone or in combination;Detection of YAP,TEAD1 gene mRNA and protein expression changes was depended on RT-PCR and Western blot.ResultsThe results showed that YAP and TEAD1 had positive expressions in bladder cancer and tissue adjacent to carcinoma (P<0.05)，the difference had obvious significance.The results of detection by FCM showed that CCM and HCPT both induced apoptosis of bladder cancer cell BIU-87 effectively.The mRNA and protein expression of YAP and TEAD1 in human bladder cancer cell BIU-8 significantly reduced in both CCM group and HCPT group,and mRNA and protein expression of YAP and TEAD1 was lower in the combination group(P<0.05).ConclusionCCM and HCPT combination anti-cancer mechanism may be through inhibiting the Hippo signaling pathway in YAP cancer gene expression,cut TEAD1,and induce bladder cancer cell apoptosis.

curcumin；urinary bladder neoplasms；hydroxycamptothecinm；YAP；TEAD1

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.25.002

國家自然科學(xué)基金資助項目(30972999)。

何江(1974-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事泌尿系腫瘤基礎(chǔ)和臨床方面的研究。

，E-mail：dlwangws@sina.com。

R737.14

A

1671-8348(2016)25-3462-04

2016-03-20

2016-06-08)