內(nèi)蒙古巴彥淖爾地區(qū)臨床型奶牛乳腺炎病原菌的鑒定

趙玉娥，趙智香，趙麗霞，樊國(guó)泰

（1.河套學(xué)院，內(nèi)蒙古 臨河區(qū) 015000；2.金宇保靈生物藥品有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030；3.內(nèi)蒙古烏拉特前旗動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 烏拉特前旗 014400）

內(nèi)蒙古巴彥淖爾地區(qū)臨床型奶牛乳腺炎病原菌的鑒定

趙玉娥1，趙智香1，趙麗霞2，樊國(guó)泰3

（1.河套學(xué)院，內(nèi)蒙古 臨河區(qū) 015000；2.金宇保靈生物藥品有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030；3.內(nèi)蒙古烏拉特前旗動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 烏拉特前旗 014400）

不同地區(qū)奶牛乳腺炎的主要致病菌不同，其發(fā)病率也存在很大的差異。為了進(jìn)一步明確內(nèi)蒙古巴彥淖爾地區(qū)奶牛乳腺炎的發(fā)病情況，以巴彥淖爾地區(qū)4家奶牛場(chǎng)臨床型乳腺炎患牛為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采集80份乳樣進(jìn)行了病原菌的分離培養(yǎng)及生化鑒定，結(jié)果分離到51個(gè)菌株，其中有葡萄球菌31株，鏈球菌6株，腸桿菌14株。該試驗(yàn)明確了該地區(qū)奶牛乳腺炎的主要致病菌，為該地區(qū)奶牛乳腺炎的有效防治及臨床上合理地篩選敏感藥物提供了有利的依據(jù)。

臨床型；奶牛；乳腺炎；病原菌；鑒定

奶牛乳腺炎是由病原微生物感染而引起乳房組織與乳頭發(fā)炎的一種疾病，是奶牛常見(jiàn)病之一。該病對(duì)世界乳制品行業(yè)危害性很大。隨著奶牛業(yè)和乳品工業(yè)的不斷發(fā)展，以及人類(lèi)對(duì)公共衛(wèi)生愈來(lái)愈重視，奶牛乳腺炎的危害已引起了人們的極大關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，世界上多數(shù)國(guó)家奶牛乳腺炎的發(fā)病率約為40%，每頭患牛產(chǎn)奶量平均減少15%［1-2］。我國(guó)奶牛乳腺炎發(fā)病率高于世界平均水平，據(jù)報(bào)道臨床型乳腺炎發(fā)病率為9.7%～55.6%［3］。不同地區(qū)奶牛乳腺炎的主要致病菌不同，奶牛乳腺炎的發(fā)病率也存在很大的差異。同一致病菌在不同時(shí)間的耐藥性也不同，在診療上如果照搬其他地區(qū)的防治措施，很難起到明顯的效果。因此，根據(jù)不同地區(qū)乳腺炎的發(fā)病情況，確定其主要致病菌，可以為該地區(qū)乳腺炎的防治提供有利的依據(jù)。

內(nèi)蒙古巴彥淖爾地區(qū)近年來(lái)奶牛養(yǎng)殖發(fā)展迅速，目前擁有奶?？倲?shù)達(dá)1萬(wàn)多頭。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，由于飼養(yǎng)管理水平、疾病防治技術(shù)有限，致使該地區(qū)奶牛乳腺炎不斷發(fā)生。巴彥淖爾地區(qū)奶牛乳腺炎的主要病原菌也有其地區(qū)特點(diǎn)，到目前為止當(dāng)?shù)貙?duì)該病的研究工作很少，對(duì)主要病原菌及其耐藥性比較模糊。因此，對(duì)巴彥淖爾地區(qū)奶牛場(chǎng)的乳腺炎病原菌進(jìn)行研究有實(shí)際意義。通過(guò)對(duì)巴彥淖爾地區(qū)不同奶牛場(chǎng)臨床型奶牛乳腺炎的發(fā)病情況和主要病原菌進(jìn)行研究，為該地區(qū)奶牛乳腺炎的有效防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，以指導(dǎo)臨床上合理地篩選敏感藥物，幫助各牛場(chǎng)進(jìn)行乳腺炎的預(yù)防和治療，對(duì)巴彥淖爾地區(qū)乳業(yè)的發(fā)展和經(jīng)濟(jì)發(fā)展起到積極作用。

1 試驗(yàn)材料

1.1 奶樣采集用具滅菌離心管（10 mL）、鑷子、75%酒精棉球、碘酊、冰盒、記號(hào)筆等。

1.2 病原菌分離培養(yǎng)基綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、水解酪蛋白瓊脂（MH）、生化培養(yǎng)基等均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 試劑革蘭氏染色劑、蘭州隱性乳房炎診斷液（LMT），以及各種生化微量鑒定管等，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器接種針、顯微鏡（具有浸油鏡頭的生物顯微鏡）、恒溫箱、干燥器、高壓鍋。

1.5 乳樣巴彥淖爾地區(qū)4個(gè)奶牛場(chǎng)的臨床型奶牛乳腺炎患牛乳樣共80份。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 臨床檢查臨床型乳腺炎癥狀明顯，根據(jù)乳汁和乳房的眼觀變化即可判斷：奶牛乳房出現(xiàn)不同程度的發(fā)熱和疼痛，有不同程度腫脹或觸診可摸見(jiàn)腫塊；乳汁有絮片、凝塊，變色等。

2.2 乳樣的采集與體細(xì)胞計(jì)數(shù)

2.2.1 采集乳樣：對(duì)已經(jīng)表現(xiàn)出臨床癥狀的奶牛乳腺炎病例進(jìn)行乳樣采集。采樣前先用溫水洗滌乳房，之后用0.2%新潔爾滅消毒，最后用75%的酒精擦拭乳頭。待乳頭表面皮膚干燥后，每個(gè)乳頭先擠去頭2～3把奶，以排除一些污染的雜菌，然后以無(wú)菌操作的方法取奶樣5 mL（各個(gè)乳室分開(kāi)），標(biāo)明牛號(hào)、乳室、日期后送檢。若遠(yuǎn)途運(yùn)輸則需將乳樣放于冰盒中，當(dāng)天送檢。

圖1 乳汁呈現(xiàn)不同的眼觀變化

2.2.2 體細(xì)胞計(jì)數(shù)：在事先畫(huà)好的有1 cm×1 cm方格的白紙上放1張潔凈的載玻片，搖勻乳樣，取乳樣10 μL滴于方格內(nèi)，每一乳樣涂2格，涂勻，放置于溫箱中使之干燥后用小滴管吸取少量酒精滴于標(biāo)本涂面上，再放在干燥箱中將標(biāo)本固定5 min，然后用革蘭氏染色液迅速染色，甩去余液，待干燥后，用蒸餾水輕輕地漂洗，待干燥后將標(biāo)本置于顯微鏡的油鏡下，選擇50個(gè)有代表性的視野，用計(jì)數(shù)器分別記錄標(biāo)本中體細(xì)胞的種類(lèi)及數(shù)量，最后求出每個(gè)視野體細(xì)胞數(shù)的平均值（計(jì)算時(shí)無(wú)細(xì)胞核的塊狀物質(zhì)及細(xì)胞碎片不計(jì)數(shù)，多核型白細(xì)胞數(shù)作1個(gè)細(xì)胞，在視野邊緣處，凡能看到整個(gè)細(xì)胞一半以上的部分時(shí)，都要計(jì)數(shù)）。

通過(guò)鏡檢，算得每個(gè)視野中平均含有的體細(xì)胞數(shù)，再乘以每毫升奶樣可涂抹出的視野數(shù)（即顯微鏡系數(shù)），即可計(jì)算出每毫升奶樣中含有的體細(xì)胞數(shù)。

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定：按各種病原菌在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)印象、生長(zhǎng)情況，將所分離到的菌進(jìn)行初步分類(lèi)，分成葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌，從而為生化鑒定初步選定鑒定項(xiàng)目。

2.3.2 生化鑒定：根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，對(duì)所分離到的病原菌分別用細(xì)菌生化編碼鑒定管進(jìn)行分類(lèi)鑒定。

圖2 分離菌的菌落形態(tài)

圖3 分離菌菌體的形態(tài)特征

3 結(jié)果

3.1 奶牛乳腺炎病例的臨床癥狀及乳汁性狀大多數(shù)患牛乳房腫脹，觸之有壓痛感，且患病乳區(qū)乳房明顯變硬。乳汁呈現(xiàn)不同的眼觀變化（見(jiàn)圖1a），如血樣乳（見(jiàn)圖1b）、水樣乳（見(jiàn)圖1c）、乳中出現(xiàn)團(tuán)塊狀沉淀和漂浮物（見(jiàn)圖1d）等。

3.2 臨床型奶牛乳腺炎病例牛乳體細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果臨床型乳腺炎病例牛乳性狀基本上都有明顯的眼觀變化，但有的乳樣性狀無(wú)眼觀變化但體細(xì)胞數(shù)卻很高。對(duì)80份乳樣中能夠分離出病原菌的牛乳進(jìn)行體細(xì)胞計(jì)數(shù)，牛乳體細(xì)胞數(shù) （SCC）均值為140.27×104個(gè)/mL。

3.3 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

3.3.1 細(xì)菌菌落、菌體的形態(tài)特征

3.3.1.1 葡萄球菌的菌落、菌體的形態(tài)特征：菌落呈乳白色或灰白色，不透明，在血瓊脂上長(zhǎng)勢(shì)旺盛（見(jiàn)圖2a）。涂片，革蘭氏染色后，鏡檢，葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性，呈圓形，較大，有的單個(gè)，有的成簇（見(jiàn)圖 3a）。

3.3.1.2 鏈球菌的菌落、菌體的形態(tài)特征：血瓊脂上菌落呈灰白色，透明或半透明，隆起，生長(zhǎng)旺盛（見(jiàn)圖2b）。涂片，革蘭氏染色后，鏡檢，鏈球菌為革蘭氏陽(yáng)性，圓或橢圓，菌體較小，呈鏈狀排列（見(jiàn)圖3b）。

3.3.1.3 大腸桿菌的菌落、菌體形態(tài)：菌落生長(zhǎng)旺盛，不透明，發(fā)黃，表面光滑，濕潤(rùn)（見(jiàn)圖2c）。涂片，革蘭氏染色后，鏡檢，大腸桿菌為革蘭氏陰性，呈短桿狀（見(jiàn)圖 3c）。

3.3.2 臨床型乳腺炎病原菌分離鑒定結(jié)果：采集巴彥淖爾地區(qū)4家奶牛場(chǎng) （分別記為S6、S2、Q、H）臨床型乳腺炎病例的80份乳樣，進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，結(jié)果共檢出51株病原菌，有葡萄球菌屬31株、腸桿菌屬細(xì)菌14株、鏈球菌屬細(xì)菌6株，其中葡萄球菌占60.78%、腸桿菌占27.45%、鏈球菌占11.77%。

各牧場(chǎng)病原菌分離鑒定情況見(jiàn)表1～表4。

3.3.3 巴彥淖爾地區(qū)4家牧場(chǎng)臨床型奶牛乳腺炎病例病原菌分離率比較：由圖4可知，不同牧場(chǎng)分離出的臨床型乳腺炎主要病原菌有一個(gè)共同特點(diǎn)，即金黃色葡萄球菌的分離率最高，分離出的革蘭氏陰性桿菌以埃希氏大腸桿菌為主，而鏈球菌屬的分離率比較低。

表1 S6牧場(chǎng)臨床型奶牛乳腺炎病原菌分離鑒定結(jié)果

表2 S2牧場(chǎng)臨床型奶牛乳腺炎病原菌分離鑒定結(jié)果

表4 H牧場(chǎng)臨床型奶牛乳腺炎病原菌分離鑒定結(jié)果

4 討論

4.1 同一地區(qū)不同奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)分離菌種比較該試驗(yàn)對(duì)巴彥淖爾地區(qū)4個(gè)規(guī)模奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)的臨床型奶牛乳腺炎病例進(jìn)行常規(guī)的細(xì)菌分離鑒定，并對(duì)其細(xì)菌分離率進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一地區(qū)不同養(yǎng)殖場(chǎng)，病原菌的種類(lèi)和病原菌分離率不同，這也反映了奶牛乳腺炎因其致病菌不同、養(yǎng)殖條件及養(yǎng)殖環(huán)境不同，發(fā)病率也有所不同。S6牧場(chǎng)臨床型奶牛乳腺炎病例分離的菌株主要以葡萄球菌和埃希氏大腸桿菌為主，S2牧場(chǎng)臨床型奶牛乳腺炎病例分離到的菌株主要以葡萄球菌為主，沒(méi)有分離到鏈球菌屬。Q牧場(chǎng)、H牧場(chǎng)的主要致病菌同樣是葡萄球菌。觀察發(fā)現(xiàn)，S2牧場(chǎng)的環(huán)境衛(wèi)生及設(shè)備是4家牧場(chǎng)中條件最好的，可見(jiàn)飼養(yǎng)管理與奶牛乳腺炎的發(fā)病率有一定的關(guān)系。

4.2 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果與其他地區(qū)的比較總結(jié)巴彥淖爾地區(qū)奶牛乳腺炎病原分離率可知：臨床型奶牛乳腺炎葡萄球菌的分離率為60.78%，腸桿菌為27.45%，鏈球菌為11.77%。與呼和浩特地區(qū)奶牛乳腺炎研究比較，劉蕾2006年報(bào)道呼和浩特地區(qū)臨床型奶牛乳腺炎葡萄球菌分離率為45%，鏈球菌為32%，腸桿菌為10.67%［4］，劉珍認(rèn)為呼和浩特地區(qū)臨床型奶牛乳腺炎病原菌中金黃色葡萄球菌占22.4%，鏈球菌為 14.28%，腸桿菌占 46.83%［5］。該試驗(yàn)結(jié)果與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)研究結(jié)果比較，李宏勝（2011）表明奶牛乳房炎病原菌主要以無(wú)乳鏈球菌為主［6］。其他一些研究報(bào)道乳房炎病原菌主要以金黃色葡萄球菌為主［7-8］。

表3 Q牧場(chǎng)臨床型奶牛乳腺炎病原菌分離鑒定結(jié)果

圖4 臨河地區(qū)四家牧場(chǎng)臨床型奶牛乳腺炎病例病原菌分離率比較

隨著我國(guó)奶牛集約化養(yǎng)殖方式的普及、乳房炎綜合防治措施及各種治療藥物的廣泛應(yīng)用，乳房炎主要病原菌區(qū)系分布也在不斷變化，這與采集地域、牛場(chǎng)環(huán)境、采集時(shí)間以及飼養(yǎng)管理水平等因素都有一定的關(guān)系。

5 結(jié)論

綜上所述，不同地區(qū)臨床型奶牛乳腺炎的主要致病菌有所不同，巴彥淖爾地區(qū)臨床型奶牛乳腺炎的主要致病菌是葡萄球菌 （以金黃色葡萄球菌為主），其次是大腸桿菌。

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［4］劉蕾.呼和浩特地區(qū)臨床型奶牛乳腺炎致病菌篩選及其對(duì)小白鼠致病性的研究［D］.呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

［5］劉珍.呼和浩特地區(qū)臨床型奶牛乳腺炎病原分離鑒定及其對(duì)小白鼠致病性的研究［D］.呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

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Isolation and Identification of Pathogenic Bacteria Associated with Clinical Bovine Mastitis in Bayannur Area of Inner Mongolia

ZHAO Yu-e1，ZHAO Zhi-xiang1，ZHAO Li-xia2，F(xiàn)AN Guo-tai3
（1.Hetao College，Linhe District 015000，China；2.The Spirit Jinyu Biological Pharmaceutical Co.，Ltd.， Hohhot 010030，China；3.Animal Disease Prevention and Control Center of Urad Front Banner of Inner Mongolia,Urad Front Banner 014400，China）

The species of pathogenic bacteria causing dairy cow mastitis varied in different geographic areas,and the incidences of mastitis in different dairy farms also varied.In order to understand the epidemiology characteristics of bovine mastitis in Bayannur area of Inner Mongolia,a total of 80 milk samples were collected from dairy cows with clinical mastitis in four different dairy farms.A total of 51 bacterial strains were isolated and phenotypically identified,including 31 Staphylococcus isolates，6 Streptococcus isolates,and 14 isolates of enteric bacilli.The results of this study was helpful for the understanding of species distribution of main pathogenic bacteria associated with dairy cow mastitis in this region,and may provide scientific basis for the effective prevention and control of bovine mastitis and rational use of antimicrobial agents in veterinary clinic.

clinical mastitis；dairy cow；pathogenic bacteria；identification

S858.23；S852.61

A文章順序編號(hào)：1672-5190（2016）01-0006-04

2015-12-14

趙玉娥（1974—），女，副教授，碩士，主要研究方向?yàn)閯?dòng)物疫病防治。

趙智香（1978—），女，講師，碩士，主要研究方向?yàn)閯?dòng)物疫病防治。

（責(zé)任編輯：錢(qián)英紅）