大孔吸附樹脂分離純化苗藥雪人參中α-葡萄糖苷酶抑制物質的研究

王小果 張汝國 王 明 司高飛

1.黔南民族醫(yī)學高等?？茖W校，貴州 都勻 558000；2.黔南州外僑臺港服務中心，貴州 都勻 558000；3.黔南州民族醫(yī)藥研究協(xié)會，貴州 都勻 558000

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大孔吸附樹脂分離純化苗藥雪人參中α-葡萄糖苷酶抑制物質的研究

王小果 張汝國 王 明 司高飛

1.黔南民族醫(yī)學高等?？茖W校，貴州 都勻 558000；2.黔南州外僑臺港服務中心，貴州 都勻 558000；3.黔南州民族醫(yī)藥研究協(xié)會，貴州 都勻 558000

目的：篩選出純化苗藥雪人參中α-葡萄糖苷酶抑制物質的最佳大孔樹脂，并對影響分離純化的主要因素進行探討，確定最優(yōu)工藝參數。方法：采用分光光度法和酶標法測定雪人參乙醇提取液中α-葡萄糖苷酶抑制物質的含量，并通過靜態(tài)吸附和動態(tài)吸附兩種方法篩選出最佳大孔樹脂，以α-葡萄糖苷酶抑制物質酶活性抑制率為指標對優(yōu)化后的工藝條件進行驗證。結果：大孔樹脂HPD600在室溫下吸附效果最好，優(yōu)化后的工藝參數為提取液pH=8.0、提取液體積與大孔樹脂質量之比為1∶10，洗脫劑為70%乙醇溶液，洗脫體積為3BV。結論：純化前后α-葡萄糖苷酶抑制物質酶活性抑制率提高約3倍，工藝穩(wěn)定。

雪人參；大孔吸附樹脂；α-葡萄糖苷酶抑制物質

近年來，糖尿病發(fā)病率逐年增大，已成為繼腫瘤和心腦血管疾病后的第三大慢性疾病，因此側重長期治療且措施個體化，以達到控制病情、防止或減少并發(fā)癥的目的[1]。而傳統(tǒng)降糖藥物對血糖的控制并不理想[2]。臨床研究表明，α-葡萄糖苷酶抑制劑是一類新型口服降糖藥物[3]，可以緩解高胰島素血癥和防治餐后高血糖癥，還可以減少血糖波動對機體器官的損傷，提高糖耐量，具有非常廣闊的應用前景。近年開發(fā)的伏格列波糖和米格列醇等作為治療Ⅱ型糖尿病的首選藥和Ⅰ型糖尿病的輔助藥物已廣泛應用于臨床。

雪人參(RadixIndigofera)為豆科木藍屬植物茸毛木藍的根，又名鐵刷子、血人參、紅苦刺和山紅花，主要分布于云南、貴州、廣西等地，具有抗氧化[4]、補虛活血、降血糖及調經舒筋等功效，在貴州苗族地區(qū)，藥用歷史悠久。其化學成分研究表明，其富含黃酮類、萜類、酚類等化合物[5-7]。李園園等[8]報道雪人參乙醇提取物具有α-葡萄糖苷酶抑制作用，但尚未見對雪人參乙醇提取物經大孔樹脂純化后對α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究。本實驗探討了大孔樹脂分離純化雪人參中α-葡萄糖苷酶抑制物質的工藝條件，為α-葡萄糖苷酶抑制劑的制備及應用提供新思路。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Multiskan MK3酶標儀(美國Thermo Electron公司)；SP-75PC型紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)；FW-177型中草藥粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司)；BSA224S-CW型電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；TGL-16G高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；HH系列數顯恒溫水浴鍋(金壇市科析儀器有限公司)；PH-618型酸度計(上海儀電科學儀器有限公司)；96微孔酶標板，各型號微量進樣器。

1.2 材料 雪人參采集于貴州省都勻市周邊，用中草藥粉碎機粉碎，過20～60目標準篩。4-硝基苯基α-D-吡喃葡萄糖苷(4-N-trophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG，美國Sigma公司)；α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，美國Sigma公司)；阿卡波糖(Acarbose，德國Serva公司)；二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)，無水乙醇等均為分析純試劑。

2 方法

2.1 大孔樹脂的預處理 將D101、AB-8、HPD600、HPD100、X-5五種大孔樹脂用95%乙醇浸泡24h后，用95%乙醇淋洗至流出液不渾濁為止，然后用蒸餾水洗至無醇，備用。

2.2 雪人參中α-葡萄糖苷酶抑制物質的提取 稱取雪人參粉末100g，加入一定量60%乙醇溶液，回流提取3次，每次2h，合并提取液，離心，上清液減壓蒸干，用20%二甲基亞砜溶液溶解后定容到1000mL容量瓶中，備用。

2.3 大孔樹脂的篩選 分別稱取5g上述5種大孔樹脂于100mL錐形瓶中，加入80mL雪人參乙醇提取液(質量濃度為2.252mg/mL，下同)，常溫下在振蕩器上提取2h，靜止24h后，離心分離，以α-葡萄糖苷酶抑制物質酶活性抑制率(簡稱酶活性抑制率)為指標，測定上清液中α-葡萄糖苷酶抑制物質的含量。酶活性抑制率越小，表明上清液中α-葡萄糖苷酶抑制物質的含量越低，則該樹脂的吸附性能就越好[9]。

2.4 α-葡萄糖苷酶抑制物質活性測定[10]在96微孔酶標板上，加入112μL磷酸鉀緩沖液(pH=6.8)，8μL上述上清液和20μL 0.1U/mL α-葡萄糖苷酶，混合均勻后，于37℃恒溫箱中孵育30min，再加入20μL 4.0mmol/L PNPG開啟反應，置于37℃恒溫箱中反應30min，最后加入80μL 0.2mol/L Na2CO3溶液終止反應，于405nm處測其OD值，根據下式計算出上清液中酶活性抑制率(用Y表示)，A0表示空白對照組OD值(不加樣液)，Aj表示樣品組OD值，由于雪人參乙醇提取液本身就有顏色，因此需要測定其背景吸收，并對測定結果進行校正。

Y=「(Ao-Ai)/A0」×100%

2.5 靜態(tài)吸附

2.5.1 吸附時間 準確稱取5g HPD600大孔樹脂置于100mL錐形瓶中，加入80mL雪人參乙醇提取液，常溫下振蕩2h，靜態(tài)吸附不同時間，離心，測定上清液中α-葡萄糖苷酶抑制物質的含量，根據上述公式計算酶活性抑制率。

2.5.2 吸附溫度和樹脂質量 分別稱取不同質量的HPD600大孔樹脂置于100mL錐形瓶中，加入提取液80mL，在15、20、25、30、35、40、50℃下振蕩2h，靜態(tài)吸附24h，離心，測定上清液中α-葡萄糖苷酶抑制物質的含量，根據上述公式計算酶活性抑制率。

2.6 動態(tài)吸附 分別稱取5g上述5種樹脂，裝入30mm×300mm層析柱中，80mL提取液沖洗該柱，流速控制在2-3 BV/h，收集流出液，先用2BV去離子水沖洗層析柱，再用3BV 70%乙醇溶液洗脫，并收集流出液，減壓蒸干后，用20%二甲基亞砜溶解，定容至50mL，測定α-葡萄糖苷酶抑制物質的含量，根據上述公式計算酶活性抑制率。

2.6.1 提取液的pH值 稱取5g HPD600大孔樹脂7份，濕法裝柱，用5%NaOH和1mol/L HCl溶液調節(jié)提取液的pH值分別為1.0、3.5、5.0、6.0、7.0、8.0、10.0，使80mL不同pH值的提取液經過層析柱，以下按2.6步驟操作。

2.6.2 洗脫液的篩選 取5g HPD600大孔樹脂，濕法裝柱，使80mL提取液經過層析柱，吸附完全后，先用2BV去離子水沖洗，再分別用3BV 70%甲醇溶液、70%乙醇溶液和70%乙酸乙酯溶液洗脫，以下按2.6步驟操作。

2.6.3 洗脫液的體積分數 稱取5g HPD600大孔樹脂8份，濕法裝柱，各使80mL提取液經過層析柱，吸附完全后，先用2BV去離子水沖洗，再分別用3BV 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、95%乙醇溶液洗脫，以下按2.6步驟操作。

2.6.4 洗脫液的用量 取5g HPD600大孔樹脂，濕法裝柱，使80mL提取液經過層析柱，吸附完全后，先用2BV去離子水沖洗，再分別用1、2、3、4、5BV 70%乙醇溶液洗脫，以下按2.6步驟操作。

3 結果

3.1 靜態(tài)和動態(tài)吸附 5種大孔樹脂對雪人參提取液中α-葡萄糖苷酶抑制物質的吸附情況如表1所示。被5種大孔樹脂吸附后的提取液中α-葡萄糖苷酶抑制物質酶活性抑制率均有所下降，表明5種樹脂對α-葡萄糖苷酶抑制物質均有吸附。但由于樹脂的孔徑、極性和比表面積等性質的不同，吸附能力亦不相同，其中， HPD-600的酶活性抑制率最低，說明該樹脂對α-葡萄糖苷酶抑制物質吸附最多，效果最好，因此選為進一步實驗的最佳樹脂。

3.2 吸附速率 吸附速率是衡量吸附效果的重要指標。不同的吸附時間，大孔樹脂對雪人參乙醇提取液中α-葡萄糖苷酶抑制物質的吸附效果也不相同，通過對大孔樹脂HPD600吸附時間的考察后發(fā)現，前5h吸附速率較大，之后漸緩，表明該樹脂在5h內已基本吸附完全。如圖1。

3.3 溫度和樹脂質量對吸附效果的影響 25℃時，α-葡萄糖苷酶抑制物質酶活性抑制率最低，且隨著HPD600樹脂質量的增大，酶活性抑制率逐漸降低，在提取液體積(80mL)和樹脂質量(5g)之比為16∶1時基本不再變化，表明該樹脂對α-葡萄糖苷酶抑制物質的吸附達到飽和。如圖2。

表1 5種樹脂對α-葡萄糖苷酶抑制物質靜態(tài)和動態(tài)吸附測定結果

3.4 提取液pH值 當雪人參乙醇提取液的pH值為8.0時，酶活性抑制率最低，表明HPD600樹脂對提取液中α-葡萄糖苷酶抑制物質的吸附率最高，因此選擇提取液pH值為8.0作為進一步實驗的最佳酸度。詳見圖3。

3.5 洗脫條件的考察結果

3.5.1 洗脫液的確定實驗 通過對70%甲醇溶液、70%乙醇溶液和70%乙酸乙酯溶液的洗脫效果進行考察后發(fā)現，70%乙醇溶液作為洗脫液時，α-葡萄糖苷酶抑制物質酶活性抑制率最高，如表2所示，表明洗脫效果最好，故選用為進一步實驗的洗脫液。

3.5.2 洗脫液體積分數 隨著乙醇溶液體積分數的增大，洗脫液中α-葡萄糖苷酶抑制物質酶活性抑制率逐漸增大，當乙醇濃度為70%時，曲線呈平緩趨勢，考慮到經濟成本，采用70%乙醇溶液即可達到較好的解吸效果。見圖4。

表2 3種洗脫液對α-葡萄糖苷酶抑制物質洗脫效果

3.5.3 洗脫液用量 通過對1、2、3、4、5BV(1BV=25mL)洗脫液洗脫效果的考察后發(fā)現，從第3份洗脫液開始，其中的α-葡萄糖苷酶抑制物質已非常微量，表明3倍柱體積的70%乙醇溶液已能基本洗脫樹脂所吸附的α-葡萄糖苷酶抑制物質，因此確定洗脫液的體積為3BV。

3.6 工藝驗證 按照優(yōu)化后的工藝參數，將100g雪人參粉末經回流提取所得的浸膏制成提取液，使80mL該提取液通過裝有5g HPD600大孔吸附樹脂的層析柱(30mm×300mm)中進行純化，通過測定提取液純化前后α-葡萄糖苷酶抑制物質酶活性抑制率驗證純化工藝效果，通過計算，純化前雪人參乙醇提取液中α-葡萄糖苷酶抑制物質酶活性抑制率為37%，純化后為71.23%，提高約3倍。

4 結論

通過對5種大孔吸附樹脂吸附性能的考察，篩選出純化苗藥雪人參乙醇提取液中α-葡萄糖苷酶抑制物質的大孔樹脂為HPD600，并通過靜態(tài)和動態(tài)吸附對影響分離純化的主要因素進行優(yōu)化，從而確定出HPD600樹脂在室溫下吸附，吸附時用5%NaOH和1mol/L HCl溶液調節(jié)提取液的pH值為8.0，提取液體積與大孔樹脂質量之比為16∶1，采用70%乙醇溶液作為洗脫劑，洗脫體積為3倍柱體積。經過大孔樹脂純化后的提取液，對α-葡萄糖苷酶抑制物質抑制率提高了約3倍，優(yōu)化工藝穩(wěn)定可行，希望為α-葡萄糖苷酶抑制劑的制備和應用提供一定的參考。

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(編輯：梁志慶)

Separation and purification of α-Glucosidase inhibitor in Radix Indigofera by macroporous adsorption resin

WANG Xiaoguo1ZHANG Ruguo1WANG Ming2SI Gaofei3

1.Qiannan Medical College For Nationalities, Duyun 558000, China；2. The servicer of Foreign and Taiwan, Hongkong and Macao Affairs of Qiannan Prefecture, Duyun 558000, China;3. Qiannan Medical Research Association For Nationalities, Duyun 558000, China

To separate and purify the α-glucosidase inhibitor fromRadixIndigoferaby macroporous adsorption resin and establish optimum process for separating and purifying α-glucosidase inhibitor. The adsorption and desorption capacities of macroporous resins were investigated through examining the contents of the α-glucosidase inhibitor and the effects of several influencial factors on the abosorption of α-glucosidase inhibitor by macroporous resin were studied. Among 5 types of resins tested, HPD600 was shown to be the best, one for purification of α-glucosidase. The optimum ratio of herb to macroporous resin and pH value for HPD600 adsorption were 1/10 and 8.0 ethanol. After HPD600 resin purification the activity ofRadixIndigoferaα-glucosidase up to about 3 times. This research provided

for large-scale production of α-glucosidase ofRadixIndigofera.

RadixIndigofera; Macroporous Adsorption Resin; α-Glucosidase Inhibitor

2016-06-27

黔南醫(yī)?；痦椖?QNYZ201306)。

王小果(1982-)，女，碩士研究生，講師，從事天然藥物研究及相關教學工作。E-mail:450718418@qq.com

R284.2

A

1007-8517(2016)18-0017-04