蘆丁對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中tTG表達(dá)的調(diào)控作用

李曉華，劉春迎，張科強(qiáng)，呂　哲，陳　巖，倪曉鳳，高海成*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130041；2.公主嶺市范家屯第三醫(yī)院；3.吉林大學(xué)藥學(xué)院)

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蘆丁對(duì)高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中tTG表達(dá)的調(diào)控作用

李曉華1，劉春迎2，張科強(qiáng)1，呂哲3，陳巖3，倪曉鳳3，高海成3*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130041；2.公主嶺市范家屯第三醫(yī)院；3.吉林大學(xué)藥學(xué)院)

糖尿病性心肌病(DCM)在代謝紊亂及微血管病變的基礎(chǔ)上可引發(fā)心肌灶性壞死，出現(xiàn)心功能異常，導(dǎo)致心力衰竭、心律失常以及心源性休克，甚至猝死[1，2]。組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tTG)為轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶家族的成員，它是鈣離子的依賴劑[3]。據(jù)報(bào)道，tTG存在于各種組織器官中，可在各組織中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[4]。蘆丁作為黃酮類單體，已在市場(chǎng)上應(yīng)用多年，那么其是否可調(diào)控tTG的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)DCM起到防治作用。本實(shí)驗(yàn)將從細(xì)胞角度探究蘆丁對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中tTG表達(dá)的調(diào)控作用，進(jìn)而為臨床診斷和治療DCM提供寶貴的意見。

1　材料和方法

1.1大鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)

用大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)于含10%小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至90%以上時(shí)傳代。

1.2流式細(xì)胞術(shù)

細(xì)胞培養(yǎng) 48h后，消化、收集細(xì)胞，每管細(xì)胞數(shù)為3×104，冷PBS洗2次，75%冰乙醇固定，搖勻、吹打，4℃保存過夜，用于細(xì)胞周期檢測(cè)。

1.3ELISA方法

各組培養(yǎng)孔中的上清液，按tTGELISA檢測(cè)試劑盒說明嚴(yán)格操作，顯色后，在酶標(biāo)儀上、用波長(zhǎng) 405-650nm間讀取數(shù)值。

1.4實(shí)時(shí)PCR方法

Trizol法提取總RNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系20μl。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，55℃退火30s，72℃延伸30s,共30個(gè)循環(huán)。tTG: 5′-AAGGGAAGTCTTCACCAGAGCCAA-3′和 5′-CGATGTGGGCAAACACGTCAAAGT-3′。

1.5Westernblot方法

加入組織蛋白裂解液,研磨,4℃、12 000r/min離心20min，測(cè)定上清液蛋白質(zhì)濃度。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入抗tTG及β-actin抗體,4℃過夜,加入二抗,37℃孵育2h，ECL試劑顯色。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS11.5 軟件統(tǒng)計(jì)，應(yīng)用單因素方差分析(One-WayANOVA) 進(jìn)行處理，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1蘆丁對(duì)大鼠心肌細(xì)胞周期的影響

由圖1可見，正常心肌細(xì)胞數(shù)為63.3%，B3區(qū)為61.1%；高糖刺激后心肌細(xì)胞數(shù)61.7%，B3區(qū)為61.6%。給予陽性藥和羅布麻提取物蘆丁后，其細(xì)胞數(shù)分別是65.04%和63.46%，B3區(qū)為87.7%和78.4%。

圖1　蘆丁對(duì)心肌細(xì)胞周期的影響

2.2ELISA測(cè)定心肌細(xì)胞上清液中FN和Col-I的含量

高糖誘導(dǎo)后，F(xiàn)N和Col-I的蛋白表達(dá)量有所增加(P< 0.05)；而給予陽性藥和蘆丁后，F(xiàn)N和Col-I表達(dá)量降低(P< 0.05)，說明蘆丁抑制了FN和Col-I膠原蛋白的表達(dá)，見表1。

表1　細(xì)胞上清液中FN 和 Col-I的含量(ng/ml)

*P<0.05vscontrol,△P<0.05vsmodel.

2.3心肌細(xì)胞上清液中tTG的基因表達(dá)

給予高糖后，tTG的基因表達(dá)量增加，說明高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷時(shí)，tTG參與了損傷的發(fā)生過程；注射陽性藥和蘆丁后，tTG的表達(dá)量降低(P<0.05)，抑制了tTG基因表達(dá)，見圖2。

2.4Westernblot測(cè)定心肌細(xì)胞上清夜中tTG的含量

高糖誘導(dǎo)后，tTG的蛋白表達(dá)量有所增加(P<0.05)；而給予陽性藥和蘆丁后，tTG表達(dá)量降低(P< 0.05)，說明蘆丁抑制了tTG膠原蛋白的表達(dá)，見圖3。

圖2各組心肌細(xì)胞上清液中tTG基因表達(dá)

圖3各組心肌細(xì)胞上清液中tTG的蛋白表達(dá)

3　討論

糖尿病(DM)為慢性代謝性、內(nèi)分泌失調(diào)性疾病，其并發(fā)癥包括眼、腦、心、腎以及血管等[5]。1974年，DCM被Hamby等[6]提出后，便引起科研人員的廣泛重視，其特點(diǎn)為心力衰竭發(fā)生率較高。DCM的發(fā)病是由糖脂代謝紊亂、細(xì)胞因子以及生長(zhǎng)因子表達(dá)或活性增加等多種因素綜合作用的結(jié)果[7]。近年來，tTG在組織器官纖維化中的作用已備受關(guān)注。它屬于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶家族，它能催化細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(谷氨酰胺殘基與賴氨酸殘基間的轉(zhuǎn)谷氨酰胺)反應(yīng)，它可使纖維連接蛋白、膠原纖維、層粘連蛋白等發(fā)生交聯(lián)，形成穩(wěn)固結(jié)構(gòu)而抵抗基質(zhì)金屬蛋白酶的降解，是器官纖維化發(fā)生的重要因子[4]。研究證實(shí)[8]，糖尿病大鼠腎臟組織中tTG的蛋白活性及其交聯(lián)產(chǎn)物的水平均明顯增高。蘆丁作為黃酮類藥物，廣泛應(yīng)用于臨床，其含量占總黃酮的70%-90%。蘆丁的又名蕓香甙、維生素P，其具有降低毛細(xì)血管脆性，改善微循環(huán)的作用。在臨床上，其主要用于糖尿病、高血壓、高血糖等輔助治療作用。在本研究中，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，蘆丁對(duì)細(xì)胞的周期有調(diào)控作用；高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中tTG的蛋白和mRNA表達(dá)明顯增加，而蘆丁干預(yù)后其表達(dá)降低。

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[3]MunsieL,CaronN,AtwalRS,etal.Mutanthuntingtincausesdefectiveactinremodelingduringstress:defininganewrolefortransglutaminase2inneurodegenerativedisease[J].HumMolGenet,2011,20(10):1937.

[4]GaoHC,ZhuK,GaoHM,etal.Roleoftissuetransglutaminaseinthepathogenesisofdiabeticcardiomyopathyandtheinterventioneffectofrutin[J].ExpTherMed,2015,9(4):1103.

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[6]HambyRI,ZoneraichS,ShermanL.Diabeticcardiomyopathy[J].JAMA,1974,229(13):1749.

[7]簡(jiǎn)春燕,吳鏗.糖尿病性心肌病發(fā)病機(jī)制和治療的研究現(xiàn)狀[J].中華臨床醫(yī)師雜志,2012,6(1) :164.

[8]劉森炎,黃海長(zhǎng),李曉玫.組織型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶與腎臟纖維化[J].生理科學(xué)進(jìn)展,2005,36(4):314.

吉林省科技廳項(xiàng)目(3D515BR83432)；吉林大學(xué)共青團(tuán)項(xiàng)目(451160306038)

1007-4287(2016)09-1445-02

2015-08-02)