miRNA-210在尋常型銀屑病皮損中的表達(dá)研究

蔣俊青,顧安康

(天津中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院 1.皮膚科;2.病科理，天津300120)

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miRNA-210在尋常型銀屑病皮損中的表達(dá)研究

蔣俊青1,顧安康2

(天津中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院 1.皮膚科;2.病科理，天津300120)

目的探討miRNA-210在尋常型銀屑病皮損中的表達(dá)情況及影響。方法收集臨床銀屑病患者的皮損組織和健康皮膚組織，經(jīng)過(guò)速凍后提取miRNA。采用Stemp-loop技術(shù)反轉(zhuǎn)錄miRNA，采用RealtimePCR技術(shù)檢測(cè)miRNA的表達(dá)，采用絕對(duì)定量方法計(jì)算miRNA-210的拷貝濃度。免疫組化法對(duì)尋常型銀屑病皮損組織及正常皮膚組織中RUNX3蛋白的表達(dá)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，并分別記錄。結(jié)果RealtimePCR顯示miRNA-210在尋常型銀屑病患者組皮損中表達(dá)量較健康組皮膚顯著降低(P<0.01)；免疫組化結(jié)果顯示RUNX3蛋白表達(dá)陽(yáng)性率，尋常型銀屑病患者皮損中顯著高于健康組皮膚(P<0.05)。結(jié)論尋常型銀屑病患者皮損中miRNA-210顯示為低表達(dá)，其可能通過(guò)調(diào)節(jié)靶基RUNX3，參與銀屑病發(fā)病環(huán)節(jié)。

尋常型銀屑??；miRNA-210；基因表達(dá)

(Chin J Lab Diagn,2016,20:1466)

銀屑病的發(fā)病機(jī)制一直未完全闡明，近年來(lái)，表觀遺傳學(xué)在其發(fā)病機(jī)制中的研究得到重視。有研究發(fā)現(xiàn)某些特定miRNA在銀屑病的發(fā)病中起著重要作用[1]，通過(guò)檢測(cè)miRNA-210在尋常型銀屑病皮損中的表達(dá)，以期探討銀屑病的發(fā)病機(jī)制。

1　資料與方法

1.1臨床資料

所取皮損組織標(biāo)本來(lái)自本院皮膚科門診已確診的28例尋常型銀屑病患者，其中男12例，女16例，平均年齡40.5(6-75)歲。對(duì)照組皮膚組織來(lái)自整形外科手術(shù)切除的26例健康皮膚組織，其中男11例，女15例，平均年齡42.5(8-77)歲。將已取皮膚組織凍存于液氮中待用。兩組實(shí)驗(yàn)者除銀屑病之外的其他自身?xiàng)l件差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2儀器與試劑

總RNA抽提試劑Trizol由西安融智生物技術(shù)有限公司提供、miRNA-210特異性引物由百奧邁科生物技術(shù)有限公司提供、蛋白質(zhì)抽提試劑盒由上海名勁生物科技有限公司提供、miScriptSYBRGreenPCRkit等試劑及儀器由南京奧多福尼生物科技有限公司提供。

1.3方法

1.3.1檢測(cè)miRNA-210的表達(dá)將凍存組織碾碎，應(yīng)用相關(guān)試劑提取總RNA后，然后應(yīng)用上述反轉(zhuǎn)錄試劑盒將剛提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，詳細(xì)步驟按照儀器及試劑說(shuō)明進(jìn)行操作。用Real-timePCR檢測(cè)并對(duì)比28例尋常型銀屑病患者和26例健康對(duì)照的miRNA-210表達(dá)水平。

1.3.2檢測(cè)RUNX3蛋白表達(dá)采用免疫組化EnVision法檢測(cè)尋常型銀屑病皮損組織和健康組織中RUNX3的表達(dá)。對(duì)兩組組織病理切片進(jìn)行顯微鏡觀察分析，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分級(jí)評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考病理指標(biāo)。計(jì)算切片著色程度及著色陽(yáng)性細(xì)胞所占比例得分，并將兩者乘積作為最后的得分，得分≧4分者為陽(yáng)性，計(jì)算陽(yáng)性率并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2　結(jié)果

2.1miRNA-210的表達(dá)水平

Real-timePCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示尋常型銀屑病患者皮損與正常組織相比，miRNA-210的表達(dá)顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1　皮損與正常皮膚組織miRNA-210表達(dá)情況

2.2RUNX3蛋白表達(dá)水平

免疫組化結(jié)果顯示：尋常型銀屑病患者皮膚組織RUNX3蛋白表達(dá)水平明顯高于正常皮膚組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值=24.36，P<0.05)，見表2。

表2　皮損與正常皮膚組織RUNX蛋白3表達(dá)情況

3　討論

銀屑病的發(fā)病機(jī)制，目前多認(rèn)為是多種因素相互影響作用導(dǎo)致的，包括感染、代謝、遺傳、免疫和環(huán)境因素[1]。表觀遺傳學(xué)在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，其中包括非編碼小RNA(如miRNA)的調(diào)控等[2]。miRNAs是人體種類最多的調(diào)節(jié)基因，占人類基因組的1%-5%，控制約30%的蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)，目前為止，發(fā)現(xiàn)的miRNA種類就有上千種。miRNA主要是通過(guò)與mRNA的3`端非編碼區(qū)結(jié)合進(jìn)而抑制翻譯或引發(fā)mRNA降解，阻遏基因轉(zhuǎn)錄后的翻譯過(guò)程，對(duì)細(xì)胞代謝等多個(gè)環(huán)節(jié)產(chǎn)生影響。有研究表明miRNAs在銀屑病的發(fā)展中起著重要的調(diào)節(jié)作用[3]，miRNA-203是銀屑病中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的miRNA，研究證實(shí)其表達(dá)具有組織特異性，在皮膚中的表達(dá)明顯高于其他組織器官，而在在銀屑病患者皮損處表達(dá)又顯著高于正常皮膚。miRNA-203靶基因?yàn)榧?xì)胞因子通路抑制因子3(suppressorofcytokinesignaling3,SOCS-3)[4]，SOCS-3對(duì)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖分化有重要調(diào)節(jié)作用，SOCS-3是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(singaltransduserandactivatoroftranscription,STAT3)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，可抑制STAT3的活化，而STAT3信號(hào)通路激活是導(dǎo)致銀屑病皮損發(fā)生的重要機(jī)制之一，而miRNA-203表達(dá)上調(diào)使得STAT3信號(hào)通路持久性激活，引起皮膚銀屑樣變，但miRNA在銀屑病皮損高表達(dá)的機(jī)制以及如何調(diào)控靶基因表達(dá)的機(jī)制仍待進(jìn)一步的研究。有研究[5]通過(guò)基因芯片技術(shù)篩選出一些銀屑病相關(guān)差異性表達(dá)的miRNA，如miRNA-21、miRNA-203a、miRNA-146a、miRNA-125b等，這些miRNA已被證實(shí)在銀屑病皮損組織中表達(dá)，參與調(diào)控銀屑病基因調(diào)控，進(jìn)而增加皮損的炎癥反應(yīng)和角質(zhì)形成細(xì)胞的增生。

我們通過(guò)real-timePCR技術(shù)，證實(shí)了miRNA-210在尋常型銀屑病患者皮損中相對(duì)于健康皮膚組織顯著表達(dá)下調(diào)。對(duì)miRNA-210靶基因查找發(fā)現(xiàn)，RUNX3可能是其潛在靶基因?，F(xiàn)已在銀屑病發(fā)病的免疫分子學(xué)中發(fā)現(xiàn)Th1細(xì)胞異?；罨纱龠M(jìn)炎性因子的釋放和炎癥放大，使得炎癥反應(yīng)持續(xù)發(fā)生和角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖分化，最終導(dǎo)致銀屑病的皮損出現(xiàn)。有研究[6]發(fā)現(xiàn)由Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-2、INF-γ均高表達(dá)于銀屑病患者血清及皮損，而WongWF等[7]發(fā)現(xiàn)RUNX3可促使CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，并將促進(jìn)上述細(xì)胞因子分泌。綜上，RUNX3參與銀屑病皮損的發(fā)生，并在其中起到一定的作用。另外，我們比較了尋常型銀屑病患者皮損組織中的RUNX3蛋白表達(dá)陽(yáng)性率，結(jié)果顯著高于健康皮損組，且發(fā)現(xiàn)miRNA-210的表達(dá)水平和RUNX3蛋白水平呈負(fù)相關(guān)，證實(shí)miRNA-210 可以作用于RUNX3基因，通過(guò)對(duì)基因的調(diào)節(jié)在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制RUNX3的蛋白表達(dá)，而具體的調(diào)節(jié)機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。

[1]陳春麗,劉新梅,普雄明，等.微RNA在銀屑病中差異表達(dá)的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2016,(3):443.

[2]KooistraSM,HelinK.Molecularmechanismsandpotentialfunctionsofhistonedemethylases[J].NatRevMolCellBiol,2012,13(5):297.

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[6]HeJ,WuJ,XuN,etal.MiR-210disturbsmitoticprogressionthroughregulatingagroupofmitosis-relatedgenes[J].NucleicAcidsRes,2013,41(1):498.

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StudyontheexpressionofmiRNA-210intheskinlesionsofpsoriasisvulgaris

JIANG Jun-qing,GU An-kang.

(Department of Dermatology,the Affiliated Hospital of Tianjin Traditional Chinese Medicine Research Institute,Tianjin 300120,China)

ObjectiveToexploretheexpressionofmiRNA-210inthelesionsofpsoriasisandtheinfluenceofthedisease.MethodsTheskintissueofclinicalpatientswithpsoriasisandthehealthywerecollected.ThemiRNAwasextractedbyusafterquick-frozen.TheStemp-looptechnologywasusedtoreversetranscriptionofmiRNAandRealtimePCRtevhniquewasappliedtoidentitytheexpressionofmiRNA.ThestandardcurveshouldbemadeandthemiRNA-210copiesofconcentrationbecalculatedbyabsolutequantitativemethod.Thet-testwasusedtocomparethedifferencebetweenpsoriaticskinlesionstissuesandthenormalskintissues,andAp-valuelessthan0.05wasconsideredstatisticallysignificant.TheexpressionofRUNX3inthetwotissuegroupsweredeterminedwithimmunohistochemicalmethod.ResultsRealtimePCRshowedthattheexpressionofmiRNAinpatientswithpsoriasisvulgarisgroupsdecreasedsignificantlycomparedwiththenormalgroups(P<0.05).TheresultsofimmunohistochemistrydemonstratedthattheexpressionofRUNX3proteininskinlesionsofpatientswithpsoriasisvulgarisweresignificantlyhigherthanthatnormalskin(P<0.05).ConclusionLowerexpressionofmiRNA-210wasdetectedinthelesionsofpatientswithpsoriasisvulgaris.ThemiRNA-210mayeffectonitstargetgenesRUNX3andthenplayaroleintheonsetofpsoriasis.

psoriasisvulgaris;microRNA-210;geneexpression

1007-4287(2016)09-1466-03

R758.63

A

2015-09-08)