人臍帶血內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定

趙夢蝶，查從亮，江　浩，項(xiàng)　平

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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

人臍帶血內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定

趙夢蝶1，查從亮1，江浩1，項(xiàng)平2

目的：分離、培養(yǎng)、鑒定人臍帶血內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)，為獲取大量血管內(nèi)皮祖細(xì)胞提供方法。方法：臍帶血采集后，采用6%羥乙基淀粉沉降法和密度梯度離心法獲取臍帶血單核細(xì)胞，再將單核細(xì)胞接種于鋪設(shè)有纖維連接蛋白的培養(yǎng)瓶中，經(jīng)過體外誘導(dǎo)、培養(yǎng)、分化，完成傳代擴(kuò)增；通過免疫組織化學(xué)、免疫熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果：細(xì)胞培養(yǎng)第5天呈現(xiàn)集落樣生長，單個細(xì)胞呈圓形或梭形，2周后細(xì)胞長滿瓶底,呈鵝卵石樣外觀。免疫組織化學(xué)檢測顯示，CD31兔抗人單克隆抗體陽性率91.5%，Anti-Von Willebrand factor antibody(vWF)相關(guān)抗原兔抗人單克隆抗體的陽性表達(dá)率為72.4%；細(xì)胞免疫熒光染色檢測顯示，吞噬Dil標(biāo)記的乙酰低密度脂蛋白(+)，發(fā)出紅色熒光；結(jié)合FITC標(biāo)記的荊豆凝集素Ⅰ (+)，發(fā)出綠色熒光；雙染(+)，呈黃色熒光。流式細(xì)胞術(shù)檢測CD34陽性率93%，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2陽性率88.5%，CD133陽性率84.8%。結(jié)論：從臍帶血中可獲取大量CD34+、VEGFR-2+及CD133+血管內(nèi)皮祖細(xì)胞。

干細(xì)胞;內(nèi)皮祖細(xì)胞;人臍帶血

早在1997年，ASAHARA等[1]首次從人外周血中分離出一種表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原的單核細(xì)胞，其血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2(VEGFR-2)及CD34都顯示為陽性，顯微鏡下呈梭形生長，而且其結(jié)構(gòu)成管腔樣，將其定名為內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)。EPCs作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，具有游走性，并可逐步定向增殖分化為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞[2]，在缺血組織的血管新生、損傷的血管再內(nèi)皮化、作為再生醫(yī)學(xué)工具及作為腫瘤治療的靶點(diǎn)等方面發(fā)揮重要作用。但EPCs的定義、鑒別及特征仍存在爭議[3-10]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用6%羥乙基沉淀法從臍帶血中分離培養(yǎng)EPCs并鑒別，現(xiàn)作報(bào)道。

1　材料與方法

1.1材料實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：經(jīng)我校醫(yī)學(xué)倫理委員會認(rèn)證通過，并經(jīng)患兒家屬悉知實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮笸猓∥以鹤阍陆】灯蕦m產(chǎn)新生兒臍帶血。主要試劑與儀器:淋巴細(xì)胞分離液(天津TBD公司);胎牛血清(杭州四季青公司);胰酶消化液(江蘇碧云天公司);EGM-2 培養(yǎng)基(Lonza,美國);人纖維連接蛋白(美國 Sigma公司);2%多聚甲醛(美國Sigma公司);肝素(上海伯奧生物科技有限公司) ；6%羥乙基淀粉(天津TBD公司);Dil標(biāo)記的乙酰低密度脂蛋白(美國MolecularProbe公司) ;FITC標(biāo)記的荊豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-Ⅰ)(美國Sigma公司);anti-humanCD133/PE(eBioscience,美國);anti-humanCD34-FITC(eBioscience,美國);antiKDR/APC(eBioscience,美國)。

1.2方法

1.2.1人臍帶血的征求采集及內(nèi)皮祖細(xì)胞的提取[11-12]首先,配置抗凝血用肝素(用0.9%氯化鈉注射液將其稀釋為濃度50 U/mL)4 mL注入無菌采血瓶中，無菌條件下抽取剝離胎盤的臍靜脈血60～80 mL于該瓶，搖晃使二者混勻抗凝后，當(dāng)即置于4 ℃冰盒中轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞培養(yǎng)室。臍帶血中加入6%羥乙基淀粉(6%羥乙基淀粉∶臍血=1∶4)，于23 ℃靜置40 min后，出現(xiàn)富含白細(xì)胞的上層血漿，收集8 mL上層清液，并用藍(lán)色槍頭貼管壁緩慢加入于15 mL離心管內(nèi)(離心管事先加入4 mL淋巴細(xì)胞分離液)，2 000 r/min去閘離心20 min，離心后可見液體分為4層，吸取呈白色絮狀物的第二層白膜層,即為所要的單核細(xì)胞層。

1.2.2細(xì)胞的培養(yǎng)提前1 d用人纖維連接蛋白包被6孔板，將所取的單核細(xì)胞加入6孔板，約接種5×105個單個核細(xì)胞，在每孔加入EGM-2 培養(yǎng)基2 mL，并放置于37 ℃、5%CO2、濕度≥95%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后觀察貼壁細(xì)胞生長狀況，半量換液。此后每隔1 d觀察1次，并進(jìn)行全量換液。10 d后細(xì)胞長滿6孔板，按1∶2完成傳代。

1.2.3繪制生長增殖曲線取生長增殖良好呈鋪路石狀密度排列的EPCs，用胰酶消化，在新鮮培養(yǎng)基中吹打成細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果按6孔板每個小孔5×104/mL作傳代培養(yǎng)接種細(xì)胞，共接種細(xì)胞36孔。首次計(jì)數(shù)于24 h后，其余各次每隔24 h 1次，每次取3孔細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)。計(jì)算平均值。連續(xù)計(jì)數(shù)12 d。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)所得具體結(jié)果，繪制生長發(fā)展曲線。

1.2.4細(xì)胞免疫化學(xué)染色法在單個核細(xì)胞制成細(xì)胞爬片后，使用Anti-Von Willebrand factor antibody(vWF)相關(guān)抗原兔抗人單克隆抗體和CD31兔抗人單克隆抗體進(jìn)行免疫化學(xué)染色，經(jīng)梯度乙醇脫水和中性樹膠封固后，光學(xué)顯微鏡下觀察貼壁細(xì)胞vWF和CD31陽性率。

1.2.5雙熒光染色鑒定取培養(yǎng)13～14 d的EPCs,用PBS清洗2次,將配置好含Dil標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL) 10 μg/mL的EGM-2培養(yǎng)液加入培養(yǎng)板中,置于37 ℃的培養(yǎng)箱15 min孵育細(xì)胞,再用PBS清洗3次,每次3 min,常溫下用4%多聚甲醛固定10 min,PBS清洗3次,每次3 min。再將配置好含F(xiàn)ITC-UEA-Ⅰ 10 μg/mL的PBS液加入培養(yǎng)板中，置于37 ℃的培養(yǎng)箱15 min孵育細(xì)胞,再用PBS清洗3次,在激光共聚焦顯微鏡觀察。選取4個隨機(jī)視野,觀察熒光表達(dá)，陽性細(xì)胞為雙熒光均表達(dá),取陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)的平均數(shù)。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)取培養(yǎng)10 d的新分離的人臍帶血單個核細(xì)胞，分別加入FITC標(biāo)記的抗大鼠CD133，PE標(biāo)記的抗大鼠CD34各2 μL，送流式中心流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

2　結(jié)果

2.1EPCs形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞呈梭形生長(見圖1)。

2.2EPCs生長曲線記數(shù)法測定細(xì)胞生長曲線結(jié)果顯示，第1～4天為細(xì)胞生長潛伏期，對數(shù)生長期一般為培養(yǎng)第5～9天，生長平臺期一般為培養(yǎng)后第10～12天，表明體外培養(yǎng)的人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖迅速，生物學(xué)性能穩(wěn)定(見圖2)。

2.3細(xì)胞免疫化學(xué)染色法結(jié)果細(xì)胞呈棕褐色呈陽性表達(dá)，CD31在EPCs的陽性表達(dá)率(88.95±6.23)%，vWF為(74.01±8.42)%(見圖3)。

2.4雙熒光染色鑒定結(jié)果已分化的EPCs可吞噬FITC-UEA-Ⅰ和DiI-acLDL，并在激光共聚焦顯微鏡下呈現(xiàn)不同熒光。當(dāng)其吞噬了FITC-UEA-Ⅰ后，可見綠色熒光；當(dāng)其吞噬了DiI-acLDL后，可見紅色熒光。正在分化的EPCs既可吞噬FITC-UEA-Ⅰ，又可吞噬DiI-acLDL，則在激光共聚焦顯微鏡下呈黃色熒光(見圖4) 。

2.5流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果新分離的人臍帶血單個核細(xì)胞中，CD34+細(xì)胞占2.5%，CD133+細(xì)胞占4.2%， CD34+/CD133+細(xì)胞占2.1%(見圖5)。

3　討論

由于EPCs在血管新生中具有重要地位[13]，近年來快速成為血管研究熱點(diǎn)。目前，EPCs的主要來源為臍帶血和骨髓。臍帶血取材方便，來源豐富，富含EPCs，可分離純化出大量EPCs并使其能在體外環(huán)境下穩(wěn)定生長，旺盛增殖以滿足各類實(shí)驗(yàn)需要。

本實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)擴(kuò)增的人臍血單個核細(xì)胞，相繼出現(xiàn)貼壁、變形、形成集落、形成梭形細(xì)胞、形成線狀結(jié)構(gòu)、形成鋪路石樣排列，符合ASAHARA等[1]的研究報(bào)道。細(xì)胞生長發(fā)展曲線繪制，在培養(yǎng)第1～4天細(xì)胞增殖緩慢，為相對抑制期，第5～10天細(xì)胞快速增殖，逐漸到達(dá)平臺期。

確切描述EPCs及其前體存在一定困難，因?yàn)楝F(xiàn)在并不知道這類細(xì)胞的大多數(shù)分子和表型決定簇。實(shí)際上，造血細(xì)胞、成熟內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞的表面蛋白之間存在非常大的重疊[14]。尤其是來源于血管壁的成熟的內(nèi)皮細(xì)胞以及有成血管細(xì)胞潛能的內(nèi)皮祖細(xì)胞，二者的內(nèi)皮特異性標(biāo)志物可能表達(dá)相似，分別是血管內(nèi)皮鈣黏蛋白、酪氨酸激酶受體1、酪氨酸激酶受體2、CD34和血管內(nèi)皮生長因子受體2[15-16]。

現(xiàn)有一系列不同的方法用于測定早期及晚期EPCs集落，其標(biāo)志物包含CD34+、CD133+、血管內(nèi)皮生長因子受體2+、CD34+/血管內(nèi)皮生長因子受體2+，CD34+/CD117+/血管內(nèi)皮生長因子受體2+、CD34+/CD133+/血管內(nèi)皮生長因子受體2+等[17]。因此，有一些矛盾存在于內(nèi)皮祖細(xì)胞的研究中。目前，內(nèi)皮祖細(xì)胞表面標(biāo)志物中，較為公認(rèn)的為血管內(nèi)皮生長因子受體2、CD34[18]及CD133[19]。有研究認(rèn)為CD133、CD34二者同時陽性更重要[20]。也有的研究認(rèn)為CD133比CD34更有意義，原因在于CD133不表達(dá)成熟內(nèi)皮細(xì)胞，其在分化過程中下調(diào)迅速。因此,CD133可用于排除成熟內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志[21]。然而，有學(xué)者[22]從CD34-的單核細(xì)胞中，也能通過誘導(dǎo)培養(yǎng)也能獲得內(nèi)皮祖細(xì)胞，因此內(nèi)皮祖細(xì)胞的表面標(biāo)志物具有不確定性。近年，一種特殊類型的T細(xì)胞被HUR等[23]首次報(bào)道，稱其組成了EPs集落的中心，該T細(xì)胞趨化因子受體4+、CD3+、CD31+。

研究[24]表明，EPCs是由Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?凝集素雙陽性細(xì)胞定義的，可采用其雙陽性來鑒定細(xì)胞。在細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增的第7天，使用此方法鑒定，證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞大多數(shù)為EPCs。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功從人臍血中分離出EPCs并在體外進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，培養(yǎng)過程中分別測定其表面標(biāo)記鑒定。因此，體外培養(yǎng)及鑒定EPCs可為將來治療缺血性疾病的研究提供方法，體外擴(kuò)增EPCs可為將來提供移植細(xì)胞的來源。EPCs滿足組織工程的需求，是種子細(xì)胞的理想細(xì)胞之一[25]。

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(本文編輯劉夢楠)

Study on the separation,culturation and identification of human umbilical cord blood progenitor cells

ZHAO Meng-die1,ZHA Cong-liang1,JIANG Hao1，XIANG Ping2

(1.DepartmentofRadiotherapy,2.CentralLaboratory,TheFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,BengbuAnhui233004,China)

Objective:To study on the separation,culturation and identification of human umbilical cord blood progenitor cells from human cord blood progenitor cells (EPCs),and provide a method to obtain a large number of endothelial progenitor cells.Methods:After cord blood were collected,with methods of 6% hydroxyethyl starch sedimentation and density gradient centrifugation,we obtained cord blood mononuclear cells.And then the cells were seeded in culture flasks laid fibronectin.After the cells were induction culturation,and differentiationinvitro,passage and amplification of the cells were completed;the cells were identified by immunohistochemistry,immunofluorescence,flow cytometry.Results:The cell culture showed colony-like growth at the first five days,and each single cell showed round or spindle-shaped.Two weeks later,the cellscovered the bottom of culture dish,and showed cobblestone-like appearance.Immunohistochemistry got 91.5% positive rate of CD31,72.4% positive rate of vWF;immunofluorescence staining told us that the cell emited red fluorescence,and phagocytose DiI-acLDL(+);but when the cells dyed with FITC marked by UEA-Ⅰ(+) they emited green fluorescence,and when the cells were double stained,they emited the yellow fluorescence.Flow cytometry analysis showed that the rate of CD34-positive cells was 93%,VEGFR-2 positive cells was 88.5%,and CD133 positive cells was 84.8%.Conclusions:CD34+、VEGFR-2+and CD133+endothelial progenitor cells can be largly obtained from the umbilical cord blood.

stem cells;progenitor cells;human umbilical cord blood

2015-12-16

安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1308085MH164)；蚌埠醫(yī)學(xué)院科研創(chuàng)新計(jì)劃(Byycx1544)

單位] 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1.腫瘤放療科，2.中心實(shí)驗(yàn)室，233004

[作者簡介] 趙夢蝶(1990-)，女，碩士研究生.

項(xiàng)平，碩士研究生導(dǎo)師，教授.E-mail：byxiangping@163.com

1000-2200(2016)09-1121-04

R 329.28

ADOI:10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.09.001