基于“脾主肌肉”理論探討Sirt1/Foxa1 通路介導(dǎo)澤明紅山顆粒治療非酒精性脂肪性肝炎的機(jī)制

任柏樾 姚輝 盧秉久 （遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院,遼寧 沈陽(yáng) 003; 附屬醫(yī)院傳染科）

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是一種受多因素影響的代謝應(yīng)激性肝病。在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中屬“痞滿”“鼓脹”等范疇，飲食不結(jié)，過食肥甘厚膩，脾失健運(yùn)，痰濕蘊(yùn)結(jié)，內(nèi)生熱毒，互結(jié)于肝，以致肝失疏泄、木郁壅土，為本病的主要病機(jī)，疏肝健脾，清熱化濕，祛痰化瘀，滋補(bǔ)肝腎為本病的基本治則〔1〕。目前尚無(wú)有關(guān)NASH 特異性藥物，仍以預(yù)防危險(xiǎn)因素為主，中醫(yī)藥在治療NASH 方面比較廣泛，主要體現(xiàn)在疏肝調(diào)脂，健脾祛濕，抑制氧化應(yīng)激及肝臟纖維化等多個(gè)方面，盧秉久教授行醫(yī)三十余年，善用自擬的澤明紅山茶（澤瀉20 g、山楂20 g、決明子20 g、紅曲6 g、陳皮10 g、蒼術(shù)15 g）治療脂肪代謝紊亂性疾病〔2〕。本研究在澤明紅山茶上予以加減，創(chuàng)新藥物炮制方法，自擬澤明紅山顆粒用于NASH 臨床治療，效果顯著，但其作用機(jī)制尚不明確。

目前“二次打擊”被認(rèn)為是NASH 的經(jīng)典作用機(jī)制，所謂“初次打擊”是指NASH 初期肝功能異常導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂及胰島素抵抗，機(jī)體糖原及脂肪酸異常蓄積，誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂質(zhì)變性。隨后的“二次打擊”即肝細(xì)胞的毒性作用，肝細(xì)胞經(jīng)歷初次打擊后，對(duì)氧化應(yīng)激、炎性介質(zhì)、線粒體障礙等敏感性增強(qiáng)，進(jìn)一步誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷〔3，4〕?！督饏T要略》云:“見肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾”，明確提出肝主疏泄功能與脾主運(yùn)化之間互相作用機(jī)制，這與NASH“二次打擊”學(xué)說中胰島素抵抗與線粒體之間作用機(jī)制相對(duì)應(yīng)〔3，5〕。本研究提出假說澤明紅山顆粒對(duì)NASH 的作用機(jī)制可能是通過調(diào)控胰島素-線粒體功能來實(shí)現(xiàn)的。

轉(zhuǎn)錄沉默信息調(diào)節(jié)因子（Sirt）1 是NAD+依賴的組蛋白脫乙酰酶，是細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)因子之一，Sirt1可以通過調(diào)節(jié)線粒體的生物發(fā)生、葡萄糖和脂質(zhì)的穩(wěn)態(tài)來控制代謝〔6～8〕。是Foxo1 轉(zhuǎn)錄功能的重要調(diào)節(jié)子，Sirt1 可通過去乙酸化作用調(diào)節(jié)Foxo1，促進(jìn)其表達(dá)，而Foxo1 能夠通過降低氧自由基抑制骨骼肌損傷〔9，10〕。因此，Sirt1 去乙酸化介導(dǎo)的Foxo1 活性改變可能是一種通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝來對(duì)抗NASH 的新機(jī)制或藥物靶點(diǎn)。本研究旨在基于脾主肌肉理論探討Sirt1/Foxa1 通路介導(dǎo)澤明紅山顆粒治療NASH的調(diào)控機(jī)制，為臨床防治NASH 提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠40只，體重20～25 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物科技股份有限公司〔生產(chǎn)許可證SCXK（遼）2018-0001〕，飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)（使用許可證SYXK 遼2013-0009），自由取食水。隨機(jī)分為對(duì)照組（control 組，n=10）、NASH 模型組（NASH 組，n=10）、NASH 模型+澤明紅山顆粒組（ZMHS 組，n=10）及多烯磷脂酰膽堿膠囊（易善復(fù)，購(gòu)自賽諾菲制藥有限公司，批號(hào)H20059010）西藥對(duì)照組（PPC 組，n=10）。

1.2 NASH 模型制備 采用高脂純化飼養(yǎng)（MD45%添加0.5%膽固醇）法建立NASH 小鼠模型，control 組給予普通飼料，造模組予以高脂純化飼料，二者均購(gòu)于江蘇美迪森公司。第4 周末開始，每周末于模型組中隨機(jī)抽取1 只小鼠，過量麻醉處死，打開腹腔，暴露肝臟，無(wú)菌條件下取肝臟做蘇木素-伊紅（HE）染色切片，直至第8 周末，隨機(jī)挑選3 只小鼠，行肝組織HE 染色，評(píng)價(jià)造模情況。ZMHS 組于模型成功后予以澤明紅山顆粒（由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供）灌胃治療，PPC 組予以易善復(fù)治療，余組予以等量生理鹽水，連續(xù)干預(yù)4 w。PPC 組小鼠給藥劑量根據(jù)臨床成人單日用量最高劑量1.37 g/70 kg，按人與動(dòng)物體質(zhì)量系數(shù)進(jìn)行換算后得到為0.18 g/kg；ZMHS 組給藥劑量根據(jù)成人臨床用量按人與動(dòng)物體質(zhì)量系數(shù)進(jìn)行換算后得到（6.25 g/kg）。

1.3 樣品采集 各組于取材前12 h 禁食水，末次給藥后腹腔注射3.5%水合氯醛10 ml/kg 進(jìn)行麻醉，于腹主動(dòng)脈收集血液，3 500 r/min、5 min 分離血清，部分于全自動(dòng)生化儀檢測(cè)，部分置于液氮中，剝離后腿腓腸肌組織及肝臟，部分置于多聚甲醛中固定，另一部分置于-80℃冰箱保存。

1.4 谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL）水平檢測(cè) 利用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組小鼠血清中ALT、AST、TC、TG、HDL、LDL 水平。

1.5 HE 染色 取出固定后組織，PBS 沖洗殘留液體，經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，侵蠟包埋，組織切片機(jī)切片，厚度4～6 μm，水中燙平，貼片，烤片后，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，于蘇木素染色5 min，1%鹽酸酒精分色5 s，氨水沖洗反藍(lán)1 min，蒸餾水沖洗30 s，經(jīng)伊紅染液30 s，PBS 沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明處理，中性樹膠封片，光鏡下觀察組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè) ELISA 試劑盒購(gòu)自武漢優(yōu)爾生生物科技有限公司，室溫下平衡試劑盒，取出酶標(biāo)板，依次加入50 μl 標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)置對(duì)照組及樣品組，分別加入50 μl 樣品及蒸餾水，加入100 μl 酶標(biāo)記溶液，37℃孵育1 h，充分洗板，各孔加入顯色劑A，B 液各50 μl，避光孵育15 min，加入50 μl 終止液，波長(zhǎng)450 nm 的酶標(biāo)儀上讀取各孔的吸光度（OD）值，OD 值為縱坐標(biāo)（Y 軸），標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)（X 軸），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。根據(jù)樣品的OD 值查找對(duì)應(yīng)的濃度范圍。

1.7 腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）酶染色 新鮮肌肉組織冷凍切片，pH10.4 的工作液孵育5 min，傾去孵育液，pH9.4 的工作液孵育30 min，傾去孵育液，CaCl2 溶液處理3 次，每次2 min。硝酸鈷5 min，PBS 沖洗5 min。1% 硫化銨溶液30 s，PBS 沖洗5 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.8 免疫熒光 切片經(jīng)脫蠟，水化后，固定10 min，PBS 沖洗3×3 min，加入血清封閉30 min，PBS 沖洗3×3 min，加入一抗，4℃孵育過夜，PBS 沖洗5×5 min，加入二抗，孵育2 h，DAPI 復(fù)染，封片，鏡下觀察。

1.9 Western 印跡 將組織剪碎，加入蛋白酶抑制劑的RIPA（Thermo，89900），勻漿，4℃下12 000 r/min離心5 min，分離上清液，BCA（Thermo，23225）蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白液濃度測(cè)定，十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）后進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜，加入Sirt1（ab156585）、Foxa1（ab218201）抗體；4℃孵育過夜，PBS 清洗聚偏氟乙烯（PVDF）膜后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下孵育2 h后，使用電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒和凝膠成像系統(tǒng)對(duì)蛋白進(jìn)行顯色，結(jié)果使用Image J 進(jìn)行分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS21.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血清中ALT、AST、TC、TG、HDL、LDL水平 與control 組相比，NASH 組血清中ALT、AST、TC、TG、LDL 表達(dá)明顯升高，HDL 表達(dá)明顯降低（P＜0.05），與NASH 組比較，ZMHS 組及PPC 組小鼠ALT、AST、TC、TG、LDL 表達(dá)明顯下降，HDL 表達(dá)明顯升高（P＜0.05），與PPC 組比較，ZMHS 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組ALT、AST、TC、TG、HDL、LDL 水平表達(dá)(,n=10)

表1 各組ALT、AST、TC、TG、HDL、LDL 水平表達(dá)(,n=10)

與control 組比較:1）P＜0.05；與NASH 組比較:2）P＜0.05；下表同

2.2 HE 染色觀察肝臟病理形態(tài) 如圖1 所示，control 組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，中央靜脈壁薄，肝細(xì)胞呈索條狀，呈放射轉(zhuǎn)排列，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，胞質(zhì)均勻，核質(zhì)比例正常。NASH 組小鼠肝組織可見肝小葉結(jié)構(gòu)尚正常，可見重度肝細(xì)胞脂肪變性，以彌漫性大泡脂肪變?yōu)橹?；肝?xì)胞體積增大，胞質(zhì)疏松，邊界欠清，呈氣球樣變；可見程度不等的點(diǎn)狀或灶性細(xì)胞壞死，肝實(shí)質(zhì)及匯管區(qū)單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。ZMHS 組及PPC 組可見肝細(xì)胞組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)，與模型組比較明顯改善。

圖1 HE 染色觀察各組肝臟損傷(×200)

2.3 各組小鼠骨骼肌中ATP、磷酸肌酸激酶（CPK）、α-羥丁酸脫氫酶（HBD）、ALT、乳酸脫氫酶（LDH）水平 與control 組比較，NASH 組肌肉中CPK、α-HBD、ALT、LDH 表達(dá)明顯升高，ATP 表達(dá)明顯降低（P＜0.05），與NASH 組比較，ZMHS 組及PPC 組CPK、α-HBD、ALT、LDH 表達(dá)明顯下降，ATP表達(dá)明顯升高（P＜0.05），與PPC 組比較，ZMHS 組ATP、CPK、α-HBD、ALT、LDH 表達(dá)變化無(wú)明顯差異（P＞0.05）。見表2。

表2 各組ATP、CPK、-HBD、ALT、LDH、Sirt1、Foxa1 蛋白表達(dá)(,n=10)

表2 各組ATP、CPK、-HBD、ALT、LDH、Sirt1、Foxa1 蛋白表達(dá)(,n=10)

2.4 ATP 酶染色觀察骨骼肌損傷情況 Ⅰ型肌纖維為淺色，Ⅱ型肌纖維為深色。control 組可見骨骼肌纖維大小均勻，形態(tài)規(guī)則，排列成馬賽克狀，NASH組Ⅱ型纖維染色加深，骨骼肌纖維增粗，出現(xiàn)明顯損傷，PPC 組骨骼肌纖維大小明顯恢復(fù)，形態(tài)較為規(guī)則，ZMHS 組可見Ⅰ型肌纖維及Ⅱ型肌纖維分布均勻，形態(tài)規(guī)則，肌纖維損傷基本恢復(fù)。見圖2。

圖2 ATP 酶染色觀察各組消失骨骼肌損傷(×200)

2.5 免疫熒光觀察過氧化物酶體增殖物活化受體激活因子（PGC-1）、過氧化物酶體增殖激活受體γ（PPARα）、核呼吸因子（NRF）-1、線粒體轉(zhuǎn)錄因子（mtTF）A 表達(dá) 與control 組比較，NASH 組血清中PGC-1、PPARα、NRF-1、mtTFA 表達(dá)明顯降低（P＜0.05），與NASH 組比較，ZMHS 組及PPC 組PGC-1、PPARα、NRF-1、mtTFA 表達(dá)明顯升高（P＜0.05），與PPC 組比較，ZMHS 組PGC-1、PPARα、NRF-1、mtTFA表達(dá)變化無(wú)明顯差異（P＞0.05）。見圖3～6、表3。

圖3 免疫熒光觀察各組PGC-1 表達(dá)(×200)

圖4 免疫熒光觀察各組PPARα 表達(dá)(×200)

圖5 免疫熒光觀察各組NRF-1 表達(dá)(×200)

圖6 免疫熒光觀察各組mtTFA 表達(dá)(×200)

2.6 Western 印跡檢測(cè)Sirt1、Foxa1 蛋白表達(dá) 與control 組比較，NASH 組血清中Foxa1 蛋白表達(dá)明顯升高，Sirt1 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），與NASH 組比較，ZMHS 組及PPC 組Foxa1 蛋白表達(dá)明顯降低，Sirt1 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05），與PPC組比較，ZMHS 組Sirt1、Foxa1 蛋白表達(dá)變化無(wú)明顯差異（P＞0.05）。見表3、圖7。

表3 各組PGC-1、PPARα、NRF-1、mtTFA 蛋白陽(yáng)性表達(dá)(,n=10)

表3 各組PGC-1、PPARα、NRF-1、mtTFA 蛋白陽(yáng)性表達(dá)(,n=10)

圖7 Western 印跡檢測(cè)Sirt1、Foxa1 蛋白表達(dá)

3 討論

目前已知脂肪蓄積、胰島素抵抗誘導(dǎo)炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)與肝功能異常的相互作用是引起NASH 病理進(jìn)展的主要原因。因此及時(shí)把握NASH病理變化進(jìn)展對(duì)于治療NASH 具有重要意義〔11，12〕。中醫(yī)學(xué)中將NASH 稱“肝癖”，其病位在肝，脾，腎，主要與氣、血、津液的生成及運(yùn)行相關(guān)，氣滯，血瘀，痰濕為其主要病理產(chǎn)物。肝癖早期，因飲食不結(jié)、情志不調(diào)、素體肥胖等因素導(dǎo)致肝失疏泄，氣機(jī)郁滯，內(nèi)生痰濕，脾失健運(yùn)，進(jìn)一步影響氣機(jī)通暢，早期則以脾虛肝郁為主，兩者相互影響，蘊(yùn)生痰濕，血瘀等病理產(chǎn)物〔13〕。這與NASH 早期胰島素抵抗，脂質(zhì)代謝紊亂機(jī)理相一致。而病程日久，氣血生化乏源，先天無(wú)以養(yǎng)后天，后期累積于腎，導(dǎo)致腎精虧虛，肝腎功能異常，進(jìn)一步接受病理產(chǎn)物損傷，則是NASH 二次打擊的病理體現(xiàn)，因此疏肝健脾，活血利水是治療NASH 早期病理性損傷的主要治則〔14〕。澤明紅山顆粒主要由澤瀉、山楂、決明子、紅曲四味藥組成，山楂、紅曲兩者在肝癖早期共行健脾祛濕，活血化瘀之功效，此外現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，紅曲米中有效成分具有降脂、抑炎、保護(hù)肝細(xì)胞等作用，同時(shí)還具有調(diào)節(jié)血糖代謝，抑制胰島素抵抗的作用〔15～17〕。澤瀉、決明子具有利水祛濕，清肝瀉火的功效，同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)澤瀉可以抑制內(nèi)源性膽固醇合成的作用。上述四味藥共奏益氣健脾，活血化瘀，利水祛濕的作用，本研究發(fā)現(xiàn)澤明紅山顆?？梢燥@著抑制NASH 小鼠外周血清中膽固醇表達(dá)，同時(shí)改善小鼠肝臟病理?yè)p傷，說明澤明紅山顆粒對(duì)調(diào)節(jié)NASH 脂質(zhì)代謝紊亂及胰島素抵抗具有重要作用。

胰島素抵抗被認(rèn)為是NASH 早期病變的核心及啟動(dòng)因素，大量游離脂肪酸蓄積，促進(jìn)胰島素抵抗的發(fā)生，導(dǎo)致葡萄糖不能對(duì)組織細(xì)胞攝取及利用，誘導(dǎo)線粒體氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生，ATP 合成減少，是引起靶器官損傷的主要原因〔18〕。骨骼肌細(xì)胞是能量代謝的主要部位，在機(jī)體能量代謝和維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)環(huán)境中發(fā)揮重要作用，是NASH 主要受損靶器官之一，有研究發(fā)現(xiàn)骨骼肌細(xì)胞線粒體功能障礙，導(dǎo)致ATP合成/釋放異常，胰島素抵抗發(fā)生的潛在重要因素，因此改善骨骼肌細(xì)胞損傷有助于提高胰島素抵抗的敏感性〔19〕。從中醫(yī)角度血糖、脂肪、蛋白質(zhì)等就是“精微物質(zhì)”，水谷精微的轉(zhuǎn)化，依賴于脾主運(yùn)化功能正常，脾失健運(yùn)，水谷精微物質(zhì)堆積在體內(nèi)，又依賴于胰島素的調(diào)節(jié)，當(dāng)胰島素抵抗發(fā)生時(shí)，蓄積在血脈中的精微物質(zhì)不能被組織有效吸收利用，同時(shí)又加重脾的運(yùn)化功能〔20〕。因此本研究認(rèn)為脾主運(yùn)化與胰島素的調(diào)節(jié)作用關(guān)系密切。本研究發(fā)現(xiàn)澤明紅山顆?？梢燥@著改善NASH 小鼠骨骼肌損傷，同時(shí)促進(jìn)ATP 的合成，抑制肝臟膽固醇的合成及骨骼肌細(xì)胞中的脂質(zhì)堆積，提示“脾主肌肉”理論下，健脾對(duì)于調(diào)節(jié)骨骼肌胰島素抵抗，促進(jìn)線粒體功能恢復(fù)，改善肝功能損傷具有重要意義。

PGC1-α 是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄輔助因子，能夠促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞線粒體的增殖及氧化過程，并刺激線粒體氧化合成ATP，其主要由PPAR 激活，增加脂肪酸氧化酶β 的活性，參與調(diào)節(jié)脂肪酸氧化及合成平衡〔21〕。NRFs 是由核基因編碼的，主要作用于線粒體的呼吸鏈蛋白，主要與線粒體呼吸及編碼線粒體酶有關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)NRFs 可以促使mtTFA 的表，促進(jìn)線粒體的活性，提高胰島素的活性，以促進(jìn)脂質(zhì)代謝及葡萄糖代謝過程，共同維持細(xì)胞能量代謝穩(wěn)態(tài)，而PGC1-α 是調(diào)控NRFs 及mtTFA 的上游，其活性是反映機(jī)體線粒體功能及胰島素的重要因素〔22〕。本研究發(fā)現(xiàn)澤明紅山顆?？梢燥@著抑制NASH 小鼠骨骼肌中PGC-1、PPARα、NRF-1、mtTFA 表達(dá)，進(jìn)一步說明澤明紅山顆?？梢蕴岣哂坞x脂肪酸的利用度，減輕肝臟負(fù)擔(dān)，增加胰島素的敏感性，從而改善NASH 小鼠的肝臟及肌肉組織損傷。

Sirt1 是屬于Sirtuins 家族的一種組蛋白去乙酰化酶，主要參與調(diào)節(jié)多種重要的生物學(xué)功能，如氧化應(yīng)激、能量代謝、凋亡和自噬〔23〕。此外，Sirt1 通過去乙?；{(diào)控下游蛋白Foxa1 去乙酰化，參與調(diào)控氧化應(yīng)激的蛋白的表達(dá)。PGC-1α 在骨骼肌組織中高度聚集，參與調(diào)節(jié)下游和線粒體氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)，AMPK 可以調(diào)節(jié)Sirt1 的活性，增加細(xì)胞內(nèi)NAD+，從而激活NAD+依賴的Sirt1 發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)〔24〕。激活的AMPK 和Sirt1 調(diào)節(jié)PGC-1α 的活性，在線粒體生物合成、能量代謝中起著重要的調(diào)節(jié)作用〔25〕。本研究發(fā)現(xiàn)澤明紅山顆粒可以顯著上調(diào)NASH 小鼠骨骼肌中Sirt1 表達(dá)，下調(diào)Foxa1 表達(dá)，這一調(diào)控機(jī)制進(jìn)一步提示澤明紅山顆粒能夠通過調(diào)控Sirt1/Foxa1 通路，促進(jìn)NASH 小鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體合成，提高骨骼肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取及利用，促進(jìn)游離脂肪酸的糖異生，降低肝細(xì)胞的負(fù)荷，增加胰島素敏感性，從而起到保護(hù)NASH 小鼠肝臟及骨骼肌組織免于胰島素抵抗及脂質(zhì)代謝異常等造成的應(yīng)激性損傷。