青海高原地區(qū)藏族宮頸癌新輔助化療敏感性相關(guān)miRNA譜研究

青海大學(xué)附屬醫(yī)院（810000）沙仁高娃 郭桂蘭 阿小英 鮑統(tǒng)惠

宮頸癌是臨床常見的女性惡性腫瘤，其發(fā)病及死亡率可排在女性惡性腫瘤的前三位[1]。青海地區(qū)的宮頸癌發(fā)病率與全國平均水平相當(dāng)，且青海高原藏族人群的宮頸癌檢出率要明顯高于漢族人群，并呈年輕化的趨勢。宮頸癌根治術(shù)是目前治療宮頸癌的最主要的方式，但多數(shù)患者術(shù)前及術(shù)后需靠化療藥物輔助治療，化療毒副反應(yīng)及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)對患者帶來巨大壓力[2][3]。新輔助化療是一種有效的化學(xué)治療方法，對縮小腫瘤及轉(zhuǎn)移有著積極作用[4]。目前臨床上對化療療效存在較大分歧，因此對宮頸癌患者化療藥物的敏感性檢測，做到個體化的藥物治療勢在必行。微小RNA（mirRNA）是一種具有調(diào)節(jié)作用的非編碼RNA，可參與多種腫瘤基因的調(diào)控過程，對其發(fā)生發(fā)展影響較大[5]。在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中是否存在mir表達(dá)差異，宮頸癌化療敏感及抵抗患者miRNA表達(dá)譜如何，對其新輔助化療的療效有著深遠(yuǎn)的影響。本研究通對青海地區(qū)藏族子宮頸癌組織新輔助化療前后相關(guān)的miRNA表達(dá)譜進(jìn)行檢測，并結(jié)合臨床化療有效性，確定與化療敏感性相關(guān)的差異表達(dá)基因，以期為宮頸癌的治療提供新的藥物作用靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年3月～2018年2月期間，我院收治宮頸鱗癌患者36例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合宮頸鱗癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，并經(jīng)影像學(xué)及病理學(xué)檢查診；②FIGO分期≤Ⅱa，均給予新輔助化療；③簽署知情同意書；排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有精神類疾病及自身免疫系統(tǒng)疾病者；②哺乳期及妊娠期者。所有患者簽署知情同意書。根據(jù)治療情況分為治療敏感組（20例）和治療抗拒組（16例），治療敏感組年齡36～63歲，平均年齡（49.46±7.42）歲；BMI為（22.13±1.35）Kg/m2；FIGO分期：Ⅰb2 12例，Ⅱa 8例。治療抗拒組年齡38～62歲，平均年齡（49.85±7.63）歲；BMI為（22.17±1.48）Kg/m2；FIGO分期：Ⅰb2 10例，Ⅱa 6例。兩組患者一般資料情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 新輔助化療 所有患者均給予TP方案（力樸素+卡鉑），通過靜脈滴注化療：靜脈滴注力樸素（生產(chǎn)廠家：南京綠葉思科藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20030357）劑量：135mg/m2，卡鉑（生產(chǎn)廠家：齊魯制藥有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20020180）靜脈滴注，按血藥濃度-時間曲線下面積（AUC）和肌酐清除率來計(jì)算卡鉑的劑量：卡鉑劑量（mg）=所設(shè)定的AUC（mg/ml/min）×［肌酐清除率（ml/min）+25］。其中：AUC（mg/ml/min）取值為5；內(nèi)生肌酐清除率（Ccr）=(140-年齡)×體重(kg)/72×Scr(mg/dl)×0.85，給藥前30分鐘，給予患者靜脈推注地塞米松（生產(chǎn)廠家：廣西萬德藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20113234）10mg，肌肉注射苯海拉明（生產(chǎn)廠家：天津金耀藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H12020617）20mg，靜脈加壺西咪替?。ㄉa(chǎn)廠家：廣東南國藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H44024630）40mg。

1.2.2 相關(guān)miRNA譜檢測

1.2.2.1 相關(guān)儀器及試劑 實(shí)驗(yàn)主要儀器為：電泳儀（型號：Bio-RaD，廠家：美國Bio-Rad公司）、倒置顯微鏡（型號：Olympus IX71，廠家：日本OLYMPUS）、全自動顯微照相系統(tǒng)（日本Olympus）。主要試劑：裂解液（德國Qiagen公司）、TRNzol總RNA 提取試劑（天根生化科技（北京）有限公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司）、Taqman microRNA 探針（美國Applied Biosystems公司）。

1.2.2.2 樣本采集及miR-138、miR-720及miR-96檢測 采集各組患者的宮頸癌病理組織標(biāo)本，采用qRT-PCR技術(shù)檢測宮頸癌組織中miR-138、miR-720及miR-96的表達(dá)：①將標(biāo)本組織研磨至粉狀；②按照Trizol試劑的說明書提取組織總RNA（純度比值范圍控制：1.8～2.0）；③標(biāo)記microRNA，并進(jìn)行miRNA芯片雜交，并掃描及數(shù)據(jù)分析；④選取miRNA芯片結(jié)果中的miR-138、miR-720及miR-96進(jìn)行熒光定PCR分析：采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒配置反應(yīng)混合物，反轉(zhuǎn)錄合成環(huán)狀DNA；RT-PCR反應(yīng)條件：95℃變性10s，60℃退火20s，70℃延伸10s，40個循環(huán)，相關(guān)引物序列由上海生工公司提供，每次循環(huán)均設(shè)空白對照，計(jì)算目的基因 mRNA的相對表達(dá)量，每組重復(fù)3次取均值。PCR產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳分析并鑒定?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量：△Ct（目標(biāo)基因）=目標(biāo)基因Ct-對照基因Ct，△△Ct=△Ct（目標(biāo)基因）-△Ct（標(biāo)準(zhǔn)值），目標(biāo)基因的相對表達(dá)量則為2-△△Ct。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 化療前后對患者進(jìn)行三維超聲檢查，均由同一名資深影像醫(yī)生進(jìn)行測量，觀察腫瘤體積變化情況，腫瘤體積=腫瘤最大垂直徑線及水平徑線的乘積。

1.3.2 分組方法 化療抗拒組：治療結(jié)束12個月時，腫瘤未消退或增大，或發(fā)現(xiàn)新腫瘤病灶，影像學(xué)及病理檢查發(fā)現(xiàn)腫瘤證據(jù)?；熋舾薪M：治療結(jié)束12個月時，腫瘤完全消退，未新發(fā)腫瘤病灶，血清鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原水平降至正常范圍內(nèi)，且治療結(jié)束后12個月內(nèi)影像學(xué)及病理檢查未發(fā)現(xiàn)腫瘤證據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本次研究使用SPSS19.0（SPSS Inc.,Chicago,IL,USA）統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，其中計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，采用X2檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Spearman分析，當(dāng)P＜0.05時表明數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

附表1 兩組miR-138、miR-720及miR-96表達(dá)情況

附表2 miR-138、miR-720及miR-96與腫瘤體積變化相關(guān)性

2.1 兩組血清miR-138、miR-720及miR-96表達(dá)情況 與化療前相比，治療敏感組化療后miR-138和miR-720表達(dá)均上調(diào)，miR-96表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05）；治療抗拒組化療前后miR-96、miR-138及miR-720表達(dá)無明顯差異（P＞0.05），見附表1。

2.2 miR-138、miR-720及miR-96表達(dá)變化與腫瘤體積變化的相關(guān)性 Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，化療前后miR-96表達(dá)變化與腫瘤體積變化呈正相關(guān)，miR-138及miR-720表達(dá)變化與腫瘤體積變化呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見附表2。

3 討論

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤，中老年女性是高發(fā)群體，近些年呈年輕化趨勢[7]。宮頸癌可分為腺癌和鱗癌兩類，后者最常見，可占宮頸癌的3/4左右。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球每年約48萬女性患宮頸癌，其5年生存率約為70%左右，給女性健康帶來嚴(yán)重影響，目前已成為一個公共衛(wèi)生問題。我國屬于宮頸癌高發(fā)區(qū)，位居世界第二[8]。宮頸癌的患病因素較多，可包括分娩次數(shù)、其他婦科疾病、病毒感染、生物學(xué)因素、性行為及遺傳因素等，早期臨床癥狀不顯著，易被漏誤診。目前給宮頸癌患者創(chuàng)造手術(shù)機(jī)會，并提高療效已成為臨床研究的熱點(diǎn)。

新輔助化療是最早被應(yīng)用于治療乳腺癌的一種重要治療手段，后來被應(yīng)用于宮頸癌的治療，對宮頸癌的術(shù)前治療起到積極作用[9]。本研究治療方案中的力樸素，其主要成分為紫杉醇，其屬于一種天然抗癌藥物，對宮頸癌有特效[10]。治療方案中的卡鉑，無需水化且易于溶解，毒副反應(yīng)相對較小，對宮頸腫瘤的生長有著抑制作用[11]。本研究中盡管對患者均采用新輔助化療方案，但其療效卻存在較大的差異，部分患者出現(xiàn)明顯的化療抗拒。因此尋找預(yù)測化療敏感性的方法顯得十分迫切。

近些年，對化療敏感性的機(jī)制及有關(guān)預(yù)測因素成為的醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，miRNA、COX-2及ERCC1等在分子生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)被熱門關(guān)注[12]。miRNA是一種調(diào)節(jié)基因表達(dá)關(guān)鍵的內(nèi)源性因子，在機(jī)體免疫系統(tǒng)中起重要作用，不僅可反映組織及細(xì)胞的生理狀態(tài)，還會參與自身免疫疾病的發(fā)生發(fā)展過程，在癌變病理過程中起到重要作用[13]。miRNA可阻止RNA酶降解，且一條miRNA可調(diào)控多種miRNA表達(dá)，并具有相對的穩(wěn)定性，因此有限條件下可對全基因進(jìn)行分析。miRNA可在血液中被提純而檢測到，避免入侵性檢查，使檢測變的更簡單快捷，且重復(fù)性高[14]。相關(guān)研究證明，不同的惡性腫瘤具有各自較特異的miRNA表達(dá)譜，其作為腫瘤標(biāo)記物的優(yōu)越性明顯，對腫瘤的輔助診斷價值較高[15]。

本研究結(jié)果顯示，治療敏感組化療后miR-138和miR-720表達(dá)均上調(diào)，miR-96表達(dá)明顯下調(diào)，而治療抗拒組化療前后miR-96、miR-138及miR-720表達(dá)無明顯差異，這可能是因?yàn)楦弑磉_(dá)的miR-138可對同源染色體進(jìn)行抑制，從而增加化療藥物對細(xì)胞DNA損傷的敏感性，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞易感性，從而對腫瘤進(jìn)展和擴(kuò)散的抑制效果增強(qiáng)[16]。低表達(dá)的miR-720和miR-138會促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管浸潤，這可能是宮頸癌患者耐藥的重要原因，而高表達(dá)的miR-720可通過負(fù)性調(diào)控其靶蛋白發(fā)揮其改變DNA損傷修復(fù)能力的生物學(xué)效應(yīng)，抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而使腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性増強(qiáng)[17]。高表達(dá)的miR-96會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展，下調(diào)的miR-96會降低癌細(xì)胞的侵襲和遷移力，增強(qiáng)新輔助化療方案中的紫杉醇誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡的效果，并減緩腫瘤生長[18]。miR-96表達(dá)變化與腫瘤體積變化呈正相關(guān)，miR-138及miR-720表達(dá)變化與腫瘤體積變化呈負(fù)相關(guān)，說明了下調(diào)的miR-96，及上調(diào)的miR-138及miR-720會縮減腫瘤的體積，縮小淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移范圍及間質(zhì)浸潤深度，從而使宮頸癌患者獲得較好的手術(shù)機(jī)會。

綜上所述，青海地區(qū)藏族宮頸癌在發(fā)生發(fā)展中miRNA存在差異表達(dá)，miR-96、miR-138及miR-720與宮頸癌化療敏感性相關(guān)，可為患者療效及預(yù)后提供指導(dǎo)，并為其個性化治療提供新的思路。