ICP-MS研究濃香型白酒發(fā)酵過程中多種金屬元素的變化規(guī)律

李永嬌,宋　川,張宿義,,霍丹群,*,周　濤,鄧　波

(1.重慶大學(xué),生物工程學(xué)院,重慶 400044;2.瀘州老窖股份有限公司,四川瀘州 646000;3.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心,四川瀘州 646000;4.瀘州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所,四川瀘州 646000)

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ICP-MS研究濃香型白酒發(fā)酵過程中多種金屬元素的變化規(guī)律

李永嬌1,宋川2,3,張宿義1,2,3,霍丹群1,*,周濤4,鄧波2,3

(1.重慶大學(xué),生物工程學(xué)院,重慶 400044;2.瀘州老窖股份有限公司,四川瀘州 646000;3.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心,四川瀘州 646000;4.瀘州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所,四川瀘州 646000)

為了研究濃香型白酒發(fā)酵過程中糟醅金屬多元素的變化,采用微波消解結(jié)合ICP-MS技術(shù)測定了不同發(fā)酵時間糟醅中Na、K、As、Pb、Cd、Ti、Mg、Fe、Cu、Mn、Zn、Ca、Al、Ni、Cr和Ba 16種金屬元素的含量與變化規(guī)律。糟醅中各金屬元素的含量與分布與糟醅的空間層面分布和發(fā)酵時間均有顯著關(guān)系。中下層糟醅中金屬元素含量顯著高于中上層糟醅,且隨著發(fā)酵時間延長,糟醅中金屬元素含量先快速增加,然后增速變緩達(dá)到穩(wěn)定。中上層糟醅中對應(yīng)金屬元素增加速率低于中下層糟醅,前者在發(fā)酵28～35 d達(dá)到穩(wěn)定,后者在發(fā)酵28 d左右增速降低。不同空間層面糟醅中多種金屬元素的含量和變化差異可能與發(fā)酵產(chǎn)生的黃水的滲透與遷移有關(guān)。本研究表明白酒發(fā)酵中間代謝產(chǎn)物會顯著影響糟醅中的金屬多元素組成,影響了釀酒原料中的金屬元素向成品白酒轉(zhuǎn)移效率。

濃香型白酒,金屬元素,白酒發(fā)酵,微波消解,電感耦合等離子體質(zhì)譜

白酒中金屬元素的含量和組成與其品質(zhì)有著密切關(guān)系。適量的金屬離子可以調(diào)節(jié)酒體的感官品質(zhì),降低刺激感,使“陳釀”白酒口味柔和[1]。Fe和Mn等離子絡(luò)合物可使白酒產(chǎn)生顏色,但與陰離子同時存在時,會引發(fā)澀、苦、堿甚至腥味等異味[2]。與此同時,酒體中的某些金屬元素影響了成品白酒的穩(wěn)定性,如Ca和Mg離子濃度的超量或者失衡可以導(dǎo)致酒體渾濁甚至沉淀[3-4]。另外,酒體中若引入過量的Pb、Mn、Cd、As和Hg等重金屬元素污染,會造成嚴(yán)重的安全隱患,危害消費者身體健康[5-6]。

由于工業(yè)化擴(kuò)張和環(huán)境污染造成的土壤污染問題日趨嚴(yán)重,包括重金屬元素在內(nèi)的許多有害物質(zhì)進(jìn)入糧食,對以谷物為釀造原料的白酒造成了潛在的質(zhì)量安全隱患。由于成品酒中的金屬元素?zé)o法簡單去除,為了避免相關(guān)成分的超標(biāo)造成酒體污染,更可行的辦法是嚴(yán)格篩選釀造原料和優(yōu)化生產(chǎn)過程,以控制或減少可能的危害性組分帶入。因此,監(jiān)測釀造原料在發(fā)酵過程中可能進(jìn)入酒體的金屬元素的動態(tài)變化具有重要意義[7]。Castieira[8]和Trujillo[9]等人分別研究了德國白葡萄酒和葡萄牙紅葡萄酒釀造過程中金屬多元素的遷移變化規(guī)律,但迄今為止,關(guān)于中國白酒生產(chǎn)過程中的金屬元素變化研究鮮有報道。

本研究運用ICP-MS結(jié)合微波消解技術(shù),測定了釀酒糟醅樣品中Na、K、As、Pb、Cd、Ti、Mg、Fe、Cu、Mn、Zn、Ca、Al、Ni、Cr和Ba 16種金屬元素在發(fā)酵過程中的變化規(guī)律,探討了不同空間分布和發(fā)酵時間對糟醅中殘留金屬元素的影響,為研究包括重金屬元素在內(nèi)的多組分在白酒生產(chǎn)過程中的動態(tài)遷移變化規(guī)律奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

分析純硝酸(65%)美國Merck Emsure公司;單元素標(biāo)準(zhǔn)物國家標(biāo)物中心;酒糟樣品瀘州老窖股份有限公司釀酒基地提供。

電感耦合等離子體發(fā)射光譜質(zhì)譜儀(ELAN 9000/DRC-e)美國Perkin Elmer公司;微波消解儀(Mars6)美國CEM公司;超純水儀美國Merck Millipore公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9123A型)上海恒科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1樣品制備利用取樣器采集窖池中不同深度的糟醅,選定據(jù)窖池表面深度1 m以上的糟醅為中上層,1 m以下樣品為中下層。檢測前,所有酒糟樣品干燥48 h后粉碎。為避免引入雜質(zhì),所有器皿提前用20%的硝酸浸泡過夜,然后去離子水沖洗干燥待用。準(zhǔn)確取稱0.3～0.4 g(準(zhǔn)確到0.0001 g)經(jīng)干燥粉碎的樣品于微波消解管中,加入4.0 mL硝酸和3.0 mL過氧化氫,微波消解后定容至50.0 mL待用。

1.2.2檢測方法考察了射頻發(fā)生器功率、載氣、輔助氣流量、進(jìn)液泵速、積分時間等對被測元素譜線發(fā)射強度的影響,綜合考慮各個元素的靈敏度和穩(wěn)定性,使用1 μg/L質(zhì)譜調(diào)諧液和100 μg/L內(nèi)標(biāo)溶液(由100 mg/L在線內(nèi)標(biāo)溶液稀釋1000倍),對ICP-MS儀器測定時的工作條件進(jìn)行優(yōu)化。選定各測定元素、分別測定試劑空白、標(biāo)準(zhǔn)系列、樣品空白和樣品溶液,根據(jù)線性回歸方程分別計算出樣品中所測元素的濃度。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用SPSS22軟件進(jìn)行t檢驗分析,取p<0.05為顯著性。

2　結(jié)果與分析

2.1糟醅中多種金屬元素的含量分析

糟醅中的多種金屬元素來源大致可以分為三類:釀酒原料、窖池微生物與發(fā)酵環(huán)境(窖池、生產(chǎn)設(shè)備、用水、空氣等)的引入[10]。其中,釀酒原料及發(fā)酵環(huán)境是糟醅中金屬元素的主要來源。瀘型酒以高粱為主要原料,小麥等谷物為輔料。這些原料在生長過程中一方面吸收了土壤中的金屬肥料,一方面也富集了土壤中污染的金屬元素,因此釀酒原料的品質(zhì)在一定程度決定了糟醅中多種金屬元素含量和組成,而糟醅中的多種金屬元素含量可以反映釀造原料的品質(zhì),甚至原料的產(chǎn)地與理化性質(zhì)[11-12]。表1為16種金屬元素在中上層和中下層糟醅樣品中的平均含量分布和對應(yīng)元素在兩種樣品中相關(guān)性的配對t檢驗結(jié)果。

從表中可以看出,K、Mg、Ca、Fe、Ni、Ti、Al、Mn八種元素的平均含量最高,達(dá)到了mg/g級別。K、Mg和Ca是植物生長所必需的三種礦質(zhì)元素,在農(nóng)作物體內(nèi)含量遠(yuǎn)高于其它金屬元素。土壤中Fe、Ni、Ti和Mn含量本身較高,加上農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中添加至土壤中的鐵肥、鈦肥和鎳肥,其在糟醅中的含量相較于其他重金屬相對更高。Al元素并非作物生長所需,在土壤中含量同樣較高,近年來因制造業(yè)的擴(kuò)張或環(huán)境污染造成的土壤酸化[13],加速了農(nóng)作物的吸附,在谷物中累積,造成了糟醅中Al含量較高。需要注意的是,Pb、As、Cr和Cd等元素常被視為食品中的危害性元素,其濃度超標(biāo)可能帶來健康威脅。本研究測定結(jié)果顯示,糟醅中As、Cr和Cd元素含量均低于國標(biāo)規(guī)定的最低殘留限,Pb含量略高,其可能是由生產(chǎn)用水和設(shè)備所引入。糟醅中16種金屬元素的平均含量從大到小依次為:K>Mg>Ca>Fe>Ni>Ti>Al>Mn>Na>Zn>Ba>Cr>Cu>Pb>As>Cd。

表1　中上層和中下層糟醅樣品中16種金屬元素的平均含量和對應(yīng)元素配對t檢驗結(jié)果

注:*表示具有顯著相關(guān)性(p<0.05)。2.2不同空間層面糟醅中金屬元素的遷移

對比中上層和中下層糟醅中對應(yīng)元素的平均含量發(fā)現(xiàn),16種金屬元素在中下層糟醅中的平均含量均高于其在中上層。為了分析發(fā)酵過程中多種金屬元素在不同空間層面的糟醅含量差異,分別測定了中上層和中下層糟醅中對應(yīng)元素,并借助SPSS軟件通過配對t檢驗分析了對應(yīng)元素的差異性。結(jié)果表明,由于取樣糟醅在空間上的差異,K、Mg、Ca、Fe、Ni、Ti、Al、Mn、Na、Zn、Ba等11種元素在中上層、中下層糟醅中含量有顯著差異(p<0.05)。與此同時,盡管中下層糟醅中Cu、Pb、As、Cd和Cr含量高于中上層樣品,但是兩者之間并無顯著差異性。發(fā)酵過程中窖池微生物的引入、生長和遷移,以及發(fā)酵代謝產(chǎn)物的生成、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移,部分金屬元素會隨著發(fā)酵的進(jìn)行而出現(xiàn)變化[14-15]。由于發(fā)酵產(chǎn)生的黃水由上層糟醅流向下層糟醅,導(dǎo)致了部分溶于黃水的金屬元素向下層糟醅轉(zhuǎn)移,因此造成了中下層糟醅中相關(guān)金屬元素的含量明顯高于中上層。t檢驗結(jié)果表明,中上層和中下層糟醅中含量無顯著差異的五種元素在測定的16種元素中平均最低。一般而言,從糟醅轉(zhuǎn)移進(jìn)入黃水的金屬元素含量主要決定于其在糟醅中的濃度以及在糟醅和黃水中的相對分配系數(shù),由于糟醅中Cu、Pb、As、Cd和Cr含量本身較低,且As和Cr常以化合物形式存在,Cu、Pb和Cd等重金屬易于被糟醅吸附,因此轉(zhuǎn)移量也會相對較低,所以在中上層和中下層糟醅中并未出現(xiàn)顯著差異。

為了進(jìn)一步探討中上層和中下層糟醅中各元素間的相互關(guān)系,借助SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件采用最大方差旋轉(zhuǎn)法對16種金素元素在不同樣本中的組成進(jìn)行了因子分析。圖1為各元素在主成份因子分析所提取的前三個主成份上的載荷所繪制的三維因子分布圖。各元素的對應(yīng)載荷值差異反映了其在相應(yīng)主成份上的相似性,在三維因子分布圖上越靠近表明這些元素相似程度越高。從各元素在中上層糟醅中的因子載荷分布在因素1和因素2(這兩個主成分對因子分析的貢獻(xiàn)率最高)組成的平面上的投影可以看出,16種金屬元素大致可以分為三個區(qū)域:Na、Al、Mg、As和Cr五元素為第一組,Cd、Cu、Pb、Ba、Fe和Ti六元素組成第二組,剩余5個元素為第三組。同樣,根據(jù)在因素1和因素2組成的平面上的投影區(qū)域,中下層糟醅中的各元素組成亦可分為三簇:第一組為Ba、As和Ni三元素,第二組為Pb、Al、Fe三種元素,剩余10種元素則為第三組。對比兩種樣品中各簇元素組成發(fā)現(xiàn),盡管其在糟醅中的相對含量排序相同,但在中上層和中下層中的分類卻明顯不同,這表明根據(jù)因子分析結(jié)果的多元素分組并不完全依賴各元素的濃度高低。兩種樣品中相同金屬元素的不同分類反映了兩者之間在多元素組成上有明顯差異,這與配對t檢驗的結(jié)論一致。由此可以推斷,糟醅發(fā)酵過程中不同空間分布的不同元素隨著發(fā)酵時間的延伸經(jīng)歷了不盡相同的變化過程。

圖1　中上層和中下層糟醅中16種元素的因子載荷分布Fig.1　loading value of 16 kinds of metal elements in fermented grains from upper-middle layer and underlayer注：a:中上層；b:中下層。

2.3不同空間層面糟醅中多種金屬元素變化與發(fā)酵時間的關(guān)系

為了考察發(fā)酵時間對不同空間層面的糟醅中多種元素組成的影響,測定了發(fā)酵時間分別為0、7、14、21、28、35、42、49 d的糟醅中各金屬元素的含量,并采用Pearson相關(guān)分析法分析了發(fā)酵時間與元素含量之間的關(guān)系。檢驗結(jié)果中相關(guān)性正、負(fù)值分別表示正相關(guān)或負(fù)相關(guān),取值大小表明了相關(guān)程度。由于事先無法確定兩者之間是正相關(guān)還是負(fù)相關(guān),借助雙尾檢驗(two-tail)進(jìn)行了顯著性分析。如表2所示,中上層糟醅樣品中Ca、Cu、Fe、K、Mg、Mn、Zn和Pb八種元素與發(fā)酵時間呈正相關(guān),且具有顯著性(p<0.05),Na和Ba元素與發(fā)酵時間呈負(fù)相關(guān),但并無顯著性。中下層糟醅中16種元素與發(fā)酵時間均呈正相關(guān),但僅有Ca、K、Mg、Mn、Na、Pb、As、Cd、Al和Cr 10種元素具有顯著性。兩者對比發(fā)現(xiàn),中上層糟醅中與發(fā)酵時間顯著正相關(guān)的Cu、Fe和Zn三種元素在中下層糟醅中并無顯著性,這可能是由于發(fā)酵過程中釀酒微生物在窖池中的選擇性空間分布所造成的。另外,中下層糟醅中與發(fā)酵時間顯著正相關(guān)的Na、As、Cd、Al和Cr 五種元素在中上層糟醅中并無顯著性,這可能是由于發(fā)酵產(chǎn)生的黃水在不同空間的糟醅中的累積所造成的。

表2　中上層和中下層糟醅中多種金屬元素變化與發(fā)酵時間相關(guān)性的Pearson分析系數(shù)

Almeida等人報道了葡萄汁和葡萄酒中金屬多元素的線性回歸分析方法[16]。為了進(jìn)一步研究糟醅中多元素組成隨發(fā)酵時間的變化規(guī)律,分別選取中上層和中下層糟醅中與發(fā)酵時間顯著正相關(guān)的金屬元素為觀測值,以糟醅中對應(yīng)元素的原始含量為參照作線性回歸分析,結(jié)果如圖2所示。

圖2　發(fā)酵時間與糟醅中多種金屬元素含量的線性回歸分區(qū)限及對應(yīng)斜率分布曲線圖Fig.2　linear regression between fermentation time and multi-elemental composition in fermented grains and plot of resultant slops

從圖中可以看出,經(jīng)不同發(fā)酵時間的中上層或中下層糟醅中相關(guān)元素對其初始濃度線性擬合效果良好,相關(guān)系數(shù)R2均大于0.98。由于參考標(biāo)準(zhǔn)為糟醅中金屬元素的初始濃度,且各線性擬合曲線的斜率均大于1,說明無論中上層還是中下層糟醅,對應(yīng)金屬元素相對其原始含量均有一定程度的上升。取對應(yīng)發(fā)酵時間的線性擬合斜率相對發(fā)酵時間作曲線圖如圖2所示,從圖中可以看出隨著發(fā)酵的進(jìn)行,糟醅中對應(yīng)的金屬元素含量逐漸增加,且增加速率在發(fā)酵前半段較快,在發(fā)酵后半段明顯減慢至趨于穩(wěn)定。對比中上層和中下層對應(yīng)發(fā)酵時間的斜率值和變化趨勢可以看出來,中下層糟醅中的對應(yīng)元素含量變化程度和速率均大于中上層。中上層糟醅中對應(yīng)金屬元素在發(fā)酵前期逐漸增加,在發(fā)酵28～35 d內(nèi)達(dá)到最大值,然后趨于穩(wěn)定。而中下層糟醅中金屬元素在發(fā)酵前28 d迅速增加,28 d之后增加緩慢,直至發(fā)酵結(jié)束(49 d)仍未達(dá)到最高值。糟醅發(fā)酵過程中微生物代謝產(chǎn)生大量黃水,從上層糟醅流向下層糟醅,由于空間分布上的差異,滲透進(jìn)入中上層糟醅中的黃水量和接觸時間均低于中下層糟醅。因此,黃水中的金屬元素可以更快、更多的轉(zhuǎn)移至中下層糟醅,最終導(dǎo)致了中下層糟醅中金屬元素中加速度快,且含量明顯高于中上層。

2.4單個金屬元素在不同空間層面糟醅中隨發(fā)酵時間的變化關(guān)系

由于理化性質(zhì)和分配系數(shù)的差異,在不同空間層面的不同金屬元素在不同時間的變化規(guī)律不盡相同,因此有必要研究發(fā)酵時間對各個金屬元素含量變化的影響。對應(yīng)金屬元素隨發(fā)酵時間變化曲線分別如圖3所示。隨著發(fā)酵時間延長,中上層和中下層糟醅中Ca、K、Mg和Mn四種元素在發(fā)酵前半段逐漸升高,發(fā)酵后半段,中上層慢慢趨于穩(wěn)定,中下層增速減慢甚至降低,可能的解釋是黃水從下層糟醅流入窖池底部帶走了部分金屬元素。盡管兩種糟醅中Pb變化均與發(fā)酵時間顯著正相關(guān),但其變化趨勢與前四種明顯不同,其在中上層和中下層糟醅中的變化趨勢基本一致,均呈波動趨勢,其獨特的變化趨勢一方面可能源于其在黃水和糟醅中的分配差異,一方也可能源于其濃度過低造成的多次測定中的誤差。值得注意的是,中下層糟醅中的Fe、Cu和Ba三種元素均在發(fā)酵第20 d出現(xiàn)了含量的急劇下跌,表明在此階段可能出現(xiàn)了大量的黃水從底層糟醅流入窖池底部。另外,盡管各金屬元素的初始濃度一致,在發(fā)酵周期結(jié)束后,中下層糟醅中的各金屬元素含量值均高于中上層,證明了不同空間層面的糟醅經(jīng)過發(fā)酵之后會出現(xiàn)不同的物質(zhì)轉(zhuǎn)移,形成不同的組成。

3　結(jié)論

利用微波消解結(jié)合ICP-MS技術(shù)測定了濃香型白酒發(fā)酵過程中Na、K、As、Pb、Cd、Ti、Mg、Fe、Cu、Mn、Zn、Ca、Al、Ni、Cr和Ba 16種金屬元素的含量與變化規(guī)律。結(jié)果表明,糟醅中各金屬元素的含量與分布與糟醅的空間層面分布和發(fā)酵時間均有顯著關(guān)系。中下層糟醅中金屬元素含量顯著高于中上層糟醅,且隨著發(fā)酵時間延長,糟醅中金屬元素含量先快速增加,然后增速變緩達(dá)到穩(wěn)定。中上層糟醅中對應(yīng)金屬元素增加速率低于中下層糟醅,前者在發(fā)酵28～35 d達(dá)到穩(wěn)定,后者在發(fā)酵28 d左右增速降低。不同空間層面糟醅中多種金屬元素的含量和變化差異可能與發(fā)酵產(chǎn)生的黃水的滲透與遷移有關(guān)。

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Investigation of concentration change of metal elements in the wine lees during fermentation by ICP-MS

LI Yong-jiao1,SONG Chuan2,3,ZHANG Su-yi1,2,3,HUO dan-qun1,*,ZHOU Tao4,DENG Bo2,3

(1.Bioengineering College,Chongqing University,Chongqing 400044,China; 2.LuzhouLaojiao Co. Ltd.,Luzhou 646000,China; 3.National Engineering Research Center of Solid-State Brewing,Luzhou 646000,China; 4.Luzhou Institute for Product Quality Supervision and Inspection,Luzhou 646000,China)

In the present study,the concentration and change of 16 kinds of common metal elements including Na,K,As,Pb,Cd,Ti,Mg,Fe,Cu,Mn,Zn,Ca,Al,Ni,Cr and Ba were detected in wine lees(fermented grain)in the fermentation process using ICP-MS coupled with microwave-assistant decomposition methods. It suggested that the spatial distribution of the wine lees and the fermentation time exerted clear influence on the concentration of the metal elements in the samples. The concentrations were significantly higher in the mid-lower lees than those in the mid-upper ones,and increased with increasing of fermentation time. The increasing rates of the mid-lower samples were much faster than the mid-upper,which reached to a balance after fermentation for 28 days while the latter showed a balance after 28～35 days. The difference in concentration and change pattern of metal elements in wine lees of different spatial distribution may be ascribed to the production and transfer of Huang-shui during fermentation. The preliminary study suggested that the fermentation mediates influence the multi-elemental composition of fermented grains,thus impact the transferring efficiency of metallic components from raw materials to wine products.

Luzhou flavor Chinese liquor;metallic elements;liquor fermentation;microwave-assisted digestion;ICP-MS

2016-03-14

李永嬌(1989-)，女，在讀碩士研究生，研究方向:微生物資源開發(fā)與利用，E-mail：liyongjiao@cqu.edu.cn。

霍丹群(1965-)，女，博士，教授，研究方向：微生物資源開發(fā)與利用、生物大分子、生物芯片、納米材料與檢測技術(shù)，E-mail:huodq@cqu.edu.cn。

國家科技支撐計劃課題(2014BAD07B02)；四川省科技支撐項目(2014SZ0022)；釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室項目(NJ2014-03)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)17-0267-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.044