漆酶在食品領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)展

張　昱,趙　倩,李冠華

(內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010021)

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漆酶在食品領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)展

張昱,趙倩,李冠華*

(內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010021)

漆酶在食品領(lǐng)域的應(yīng)用日漸深入而廣泛。論文介紹漆酶催化特征及優(yōu)點(diǎn);綜述漆酶在果汁加工、葡萄酒釀造、面粉改良、食用菌栽培、食品檢測(cè)、食品廢水處理、牛奶凝膠化方面的研究概況;展望漆酶食品工業(yè)的發(fā)展前景。

漆酶,食品領(lǐng)域,應(yīng)用,催化

1883年日本學(xué)者Yoshida在紫膠漆樹(Rhusverniciflua)汁液中發(fā)現(xiàn)一種能夠催化酚類物質(zhì)的蛋白質(zhì),1884年Bertrand將這種蛋白質(zhì)命名為漆酶(laccase)[1]。漆酶在高等植物、真菌、昆蟲和細(xì)菌中均有發(fā)現(xiàn),真菌是漆酶的重要生產(chǎn)者,特別是大型擔(dān)子菌和子囊菌,已報(bào)道數(shù)量達(dá)120多種[2]。工業(yè)用漆酶通過(guò)發(fā)酵獲得,包括固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵,液態(tài)發(fā)酵是漆酶的主要生產(chǎn)方式,菌種涉及細(xì)菌和真菌。細(xì)菌發(fā)酵周期短,表達(dá)量高,但漆酶氧化還原電勢(shì)較低故應(yīng)用范圍有限。真菌漆酶氧化還原電勢(shì)高,但生長(zhǎng)緩慢,表達(dá)量低。構(gòu)建工程菌株,實(shí)現(xiàn)真菌漆酶基因在米曲霉、里氏木霉、釀酒酵母等生物中異源表達(dá)是解決上述問(wèn)題的重要途徑。漆酶已有一百多年的研究應(yīng)用歷史,由于其獨(dú)特的催化特性,被稱為綠色化學(xué)中的藍(lán)色酶,在生物、食品、環(huán)境、能源、材料等領(lǐng)域[3-4]具有潛在應(yīng)用價(jià)值。1996年Novozymes推出第一個(gè)商品化漆酶DeniLite?I應(yīng)用于紡織和造紙行業(yè),隨后推出Suberase?應(yīng)用于食品行業(yè)[5]。本文將就漆酶的催化特征及在食品領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1　漆酶的催化特征

1.1漆酶的結(jié)構(gòu)

漆酶是一種糖蛋白,由肽鏈、糖配基和Cu2+組成,屬藍(lán)色多銅氧化酶家族(blue multi-copper oxidase),在氧氣參與下可催化多酚、多氨基苯等物質(zhì),使之生成相應(yīng)的苯醌和水。Cu2+是漆酶催化活性中心,根據(jù)磁學(xué)和光譜性質(zhì)差異,漆酶的Cu2+分為三類:Ⅰ型Cu2+呈順磁性,是單電子受體,與半胱氨酸的S結(jié)合形成共價(jià)鍵,在600 nm處有較強(qiáng)吸收峰,呈藍(lán)色;Ⅱ型Cu2+各一個(gè),呈順磁性,是單電子受體,可與兩個(gè)組氨酸(His)和一個(gè)水分子配位形成松散的T型結(jié)構(gòu),在600 nm處無(wú)較強(qiáng)吸收峰,不顯藍(lán)色;Ⅲ型Cu2+,是雙電子受體,以耦合離子對(duì)(Cu2+Cu2+)的形式存在,與3個(gè)組氨酸(His)和一個(gè)氫氧橋配位形成四面扭曲的四方立體結(jié)構(gòu)。典型的漆酶中三種類型的Cu2+都存在,漆酶呈藍(lán)色,常被稱為“藍(lán)色漆酶”。隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)部分漆酶中缺少Ⅰ型Cu2+,這類漆酶呈白色,被稱為“白色漆酶”,有些漆酶中Cu2+在600 nm處無(wú)顯著吸收峰,而在300 nm處有顯著吸收峰,呈黃色,被稱為“黃色漆酶”[6]。藍(lán)色漆酶需要有小分子介體物質(zhì)協(xié)助參與催化氧化非酚型化合物,而黃色漆酶則能夠在無(wú)外源介體的情況下催化氧化非酚型化合物。

1.2漆酶的催化過(guò)程

圖1　漆酶催化電子轉(zhuǎn)移示意圖Fig.1　Map of electron transport during laccase catalyzed process

漆酶催化屬于雙底物的酶促反應(yīng),在氧分子參與的條件下,利用Cu2+的氧化能力對(duì)還原性底物進(jìn)行氧化[7],即漆酶催化底物將單電子傳遞給分子氧,氧氣得電子被還原生成水,底物失去一個(gè)電子,形成自由基,自由基不穩(wěn)定,進(jìn)一步發(fā)生聚合或解聚等非酶催化反應(yīng),機(jī)制為乒乓反應(yīng),基本過(guò)程如圖1所示。漆酶催化過(guò)程比較復(fù)雜,可分為3種方式:漆酶將底物分子直接氧化形成帶自由基的化合物;通過(guò)介體參與完成對(duì)具有高氧化還原電勢(shì)底物的催化;漆酶氧化介體,進(jìn)一步氧化黃素酶,由氧化的黃素酶完成對(duì)底物催化,而氧化的黃素酶通過(guò)脫氫酶系以實(shí)現(xiàn)再生。介體的參與可以擴(kuò)展漆酶的應(yīng)用范圍,漆酶介體的催化反應(yīng)途徑受到漆酶氧化還原電勢(shì)、介體與底物分子結(jié)構(gòu)的影響[8],不同介體可以參與漆酶多種氧化途徑,生成不同的產(chǎn)物。已報(bào)道介體達(dá)100多種,如紫脲酸、1-羥基苯并三唑等,上述介體價(jià)格昂貴且具有潛在的毒性,尋找天然、廉價(jià)、無(wú)毒介體是當(dāng)前漆酶研究的重要方面。

1.3漆酶催化的優(yōu)越性

漆酶多為糖基化酶,不易結(jié)晶,穩(wěn)定性好;氧化還原電位高(780 mV),作用底物范圍廣,可氧化多酚、二元胺、芳香胺、對(duì)苯二酚、氨基酚、芳香硫醇等,通過(guò)介體參與還可氧化非酚類物質(zhì)[9];在氧分子參與下可直接氧化底物,不需要H2O2和其他次級(jí)代謝產(chǎn)物參與,反應(yīng)條件簡(jiǎn)單[10];副產(chǎn)物只有水,對(duì)環(huán)境無(wú)污染;此外漆酶還具有分布范圍廣,屬胞外酶易于提取,作用條件溫和,安全無(wú)毒性等特性。由于上述優(yōu)越性,漆酶在食品領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。

2　漆酶在食品領(lǐng)域的應(yīng)用

漆酶在果汁澄清、面粉烘焙、食品在線檢測(cè)、葡萄酒釀造、食品感官改善、高附加值食品添加物生產(chǎn)等方面具有重要作用。表1列舉了近幾年漆酶在食品應(yīng)用的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,由表1可知漆酶來(lái)源廣,在食品領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

表1　漆酶在食品工業(yè)的應(yīng)用進(jìn)展

2.1漆酶在果汁加工的應(yīng)用

果汁中含有單寧、花青素等酚類物質(zhì),使果汁渾濁度增加、顏色加深、出現(xiàn)沉淀,高濃度單寧具有苦味,影響果汁品質(zhì)。果汁澄清可利用物理化學(xué)吸附劑,過(guò)濾技術(shù)及添加抗氧化劑等方法。明膠和膨潤(rùn)土是兩種最常見的吸附劑,使用過(guò)程中破壞果汁品質(zhì);膜過(guò)濾技術(shù)在滲透過(guò)程中發(fā)生膜污染以及過(guò)濾速度的降低,影響效率[33];抗壞血酸和亞硝酸鹽作用效率低,且具有潛在危害。漆酶能夠?qū)Ｒ?、高效地去除果汁中大多?shù)酚類物質(zhì),一方面可使酚類物質(zhì)形成自由基,自由基形成醌類化合物,進(jìn)一步反應(yīng)形成多聚物而沉淀;另一方面漆酶并不會(huì)氧化破壞人體必需酪氨酸,避免果汁營(yíng)養(yǎng)受到影響[34]。Lettera研究表明固定化的漆酶可以選擇性除去桔子、石榴、杏仁、桃子、櫻桃和蘋果汁中多酚物質(zhì),去除率在45%以上,而對(duì)人體有益的黃酮物質(zhì)得以保存,去除乙烯基愈創(chuàng)木酚的果汁具有更好口感[13]。新型高分子材料具有使結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)靈活、高效等優(yōu)點(diǎn),作為漆酶固定化載體的研究越來(lái)越多。Gassara-Chatti將Phanerochaetechrysosporium固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物漆酶、錳過(guò)氧化物酶和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶,利用丙烯酰胺-果膠固定化,考查上述酶對(duì)石榴汁和番茄汁中多酚物質(zhì)的作用效果,結(jié)果表明三種酶協(xié)同作用能顯著去除果汁的多酚物質(zhì),提高澄清度[11],但高分子材料價(jià)格昂貴,規(guī)模應(yīng)用受到限制。de Souza Bezerra等采用熱降壓、酸、堿協(xié)同處理后的椰皮纖維素為載體,以乙醛酰或戊二醛為支持物固定漆酶用于蘋果汁澄清,結(jié)果表明漆酶可以脫去果汁61%±1%的顏色,降低29%±1%的渾濁度,重復(fù)利用10次后,漆酶還保留全部初始活性,實(shí)現(xiàn)了利用廉價(jià)支持物固定漆酶用于果汁澄清[12]。實(shí)驗(yàn)并未對(duì)經(jīng)過(guò)兩步預(yù)處理的纖維進(jìn)行更好的物理化學(xué)特征描述,也未對(duì)在蘋果汁澄清中實(shí)現(xiàn)溫和氧化、保持氧化活性的最適參數(shù)進(jìn)行研究。

2.2漆酶在葡萄酒釀造的應(yīng)用

葡萄酒中含有多種酚類物質(zhì),如單寧、苯乙烯酸、兒茶酚、花色素及香豆酸衍生物等影響葡萄酒穩(wěn)定性和感官性質(zhì)。葡萄酒中的多酚物質(zhì)主要來(lái)源于葡萄皮和葡萄籽,特別是葡萄籽中的單寧會(huì)直接影響感官品質(zhì)。Czyzowska等發(fā)現(xiàn)多酚物質(zhì)的含量隨著葡萄酒釀造或儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而減少,從而改變葡萄酒的色澤[35]。傳統(tǒng)葡萄酒酚類物質(zhì)去除的工藝有添加聚乙烯吡咯烷酮、二氧化硫、氧化劑、蛋白質(zhì)等,但上述方法不能很好地保護(hù)酒的感官特性,而且有些添加劑不易分解,會(huì)造成廢水處理困難和環(huán)境污染。漆酶可以實(shí)現(xiàn)溫和條件下去除葡萄酒中的酚類物質(zhì),同時(shí)保持葡萄酒的感官特性不變[36]。漆酶直接氧化葡萄酒中酚類物質(zhì),后者聚合后,可通過(guò)澄清工藝除去。Chawla等將漆酶通過(guò)共價(jià)鍵固定在銀/氧化鋅納米材料上,除去葡萄酒中的多酚物質(zhì),同時(shí)在線測(cè)定多酚含量變化,其具有工作電勢(shì)低、反應(yīng)速度快、靈敏性高、可利用時(shí)間長(zhǎng)且穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)[25]。Juan等構(gòu)建了Lac/SNGC漆酶?jìng)鞲衅髟诰€測(cè)定葡萄酒中多酚物質(zhì)含量變化,提出葡萄酒中酚類與二氧化硫的比率可作為判斷葡萄酒營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的新的參數(shù)指標(biāo)[22]。Conrad等人還發(fā)現(xiàn)漆酶處理葡萄酒瓶木塞,產(chǎn)生酚類物質(zhì)具有抗菌作用,可以有效減少木塞污染[17]。由于漆酶不屬于食品添加劑,固定化漆酶必須從葡萄汁中除去并回收利用,提高固定化漆酶活性與穩(wěn)定性,實(shí)現(xiàn)無(wú)殘留催化是漆酶葡萄酒釀造應(yīng)用的重要研究方向。

2.3漆酶在面粉改良的應(yīng)用

提高面粉制品品質(zhì)是當(dāng)前研究的重要方面,面粉蛋白改性還處于起步階段。傳統(tǒng)改性方法是加入過(guò)氧化苯甲酰、過(guò)氧化鈣、溴酸鉀等化學(xué)改良劑,但其安全性一直備受關(guān)注,如研究發(fā)現(xiàn)溴酸鉀具有潛在致癌性。漆酶能提高面團(tuán)機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性,降低粘性,改善機(jī)械加工性能。Labat等首次報(bào)道漆酶通過(guò)酯化阿魏酸的二聚作用交聯(lián)阿糖基木聚糖,可以增強(qiáng)面團(tuán)的強(qiáng)度和穩(wěn)定性,降低粘性,改善機(jī)械加工性能[37],進(jìn)而可以有效增大面包蛋糕的體積,提高均一性,防止烘焙面包塌陷。Selinheimo研究了漆酶,木聚糖酶以及二者協(xié)同聯(lián)合對(duì)面團(tuán)伸展性和抗拉伸性的影響,結(jié)果表明漆酶可以使面團(tuán)變硬,抗拉伸性增強(qiáng),延展性減弱[38]。Cura研究認(rèn)為面粉中阿魏酸可以被漆酶氧化成小分子酚類化合物,漆酶和阿魏酸組合有助于增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子間交聯(lián)[39]。Flander研究了酪氨酸酶、漆酶和木聚糖酶對(duì)面筋蛋白的改性作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)酪氨酸酶催化小分子蛋白發(fā)生交聯(lián),形成大分子蛋白質(zhì),面團(tuán)硬度增大,漆酶改變面團(tuán)體積,但不影響硬度[18]。Brinch等曾對(duì)食品用漆酶進(jìn)行毒理學(xué)研究,結(jié)果表明漆酶不會(huì)引起基因突變,沒(méi)有皮膚毒性和吸入毒性,以一定比例飼喂小鼠13周,小鼠未表現(xiàn)出不適癥狀[40]。作為添加劑用于食品工業(yè),還需對(duì)漆酶進(jìn)行更全面的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn),特別是漆酶遺傳毒性,催化產(chǎn)物的潛在毒性等方面。

2.4漆酶在食用菌栽培的應(yīng)用

漆酶是食用菌生活史中必不可少的一個(gè)酶分子,對(duì)子實(shí)體的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、防御,縮短食用菌生產(chǎn)周期,降低生產(chǎn)成本,提高抗菌能力等方面具有重要的意義。De Souza研究表明Pleurotuspulmonarius在其菌絲生長(zhǎng)時(shí)向胞外分泌漆酶參與菌絲體發(fā)育[41],Sun對(duì)15種食用菌不同生長(zhǎng)階段漆酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)食用菌的漆酶分泌與生長(zhǎng)密切相關(guān)[20]。Montoya研究發(fā)現(xiàn)Grifolafrondosa在菌絲體增殖階段漆酶等活性迅速增加,達(dá)到最高,隨著子實(shí)體形成開始下降[42]。上述研究表明食用菌漆酶活性的增加與菌絲的快速生長(zhǎng)以及原基的形成密切相關(guān),菌絲在漆酶參與下扭結(jié)形成原基,并進(jìn)一步發(fā)育形成。Munk研究了真菌中漆酶氧化過(guò)程的電子受體、作用底物、反應(yīng)的環(huán)境,以及氧化還原電位差,通過(guò)建立木質(zhì)素模型,討論了真菌木質(zhì)化與漆酶的相關(guān)性,證明了漆酶參與木質(zhì)素降解,為食用菌生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)[43]。因此食用菌栽培過(guò)程中添加漆酶制劑可促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)、原基形成,縮短生產(chǎn)周期、提高產(chǎn)量。漆酶能氧化催化低分子量酚類化合物,參與細(xì)胞壁形成,在食用菌子實(shí)體防御中發(fā)揮作用,如可以降解植物中的鞣質(zhì)等化合物,在含單寧和有毒植物抗毒素的環(huán)境下保護(hù)食用菌自身,避免植物自身化合物對(duì)菌體的毒害[44],食用菌栽培時(shí)添加漆酶制劑,能夠有效抑制雜菌污染。漆酶還與真菌的色素形成有關(guān),通過(guò)催化反應(yīng)參與分生孢子色素的合成。雖然漆酶與食用菌生長(zhǎng)正相關(guān),通過(guò)篩選食用菌漆酶高產(chǎn)菌株、基因工程技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體等可達(dá)到縮短食用菌生產(chǎn)周期、提高產(chǎn)量等效果,但目前食用菌生理功能及遺傳特性對(duì)其分泌漆酶水平的影響尚不明確。

2.5漆酶在食品檢測(cè)傳感器的應(yīng)用

漆酶作用底物廣泛、專一性強(qiáng),是制備生物傳感器的良好原料,根據(jù)漆酶對(duì)酚類物質(zhì)的催化作用可制備出靈敏且穩(wěn)定的傳感器用于食品在線檢測(cè)。Vianello用碳二胺化學(xué)共價(jià)固定漆酶,建立了漆酶和玻碳電極的在線檢測(cè)系統(tǒng),用于檢測(cè)橄欖油磨坊廢水中的多酚物質(zhì)含量[45]。Leite通過(guò)化學(xué)修飾,利用漆酶和過(guò)氧化物酶構(gòu)建了具有協(xié)同效應(yīng)的雙酶生物傳感器,可在線檢測(cè)兒茶酚胺[46]。Godoy-Navajas研究了一種利用漆酶與氧化鋱納米顆粒(Tb4O7NPs)結(jié)合的傳感器,能夠有效自動(dòng)測(cè)定葡萄酒中多酚的含量[21]。Gomes等人將漆酶固定在聚醚砜膜上構(gòu)建生物傳感器,通過(guò)測(cè)定漆酶對(duì)底物的氧化催化速率實(shí)現(xiàn)對(duì)多酚類化合物的檢測(cè)[47]。Dulce建立了以咖啡酸、沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物的漆酶生物傳感器對(duì)紅葡萄酒、桃紅葡萄酒、白葡萄酒中的多酚物質(zhì)含量進(jìn)行在線測(cè)定,發(fā)現(xiàn)三種葡萄酒中的多酚物質(zhì)含量由紅葡萄酒到白葡萄酒的順序依次減少,且咖啡酸比沒(méi)食子酸表現(xiàn)出更高的靈敏度[48]。Ribeiro等以金作為電極,電沉積納米金修飾的漆酶作為生物傳感器,對(duì)水果中的伐蟲脒進(jìn)行測(cè)量,現(xiàn)已成功應(yīng)用于芒果和葡萄中伐蟲脒的測(cè)定[26]。Tortolini等人發(fā)現(xiàn)改良漆酶多壁碳納米管電極傳感器測(cè)定葡萄酒多酚物質(zhì)具有最高性能的親和力和敏感點(diǎn),用沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物可以檢測(cè)商業(yè)白葡萄酒和紅葡萄酒[49]。漆酶生物傳感器受到穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較差、使用壽命短等因素制約,高效漆酶固定方法的使用、高催化性能材料的開發(fā)以及與微電子技術(shù)的聯(lián)用將會(huì)使漆酶生物傳感器在食品檢測(cè)方面發(fā)揮更重要的作用。

2.6漆酶在食品工業(yè)廢水處理的應(yīng)用

漆酶能去除廢水中的酚類、非酚類物質(zhì),降解有毒性的污染物,作用條件溫和,對(duì)環(huán)境不造成二次污染。食品廢水常含有高濃度有機(jī)酚類、小分子有機(jī)酸和鹽,是工農(nóng)業(yè)污染物的重要來(lái)源之一,危害植物生長(zhǎng),影響土壤微生物。Mann研究發(fā)現(xiàn)橄欖壓榨廢水中小分子有機(jī)物可以作為漆酶底物,或漆酶介體,通過(guò)漆酶氧化作用為微生物生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)的同時(shí)被除去[50]。Garcia-Zamora以殼聚糖為吸附劑,漆酶為催化劑組成廢水催化體系處理玉米粉工廠廢水,結(jié)果表明上述體系可以去除70%以上的阿魏酸及其衍生物,廢水COD降低78%以上[28]。Daassi等從腐爛的皂莢木中分離純化得到一種堿穩(wěn)定漆酶,以HBT為介體,用于處理橄欖油廠的廢水,酚類去除率和脫色率分別提高了39%和35.1%[30]。Ntougias等人從39種白腐真菌中篩選出Ganodermaaustral、G.carnosum、Pleurotuseryngii、P.ostreatus,4種對(duì)橄欖廢水中酚類物質(zhì)有很強(qiáng)降解能力的菌株,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)漆酶和過(guò)氧化酶協(xié)同作用可以顯著去除橄欖廢水的酚類物質(zhì),脫除顏色,降低廢水毒性。不同菌種對(duì)食品廢水脫色作用機(jī)理不完全相同,Ganoderma通過(guò)去除酚類物質(zhì)實(shí)現(xiàn)對(duì)橄欖廢水的脫色作用,而P.eryngii是在漆酶參與下完成廢水褪色[32]。目前漆酶應(yīng)用于食品工業(yè)廢水處理的瓶頸包括合成介體(如HBT、硅膠、氧化鋁)價(jià)格昂貴,漆酶工業(yè)產(chǎn)量低,漆酶-介體催化活性易受廢水極端pH、高離子強(qiáng)度、表面活性劑影響等。生物反應(yīng)器的研制是漆酶應(yīng)用于食品廢水處理的必要步驟,包括固定床反應(yīng)器,流化床反應(yīng)器,攪拌式反應(yīng)器和膜反應(yīng)器。流化床漆酶反應(yīng)器操作簡(jiǎn)單,但運(yùn)行成本高且易造成固定化酶破碎;膜反應(yīng)器易堵塞、影響處理效率。此外,上述生物反應(yīng)器仍處于實(shí)驗(yàn)室研制或中式階段,規(guī)模化應(yīng)用報(bào)道較少。

2.7漆酶在牛奶凝膠化的應(yīng)用

漆酶能使牛奶中的蛋白質(zhì)發(fā)生氧化交聯(lián),使牛奶凝膠化,改變牛奶品質(zhì),形成新的風(fēng)味。Mokoonlall研究了漆酶對(duì)酸奶和奶酪蛋白質(zhì)的氧化作用,結(jié)果表明漆酶可使酸奶凝膠化,孔隙增多,黏度和保質(zhì)期不受影響[31]。Qu認(rèn)為劑量是影響漆酶對(duì)牛奶氧化作用的重要因素,低劑量條件下漆酶可使蛋白發(fā)生有效交聯(lián),轉(zhuǎn)化為更高分子量的蛋白質(zhì)聚合物,蛋白質(zhì)流變學(xué)特性增強(qiáng);但高劑量漆酶會(huì)使蛋白質(zhì)發(fā)生降解,破壞牛奶品質(zhì)[32]。Struch研究認(rèn)為以咖啡酸為介體,漆酶使酸奶蛋白凝膠化,能有效避免加工過(guò)程中機(jī)械攪拌對(duì)酸奶質(zhì)地的破壞[51]。但目前漆酶對(duì)牛奶蛋白的氧化機(jī)理及過(guò)程尚不明確,氧化代謝產(chǎn)物及其安全性也有待于深入研究。

3　展望

漆酶以其反應(yīng)條件溫和,無(wú)毒副產(chǎn)物,作用范圍廣等優(yōu)越性引起越來(lái)越多的研究,隨著“綠色工業(yè),食品安全”等理念深入人心,漆酶將在食品領(lǐng)域發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。但部分漆酶為生物次級(jí)代謝產(chǎn)物,受菌株遺傳背景等因素限制,酶活力較低;產(chǎn)漆酶生物常含有多種氧化酶,分離純化步驟繁瑣;工業(yè)產(chǎn)量低,發(fā)酵周期長(zhǎng),生產(chǎn)成本高;催化機(jī)理及產(chǎn)物不明確;水溶性高,回收利用難;催化體系效率有待提高;介體或催化產(chǎn)物可能具有潛在毒性,作為食品添加劑使用受到限制。針對(duì)上述問(wèn)題,未來(lái)應(yīng)進(jìn)一步篩選漆酶高產(chǎn)菌株,利用基因工程技術(shù)構(gòu)建工程菌,優(yōu)化發(fā)酵條件,開發(fā)漆酶反應(yīng)器強(qiáng)化發(fā)酵過(guò)程,提高酶產(chǎn)量,降低生產(chǎn)成本;借鑒現(xiàn)代物理、化學(xué)分析手段,研究漆酶結(jié)構(gòu),闡明催化機(jī)理,解析催化過(guò)程;深入認(rèn)知自然界漆酶催化過(guò)程,篩選天然、綠色、無(wú)毒性介體;挖掘新型天然材料,開發(fā)固定化技術(shù),利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)提高酶的活力和穩(wěn)定性,提高利用率,降低催化成本;研究漆酶催化與光化學(xué)、電化學(xué)等的耦合技術(shù),探究協(xié)同作用機(jī)理,構(gòu)建新型、綠色、高效的催化體系;進(jìn)行漆酶毒理學(xué)評(píng)價(jià)及其作為食品添加劑的安全性研究,實(shí)現(xiàn)無(wú)殘留催化。

[1]Giardina P,Sannia G. Laccases:old enzymes with a promising future[J]. Cellular and Molecular Life Sciences,2015,72(5):855-856.

[2]W Du,C Sun,J Liang,et al. Improvement of Laccase Production and its Characterization by Mutagenesis[J]. Journal of Food Biochemistry,2015,39(1):101-108.

[3]K Chaurasia P,L Bharati S,Sharma M,et al. Fungal Laccases and their Biotechnological Significances in the Current Perspective:A Review[J]. Current Organic Chemistry,2015,19(19):1916-1934.

[4]李冠華,陳洪章. 汽爆秸稈漆酶協(xié)同作用提取木質(zhì)素[J].生物工程學(xué)報(bào),2014,30(6):911-919.

[5]賴超鳳,李爽,彭麗麗,等.漆酶及其在有機(jī)合成中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].化工進(jìn)展,2010(7):1300-1308.

[6]Leontievsky A,Myasoedova N,Pozdnyakova N,et al. ‘Yellow’ laccase of Panustigrinus oxidizes non-phenolic substrates without electron-transfer mediators[J]. FEBS Lletters,1997,413(3):446-448.

[7]Jones S M,Solomon E I. Electron transfer and reaction mechanism of laccases[J]. Cellular and Molecular Life Sciences,2015,72(5):869-883.

[8]Fabbrini M,Galli C,Gentili P. Comparing the catalytic efficiency of some mediators of laccase[J]. Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2002,16(5):231-240.

[9]Bourbonnais R,Paice M G. Oxidation of non-phenolic substrates[J]. FEBS letters,1990,267(1):99-102.

[10]Weirick T,Sahu S S,Mahalingam R,et al. LacSubPred:predicting subtypes of Laccases,an important lignin metabolism-related enzyme class,using in silico approaches[J]. BMC Bioinformatics,2014,15(11):S15.

[11]Gassara-Chatti F,Brar S K,Ajila C M,et al. Encapsulation of ligninolytic enzymes and its application in clarification of juice[J]. Food Chemistry,2013,137(1):18-24.

[12]de Souza Bezerra T M,Bassan J C,de Oliveira Santos V T,et al. Covalent immobilization of laccase in green coconut fiber and use in clarification of apple juice[J]. Process Biochemistry,2015,50(3):417-423.

[13]Lettera V,Pezzella C,Cicatiello P,et al. Efficient immobilization of a fungal laccase and its exploitation in fruit juice clarification[J]. Food Chemistry,2016,196:1272-1278.

[14]Zinnai A,Venturi F,Sanmartin C,et al. Chemical and Laccase catalysed oxidation of gallic acid:Determination of kinetic parameters[J]. Research Journal of Biotechnology,2013,8(7):62-65.

[15]Minussi R C,Rossi M,Bologna L,et al. Phenols removal in musts:strategy for wine stabilization by laccase[J]. Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2007,45(3):102-107.

[16]Martinez-Perian E,Hernández-Artiga M P,Palacios-Santander J M,et al. Estimation of beer stability by sulphur dioxide and polyphenol determination. Evaluation of a Laccase-Sonogel-Carbon biosensor[J]. Food Chemistry,2011,127(1):234-239.

[17]Conrad L S,Sponholz W R,Berker O. Treatment of cork with a phenol oxidizing enzyme:U.S. Patent 6,152,966[P]. 2000-11-28.

[18]Flander L,Holopainen U,Kruus K,et al. Effects of tyrosinase and laccase on oat proteins and quality parameters of gluten-free oat breads[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2011,59(15):8385-8390.

[19]Renzetti S,Courtin C M,Delcour J A,et al. Oxidative and proteolytic enzyme preparations as promising improvers for oat bread formulations:rheological,biochemical and microstructural background[J]. Food Chemistry,2010,119(4):1465-1473.

[20]Sun S J,Liu J Z,Hu K H,et al. The level of secreted laccase activity in the edible fungi and their growing cycles are closely related[J]. Current Microbiology,2011,62(3):871-875.

[21]Godoy-Navajas J,Aguilar-Caballos M P,Gómez-Hens A. Automatic determination of polyphenols in wines using laccase and terbium oxide nanoparticles[J]. Food Chemistry,2015,166:29-34.

[22]García-Guzmán J J,Hernández-Artiga M P,de León L P P,et al. Selective methods for polyphenols and sulphur dioxide determination in wines[J]. Food Chemistry,2015,182:47-54.

[23]Aguila S A,Shimomoto D,Ipinza F,et al. A biosensor based on Coriolopsisgallica laccase immobilized on nitrogen-doped multiwalled carbon nanotubes and graphene oxide for polyphenol detection[J]. Science and Technology of Advanced Materials,2015,16(5):1-8.

[24]Lanzellotto C,Favero G,Antonelli M L,et al. Nanostructured enzymatic biosensor based on fullerene and gold nanoparticles:Preparation,characterization and analytical applications[J]. Biosensors and Bioelectronics,2014,55:430-437.

[25]Chawla S,Rawal R,Kumar D,et al. Amperometric determination of total phenolic content in wine by laccase immobilized onto silver nanoparticles/zinc oxide nanoparticles modified gold electrode[J]. Analytical Biochemistry,2012,430(1):16-23.

[26]Ribeiro F W P,Barroso M F,Morais S,et al. Simple laccase-based biosensor for formetanate hydrochloride quantification in fruits[J]. Bioelectrochemistry,2014,95:7-14.

[27]Andreu-Navarro A,Fernández-Romero J M,Gómez-Hens A. Determination of polyphenolic content in beverages using laccase,gold nanoparticles and long wavelength fluorimetry[J]. Analytica Chimica Acta,2012,713:1-6.

[28]García-Zamora J L,Sánchez-González M,Lozano J A,et al. Enzymatic treatment of wastewater from the corn tortilla industry using chitosan as an adsorbent reduces the chemical oxygen demand and ferulic acid content[J]. Process Biochemistry,2015,50(1):125-133.

[29]Ntougias S,Baldrian P,Ehaliotis C,et al. Olive mill wastewater biodegradation potential of white-rot fungi-Mode of action of fungal culture extracts and effects of ligninolytic enzymes[J]. Bioresource Technology,2015,189:121-130.

[30]Daassi D,Zouari-Mechichi H,Prieto A,et al. Purification and biochemical characterization of a new alkali-stable laccase from Trametes sp. isolated in Tunisia:role of the enzyme in olive mill waste water treatment[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology,2013,29(11):2145-2155.

[31]Mokoonlall A,Pfannstiel J,Struch M,et al. Structure modification of stirred fermented milk gel due to laccase-catalysed protein crosslinking in a post-processing step[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies,2015,33:563-570.

[32]Qu J,Lou T,Wang Y,et al. Determination of Catechol by a Novel Laccase Biosensor Based on Zinc-Oxide Sol-Gel[J]. Analytical Letters,2015,48(12):1842-1853.

[33]Bagci P O. Effective clarification of pomegranate juice:A comparative study of pretreatment methods and their influence on ultrafiltration flux[J]. Journal of Food Engineering,2014,141:58-64.

[34]Kumar S. Role of enzymes in fruit juice processing and its quality enhancement[J]. Health,2015,6(6):114-124.

[35]Czyzowska A,Klewicka E,Pogorzelski E,et al. Polyphenols,vitamin C and antioxidant activity in wines from Rosa canina L. and Rosa rugosaThunb[J]. Journal of Food Composition and Analysis,2015,39:62-68.

[36]Pezzella C,Guarino L,Piscitelli A. How to enjoy laccases[J]. Cellular and Molecular Life Sciences,2015,72(5):923-940.

[37]Labat E,Morel M H,Rouau X. Effects of Laccase and Ferulic Acid on Wheat Flour Doughs 1[J]. Cereal Chemistry,2000,77(6):823-828.

[38]Selinheimo E,Kruus K,Buchert J,et al. Effects of laccase,xylanase and their combination on the rheological properties of wheat doughs[J]. Journal of Cereal Science,2006,43(2):152-159.

[39]Cura D E,Lantto R,Lille M,et al. Laccase-aided protein modification:effects on the structural properties of acidified sodium caseinate gels[J]. International Dairy Journal,2009,19(12):737-745.

[40]Brinch D S,Pedersen P B. Toxicological studies on Laccase from Myceliophthorathermophila expressed in Aspergillus oryzae[J]. Regulatory Toxicology and Pharmacology,2002,35(3):296-307.

[41]Marques de Souza C G,Peralta R M. Purification and characterization of the main laccase produced by the white-rot fungus Pleurotuspulmonarius on wheat bran solid state medium[J]. Journal of Basic Microbiology,2003,43(4):278-286.

[42]Montoya S,Orrego C E,Levin L. Growth,fruiting and lignocellulolytic enzyme production by the edible mushroom Grifolafrondosa(maitake)[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology,2012,28(4):1533-1541.

[43]Munk L,Sitarz A K,Kalyani D C,et al. Can laccases catalyze bond cleavage in lignin?[J]. Biotechnology Advances,2015,33(1):13-24.

[44]Baldrian P. Fungal laccases-occurrence and properties[J]. FEMS Microbiology Reviews,2006,30(2):215-242.

[45]Vianello F,Cambria A,Ragusa S,et al. A high sensitivity amperometric biosensor using a monomolecular layer of laccase as biorecognition element[J].Biosensors and Bioelectronics,2004,20(2):315-321.

[46]Leite O D,Lupetti K O,Fatibello-Filho O,et al. Synergic effect studies of the bi-enzymatic system laccase-peroxidase in a voltammetric biosensor for catecholamines[J]. Talanta,2003,59(5):889-896.

[47]Gomes S,Rebelo M J F. A new laccase biosensor for polyphenols determination[J]. Sensors,2003,3(6):166-175.

[48]Gil D M A,Rebelo M J F. Evaluating the antioxidant capacity of wines:a laccase-based biosensor approach[J]. European Food Research and Technology,2010,231(2):303-308.

[49]Tortolini C,Di Fusco M,Frasconi M,et al. Laccase-polyazetidineprepolymer-MWCNT integrated system:Biochemical properties and application to analytical determinations in real samples[J]. Microchemical Journal,2010,96(2):301-307.

[50]Mann J,Markham J L,Peiris P,et al. Use of olive mill wastewater as a suitable substrate for the production of laccase by Cerrenaconsors[J]. International Biodeterioration& Biodegradation,2015,99:138-145.

[51]Struch M,Linke D,Mokoonlall A,et al. Laccase-catalysed cross-linking of a yoghurt-like model system made from skimmed milk with added food-grade mediators[J]. International Dairy Journal,2015,49:89-94.

Research progress in applications of laccase in food

ZHANG Yu,ZHAO Qian,LI Guan-hua*

(School of life science,Inner Mongolia University,Hohhot 010021,China)

Application of laccase in food is drawing more and more attention.In this paper,catalytic characteristic,the findings of laccase used in beverage procession,wine making,flour modification,edible fungi production,food online detecting,food wastewater treatment and milk gelation were reviewed in detailed.At last the prospects of laccase in food were also put forward.

laccase;food;application;catalyze

2016-03-23

張昱(1994-)，男，在讀本科生，研究方向：食品科學(xué)與工程，E-mail：18848119746@163.com。

李冠華(1984-)，男，博士，講師，研究方向：漆酶發(fā)酵，漆酶催化體系構(gòu)建，E-mail：liguamhua1984@126.com。

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015BS0201)；內(nèi)蒙古大學(xué)2014年博士引進(jìn)科研啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)(21400-5145138)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)17-0385-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.068