響應(yīng)面法優(yōu)化大鯢魚油水酶法提取工藝

白鑫華,羅　秦,青　維,冉　旭

(四川大學(xué) 輕紡與食品學(xué)院,四川成都 610065)

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響應(yīng)面法優(yōu)化大鯢魚油水酶法提取工藝

白鑫華,羅秦,青維,冉旭*

(四川大學(xué) 輕紡與食品學(xué)院,四川成都 610065)

通過單因素實(shí)驗(yàn)考察中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對大鯢油提取率的影響,確定木瓜蛋白酶為實(shí)驗(yàn)用酶;采用中心組合實(shí)驗(yàn)(CCD)對酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化,確定酶解的最適工藝條件為:料液比為1∶1(w/w),酶添加量為6800 U/g,pH5.8,酶解溫度為50 ℃,酶解時(shí)間為130 min,在優(yōu)化條件下大鯢油提取率為93.52%。對水酶法提取的大鯢油進(jìn)行理化、感官分析,結(jié)果表明粗制大鯢油產(chǎn)品質(zhì)量達(dá)到SC/T3502-2000二級粗魚油指標(biāo)要求。

大鯢油,水酶法,脂肪酸

大鯢(Andriasdavidianus)屬兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科[1-2],因其叫聲與嬰兒哭聲相似,故又稱 “娃娃魚”。大鯢營養(yǎng)豐富,是一種食用價(jià)值極高的動物,李時(shí)珍在《本草綱目》中有記載:“山海經(jīng)云:決水有魚,狀如衟,食之已癡疾,性甘淡,能截瘧。[3]”黃世英[4]、劉紹[5]、李林強(qiáng)[6]等人對大鯢肌肉脂肪酸檢測結(jié)果表明,大鯢肌肉脂肪中含有13種脂肪酸,不飽和脂肪酸含量達(dá)到75.91%,多不飽和脂肪酸含量為29.22%,其中DHA的含量是甲魚的31倍多[7]。目前魚油的生產(chǎn)工藝主要包括蒸煮、壓榨、稀堿水解、酶解、溶劑萃取和超臨界流體萃取幾種方法。水酶法作為一種新的提油技術(shù),利用蛋白酶對蛋白質(zhì)的水解作用,對脂肪細(xì)胞外由磷脂和蛋白質(zhì)結(jié)合形成蛋白膜進(jìn)行破壞,使油脂釋放出來,酶解過程條件溫和(50 ℃左右),可有效保護(hù)油脂中的功效成分不被高溫破壞,提油率高且無有機(jī)溶劑殘留,酶解后的物質(zhì)還可進(jìn)一步加工用于食品或飼料工業(yè),工藝操作簡單,生產(chǎn)安全性高,是一種低投資,無污染的生產(chǎn)技術(shù)[9-10]。本研究以大鯢脂肪組織為主要原料,采用水酶法提取大鯢油,以提取率為主要評價(jià)指標(biāo),采用單因素與中心組合實(shí)驗(yàn)對大鯢油的提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,同時(shí)對水酶法提取的大鯢油進(jìn)行評價(jià)分析,以期為大鯢油的工業(yè)化生產(chǎn)及深加工提供一定參考。

1　材料與方法

1.1材料與設(shè)備

大鯢四川溪源水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司;胰蛋白酶:0.025萬U/g、胃蛋白酶:0.3萬U/g、中性蛋白酶:5萬U/g、木瓜蛋白酶:10萬U/g、風(fēng)味蛋白酶:1.5萬U/g食品級,江蘇銳陽生物科技有限公司。其它試劑均為分析純。

JA1203型電子天平上海精科天平廠;酸度計(jì)pHS-3C成都世紀(jì)方舟科技有限公司;組織搗碎機(jī)金壇市富華儀器有限公司;721型分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋國華電器有限公司;恒溫振蕩水浴鍋金壇市富華儀器有限公司;TDL-40B臺式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠;QP2010Plus氣-質(zhì)聯(lián)用儀日本島津公司。

表1　中心組合實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1大鯢油脂理化指標(biāo)及提取率計(jì)算酸值:參照GB/T5530-2005《動植物油脂酸值和酸度測定》;過氧化值:參照GB/T5538-2005《動植物油脂過氧化值測定》;碘值:參照GB/T5532-2008《動植物油脂碘值的測定》;水分:參照GB/T5528-2008《植物油脂水分及揮發(fā)物含量測定法》。

1.2.2水酶法提取大鯢油工藝流程大鯢脂肪組織→清洗、切塊→加水打漿→調(diào)節(jié)pH→加酶酶解→沸水浴滅酶15 min→4000 r/min離心20 min→粗大鯢油

提取率(%)=A×100/(B×C)

式中,A為離心提取的大鯢油的質(zhì)量,g;B為原料脂肪的質(zhì)量,g;C為原料脂肪中粗脂肪的百分含量,%。

1.2.3大鯢油脂肪酸組成分析GC-MS分析設(shè)備:采用日本島津QP2010Plus氣-質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行分析。GC條件:Rxi-5 ms氣相毛細(xì)管色譜柱(柱長:30 m,內(nèi)柱徑:0.25 μm,外柱徑:0.25 mm);程序升溫:起始溫度50 ℃,停留5 min,以10 ℃/min升至160 ℃,保留2 min;再以5 ℃/min升至200 ℃,保留5 min;以2 ℃/min升至260 ℃,保留10 min;最后以5 ℃/min升至300 ℃,保留10 min;進(jìn)樣溫度280.00 ℃;壓力53.5 kPa;總流量9.0 mL/min;柱流量1.00 mL/min;線速度36.3 cm/sec;吹掃流量3.0 mL/min;分流比5.0∶1;進(jìn)樣量1 μL;溶劑延遲時(shí)間3 min。MS條件:EI離子源;離子源溫度200 ℃;接口溫度220 ℃;掃描質(zhì)量數(shù)范圍22.00～700.00 u。

1.2.4粗大鯢魚油提取單因素室驗(yàn)先篩選蛋白酶,再采用1.2.1下法提取魚油,提取條件為:固定酶添加量5000 U/g,酶解溫度50 ℃,pH7.0,酶解時(shí)間240 min,考察不同料液比(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4)對提取率的影響;固定料液比為1∶1,酶解溫度50 ℃,pH7.0,酶解時(shí)間240 min,考察蛋白酶添加量(0、1000、3000、5000、7000、9000 U/g)對提取率的影響;固定料液比為1∶1,酶添加量5000 U/g,pH7.0,酶解時(shí)間240 min,考察不同溫度(40、45、50、55、60、65 ℃)對提取率的影響;固定料液比為1∶1,酶解溫度50 ℃,酶添加量5000 U/g,酶解時(shí)間240 min,考察pH(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)對提取率的影響;固定料液比為1∶1,酶解溫度50 ℃,酶添加量5000 U/g,pH7.0,考察酶解時(shí)間(0、60、120、180、240、300 min)對提取率的影響。進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),考察各因素變量對魚油得率的影響。

1.2.5中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)固定料液比為1∶1,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇酶添加量、酶解溫度、酶解pH、酶解時(shí)間4個(gè)主要因素,以大鯢油提取率為指標(biāo),采用中心組合實(shí)驗(yàn)(CCD)對水酶法提取大鯢油的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,中心組合實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1蛋白酶種類篩選參考張偉偉[11]、劉沙[12]、楊小克[13]的研究成果,初步選取中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶5種蛋白酶,以大鯢油提取率為指標(biāo)選取實(shí)驗(yàn)用酶。各蛋白酶的酶解條件見表2。

表2　不同種類蛋白酶的水解條件

由圖1可知提取率最高的為木瓜蛋白酶90.43%。選擇木瓜蛋白酶作為大鯢油提取的實(shí)驗(yàn)用酶。

圖1　不同種類蛋白酶對大鯢油提取率的影響Fig.1　Effects of different enzymes on extraction rate of andrias davidianus oil

2.1.2料液比對大鯢油提取率的影響由圖2可以看出,反應(yīng)體系中底物濃度的增大或減小都會影響水解反應(yīng)的進(jìn)行。當(dāng)料液比大于1∶1時(shí),離心后的殘夜中有塊狀物,表明底物并未酶解完全,且離心過程中油層和水層不能很好的分離;當(dāng)料液比為1∶1時(shí),大鯢油提取率達(dá)到最大值89.55%,隨著料液比減小,提取率下降,因此,本實(shí)驗(yàn)將料液比為固定為1∶1。

圖2　料液比對大鯢油提取率的影響Fig.2　Effects of solid-liquid ratio on extraction rate of andrias davidianus oil

2.1.3酶添加量對大鯢油提取率的影響由圖3可知,添加蛋白酶可明顯提高大鯢油的提取率,隨著酶添加量的增加,提取率也隨之增大,當(dāng)酶添加量為7000 U/g時(shí),提取率達(dá)到89.13%,繼續(xù)增加酶量,大鯢油提取率趨于平緩,這可能是因?yàn)殡S著酶添加量的增大,酶與底物結(jié)合形成的絡(luò)合物對酶形成了反饋抑制,造成反應(yīng)速率下降,因此結(jié)合實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)及成本考慮,選擇木瓜蛋白酶的酶添加量范圍5000～9000 U/g。

圖3　酶添加量對大鯢油提取率的影響Fig.3　Effects of enzyme dosage on extraction rate of andrias davidianus oil

圖4　酶解溫度對大鯢油提取率的影響Fig.4　Effects of temperature on extraction rate of andrias davidianus oil

2.1.4酶解溫度對大鯢油提取率的影響由圖4可以看出,隨著酶解溫度增大,大鯢油提取率呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢,當(dāng)溫度為55 ℃時(shí),提取率達(dá)到最大值89.33%,進(jìn)一步增大酶解溫度,提取率表現(xiàn)下降的趨勢。這可能是因?yàn)槊附鉁囟鹊脑黾涌商岣呙概c底物間的相互作用,酶解反應(yīng)較完全;而隨著溫度的繼續(xù)升高至甚至超過酶活所容許的最適溫度時(shí),酶蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而引起酶的失活效應(yīng),進(jìn)而降低了酶解效率使得提取率下降[14]。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇酶解的溫度范圍45～55 ℃。

2.1.5酶解pH對大鯢油提取率的影響由圖5可知,隨著pH的增大,酶解提取率呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢,當(dāng)酶解pH為6.0時(shí),提取率達(dá)到最大值91.29%;當(dāng)酶解pH為5.5～7.0的范圍內(nèi)時(shí),pH對酶活影響較小,酶解反應(yīng)較完全;當(dāng)pH增大至8.0時(shí),pH的變化改變了木瓜蛋白酶離子基團(tuán)的離解狀態(tài),酶的穩(wěn)定性被破壞,因此阻礙了酶解反應(yīng)的進(jìn)行,從而導(dǎo)致酶解提取率的下降。因此,選擇pH范圍5.5～6.5。

圖5　酶解pH對大鯢油提取率的影響Fig.5　Effects of pH on extraction rate of andrias davidianus oil

2.1.6酶解時(shí)間對大鯢油提取率的影響由圖6可以看出,隨著酶解時(shí)間的增加,大鯢油的提取率有了明顯提高,當(dāng)酶解時(shí)間為120 min時(shí),提取率達(dá)到最大值89.16%,再繼續(xù)增大酶解時(shí)間,提取率趨于平緩,因此,選擇大鯢油的最佳酶解時(shí)間范圍90～ 150 min。

圖6　酶解時(shí)間對大鯢油提取率的影響Fig.6　Effects of enzymolysis time on extraction rate of andrias davidianus oil

2.2水酶法提取大鯢油工藝優(yōu)化

在固定料液比為1∶1的基礎(chǔ)上,選擇酶添加量、酶解溫度、酶解pH、酶解時(shí)間為實(shí)驗(yàn)因子,以提取率為指標(biāo),采用中心組合實(shí)驗(yàn)(CCD)對大鯢油的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3　中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

以大鯢油提取率為固定變量(Y),酶添加量(X1)、pH(X2)、酶解溫度(X3)、酶解時(shí)間(X4)為自變量,采用Design-Expert軟件對實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,建立大鯢油提取率與酶添加量、pH、酶解溫度、酶解時(shí)間4因素的多元二次響應(yīng)面回歸模型:

Y=-777.43973+0.012195X1+178.73550X2+9.66742X3+0.95706X4+3.125×10-4X1X2-8.125×10-5X1X3-6.70833×10-6X1X4-0.53X2X3-0.063667X2X4+3.91667×10-3X3X4-6.62646×10-7X12-12.47223X22-0.064173X32-2.86037×10-3X42

對該模型進(jìn)行方差分析,其結(jié)果見表4。

由表6可以看出,自變量一次項(xiàng)pH(X2),酶解時(shí)間(X4),交互項(xiàng)的pH和酶解溫度X2X3,酶解溫度(X32)顯著,酶添加量(X12),pH(X22),酶解時(shí)間(X42)極顯著,該模型極顯著(p<0.0001),失擬不顯著(p=0.3180>0.05),決定系數(shù)為0.9115,表明該模型只有8.85%的變異,91.15%的響應(yīng)值能由該模型解釋,說明該模型的擬合程度較高,實(shí)驗(yàn)誤差小,因此可以用此模型來預(yù)測和分析水酶法提取大鯢油的結(jié)果。

響應(yīng)面圖的形狀可反映出酶添加量(X1)、pH(X2)、酶解溫度(X3)和酶解時(shí)間(X4)各因素交互效應(yīng)的強(qiáng)弱,橢圓形表示兩因素交互作用顯著,而圓形則與之相反。由圖7、圖9、圖10等高線的形狀可知,兩因素軸向等高線密度變化相差不大,因此X1X2、X1X4、X2X4的交互作用不顯著;圖8中,等高線形狀近似圓形,因此X1X3的交互作用不顯著;圖11中X4對提取率的影響顯著,曲面較陡,X3對提取率的影響相對不顯著,曲面較緩和;圖12中,X2X3交互作用強(qiáng),沿X2軸向等高線密集,X3軸向等高線相對稀疏,說明X2對響應(yīng)值峰值的影響比X3大。

圖7　酶添加量與pH的交互作用Fig.7　The interaction for enzyme dosage and pH

圖8　酶添加量與酶解溫度的交互作用Fig.8　The interaction for enzyme dosageand enzymolysis temprature

圖9　酶添加量與酶解時(shí)間的交互作用Fig.9　The interaction for enzyme dosage and enzymolysis time

通過Design-Expert軟件分析得到水酶法提取大鯢油的最佳工藝條件為:酶添加量6808.11 U/g,pH5.84,酶解溫度50.83 ℃,酶解時(shí)間129.12 min,大鯢油的提取率為93.57%。為方便實(shí)驗(yàn),使酶添加量為6800 U/g,pH5.8,酶解溫度50 ℃,酶解時(shí)間130 min,經(jīng)3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到,大鯢油的提取率平均值為93.52%,與模型預(yù)測值基本一致,由此表明該模型是可靠的。

表4　回歸模型系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)

圖10　pH與酶解時(shí)間的交互作用Fig.10　The interaction for pH and enzymolysis time

圖11　酶解溫度與酶解時(shí)間的交互作用Fig.11　The interaction for enzymolysis temprature and time

圖12　pH與酶解溫度的交互作用Fig.12　The interaction for pH and enzymolysis temprature

注:**表示極顯著(p<0.01);*表示顯著(p<0.05)。2.3水酶法提取粗大鯢油品質(zhì)及脂肪酸分析

2.3.1粗制大鯢油理化及感官分析評價(jià)對水酶法提取的粗制大鯢油進(jìn)行理化及感官分析評價(jià),結(jié)果見表5、表6所示。

表5　粗大鯢油主要理化指標(biāo)

表6　粗大鯢油的感官指標(biāo)

從表5理化檢測結(jié)果來看,水酶法提取的大鯢油水分和過氧化值大于SC/T 3502-2000中華人民共和國農(nóng)業(yè)部漁業(yè)局提出的《魚油》一級粗魚油標(biāo)準(zhǔn);表6感官評價(jià)中,水酶法提取的粗制大鯢油呈黃色、稍有渾濁,但無明顯的分層現(xiàn)象,無明顯雜質(zhì),腥味較大,無酸敗味,總體上粗制大鯢油的品質(zhì)達(dá)到了SC/T 3502-2000粗魚油的二級標(biāo)準(zhǔn)。

2.3.2脂肪酸組成分析由表7可以看出,水酶法提取粗制大鯢油中共檢測出25種脂肪酸,都由C11～C22脂肪酸組成,與海產(chǎn)動物油(海豹油、深海魚油)以及植物油[15]中的花生油進(jìn)行脂肪酸比較,大鯢油中油酸及亞油酸的含量要明顯高于深海魚油及海豹油,低于花生油；DHA及EPA含量低于深海魚油及海豹油?？傮w比較,大鯢油不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例與深海魚油的組成極為接近,前者為2.72∶1,后者為2.70∶1。

表7　水酶法提取大鯢油脂肪酸組成及相對含量

綜上所述,大鯢油既具備海產(chǎn)動物油脂中不飽和脂肪酸含量較高的優(yōu)點(diǎn),又含有植物油脂中常見的油酸與亞油酸,因此其脂肪酸組成是比較理想的。

3　結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和中心組合實(shí)驗(yàn)(CCD)對水酶法提取大鯢油的工藝進(jìn)行了優(yōu)化,得到優(yōu)化工藝參數(shù)為:料液比1∶1(w/w),木瓜蛋白酶添加量6800 U/g,pH5.8,酶解溫度50 ℃,酶解時(shí)間130 min,在此條件下,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所得大鯢油的提取率為93.52%。

水酶法提取的粗制大鯢油外觀呈黃色,稍混濁,但無明顯分層,帶有特殊的魚腥味,無酸敗味,理化指標(biāo)分析結(jié)果表明粗制大鯢油達(dá)到SC/T3502-2000二級粗魚油標(biāo)準(zhǔn)。水酶法提取大鯢油GC-MS分析共檢出25種脂肪酸成分,飽和脂肪酸所占比例為25.32%,不飽和脂肪酸為68.79%,其中單不飽和脂肪酸為43.17%,多不飽和脂肪酸為25.62%。大鯢油中不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例為2.72∶1,與深海魚油的組成比例極為接近,ω-6/ω-3的比值為3.75∶1,這一結(jié)果略低于我國多不飽和脂肪酸4～6∶1的推薦值。大鯢油既具備海產(chǎn)動物油脂中不飽和脂肪酸含量較高的優(yōu)點(diǎn),又含有植物油脂中常見的油酸與亞油酸,因此其脂肪酸組成是比較理想的。

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Optimization of extraction ofAndriasdavidianusoil by aqueous enzymes using response surface methodology

BAI Xin-hua,LUO Qin,QING Wei,RAN Xu*

(College of Light Industry,Textile and Food Engineering,Sichuan University,Chengdu 610065,China)

The effect of enzymes(neutral protease,papain,pepsin,trypsin and flavourzyme)on extraction rate ofAndriasdavidianusoil were studied by the single factor experiment,and papain was selected to be the enzyme for the experiment. Central composite design(CCD)were used to optimize the condition of aqueous enzymatic process. The optimal conditions were as follows:solid-to-liquid ration of 1∶1(w/w),papain added dosage of 6800 U/g,pH5.8,hydrolysis temperature of 50 ℃,and hydrolysis time of 130 min,and under such condition the extraction rate was 93.52%. Chemical and sensory evaluation results showed that the crudeAndriasdavidianusoil extracted by aqueous enzymatic conformed to the secondary standards crude fish oil of SC/T 3502-2000.

Andriasdavidianusoil;aqueous enzymatic;fatty acid

2016-03-18

白鑫華(1993-),男,碩士研究生,研究方向:食品工程,E-mail:18328008864@163.com。

冉旭(1966-),男,博士,副教授,研究方向:農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏,E-mail:ranxu01@sina.com。

TS222+.3

B

1002-0306(2016)17-0247-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.040