食源性金黃色葡萄球菌粘附素基因的檢測及蛋白酶K和DNaseⅠ對菌株被膜形成的影響

馬伊薩蘭,余博旸,陳　娟,劉　驥,唐俊妮,*

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川成都 610041;2.成都七中,四川成都 610041)

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食源性金黃色葡萄球菌粘附素基因的檢測及蛋白酶K和DNaseⅠ對菌株被膜形成的影響

馬伊薩蘭1,余博旸2,陳娟1,劉驥1,唐俊妮1,*

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川成都 610041;2.成都七中,四川成都 610041)

本研究以實驗室保存的17株金黃色葡萄球菌食品分離菌株為研究對象,通過提取細(xì)菌DNA,采用PCR檢測14種粘附素基因的分布情況,隨后采用試管法和微孔板法對細(xì)菌成膜能力進(jìn)行檢測,進(jìn)一步研究蛋白酶K和DNase Ⅰ對生物被膜形成能力的影響。結(jié)果表明:17株菌株均攜帶clfB基因,檢出率為100%,均不攜帶bap,bbp和clfA基因,有13株菌擴(kuò)增出icaBC基因(76.5%),12株均擴(kuò)增出cna基因(70.6%),11株菌擴(kuò)增出eno基因(64.7%),10株菌分別擴(kuò)增出fib和icaAD基因(58.8%),9株菌擴(kuò)增出fnbA基因(52.9%),4株菌分別擴(kuò)增出sasC,sasG和ebpS基因(23.5%),2株菌擴(kuò)增出fnbB基因(11.8%)。試管法和微孔板法觀察到17株菌株均有生物被膜形成,但不同菌株的被膜形成能力有差異,10號和30號菌株被膜形成能力顯著強(qiáng)于其它15株菌(p<0.05)。在細(xì)菌生長過程中,蛋白酶K、DNase Ⅰ以及兩種酶的聯(lián)合處理發(fā)現(xiàn)蛋白酶K和DNase Ⅰ處理組細(xì)菌生物被膜形成能力明顯低于對照未處理組(p<0.05),并且蛋白酶K對金黃色葡萄球菌生物被膜形成的抑制效果比DNase Ⅰ好,但是兩種酶聯(lián)合處理效果與對照組差異不顯著(p>0.05)。本研究旨在為食源性金黃色葡萄球菌生物被膜的形成與控制策略提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

食源性金黃色葡萄球菌,生物被膜形成,粘附素相關(guān)基因,蛋白酶K,DNaseⅠ

細(xì)菌生物被膜是細(xì)菌細(xì)胞大量附著在固體和活的生物體表面形成的三維結(jié)構(gòu)聚合物[1]。經(jīng)常引起醫(yī)院感染和食物中毒的金黃色葡萄球菌具有形成生物被膜的能力,研究表明金黃色葡萄球菌生物被膜結(jié)構(gòu)復(fù)雜,主要是由β-1,6-聚-N-乙酰葡萄糖胺(PNAG)或黏附多糖(PIA)[2]、胞外DNA[3-4]、胞外蛋白質(zhì)、細(xì)胞壁磷壁酸[5]、脂質(zhì)[6]和其它環(huán)境中的物質(zhì)等一系列復(fù)雜生物大分子包裹細(xì)菌細(xì)胞聚集而成。作為病原菌,金黃色葡萄球菌通常通過能夠粘附到生物材料表面(如細(xì)胞外基質(zhì)組成成分或者宿主組織),或者非生物材料表面(如醫(yī)療器械裝置等),一旦粘附上去細(xì)菌就開始增殖擴(kuò)散,并且通過形成生物被膜的方式定植在生物材料或非生物材料表面[7]。生物被膜的形成有助于增加細(xì)菌抵御抗生素和逃脫寄主免疫攻擊的能力造成持續(xù)性感染和疾病的難以治療,也增加了食品加工過程的污染頻率[8]。目前的研究認(rèn)為,在金黃色葡萄球菌生物被膜的形成過程中,一些菌株依賴于細(xì)胞分泌的胞外粘附多糖(PIA/PNAG)形成生物被膜,這種類型主要是由icaADBC操縱基因編碼產(chǎn)物進(jìn)行調(diào)控[9]。還有一些菌株不依賴于PIA/PNAG進(jìn)行粘附,這類金黃色葡萄球菌生物被膜的形成主要是通過粘附基質(zhì)分子(粘附基質(zhì)分子是一類具有保守結(jié)構(gòu)和功能特征相似,在生物膜形成和發(fā)展中起著重要作用的細(xì)胞表面錨定蛋白以及胞外分泌蛋白的總稱[10])的共價結(jié)合而引起細(xì)胞相互聚集。金黃色葡萄球菌全基因組中大約含有幾十個編碼表面錨定粘附基質(zhì)分子的相關(guān)基因[11-15]。如由fnbPA,fnbPB,bap,sasC和sasG基因編碼的表面粘附因子FnBPA和FnBPB[11],Bap[12],SasC和SasG[13-14]等在金黃色葡萄球菌生物被膜形成作用已被證實。另外,Atshan等[15]還發(fā)現(xiàn)另一些金黃色葡萄球菌菌株是由其自身分泌的基質(zhì)粘附分子與宿主細(xì)胞的配體分子相互作用而進(jìn)行粘附,這些基質(zhì)粘附分子包括彈力蛋白結(jié)合蛋白EbpS,層粘連蛋白結(jié)合蛋白Eno,膠原結(jié)合蛋白Cna,纖維蛋白原結(jié)合蛋白Fib,纖維蛋白原結(jié)合蛋白ClfA和ClfB,骨唾液酸蛋白結(jié)合蛋白Bbp等,它們分別由ebpS,eno,cna,fib,clfA,clfB和bbp基因進(jìn)行編碼。這些研究反映了金黃色葡萄球菌粘附基質(zhì)分子在介導(dǎo)粘附和生物被膜形成發(fā)展中的重要性。

針對細(xì)菌生物被膜形成帶來的危害,學(xué)者們也在不斷探索抑制細(xì)菌生物被膜形成的方法,目前這方面的研究主要集中在消殺劑及酶對生物被膜形成的影響[16-18]。為了進(jìn)一步了解食源性金黃色葡萄球菌生物被膜形成以及相關(guān)粘附素基因的分布,本文以實驗室保存的17株食品分離菌株為研究對象,探索不同粘附素相關(guān)基因bap,bbp,cna,clfA,clfB,ebpS,eno,fib,fnbPA,fnbPB,sasC,sasG,以及icaAD和icaBC基因在食源性菌株中的攜帶情況,同時,研究蛋白酶K和DNAaseⅠ對食源性金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響,旨在為食源性金黃色葡萄球菌生物被膜的形成與控制策略提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌株來源:實驗室保存的17株經(jīng)分離鑒定的食品源金黃色葡萄球菌(17株菌株中均未檢測出傳統(tǒng)腸毒素基因型sea-see,其中3,14,23,26,30號菌株檢測出sek基因,47,48,49,57,67號菌株檢測出sei基因)。胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)、Baird-Parker(BP)瓊脂基礎(chǔ)青島海博生物技術(shù)有限公司;酵母提取物、胰化蛋白胨英國OXOID公司;蛋白酶K(10 mg/mL)、DNase1(1 mg/mL)大連寶生生物工程有限公司;分析純的草酸銨、甲醇、冰乙酸成都市科龍化工試劑廠;結(jié)晶紫Amresco公司。

Eppendorf 5804R型冷凍離心機(jī)Eppendorf中國有限公司;Bio-Rad PTC-200 PCR儀購自Bio-Rad公司;Elx808酶標(biāo)儀日本BIO-TEK公司;DYY-6C型電泳儀北京六一儀器廠;DL-720E智能超聲波振清洗器上海之信儀器有限公司;GHP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱上海齊欣科學(xué)儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1金黃色葡萄球菌DNA提取將17株實驗室保存的金黃色葡萄球菌食品分離菌株按照1%的比例接種于TSB培養(yǎng)基中,37 ℃,轉(zhuǎn)速150 r/min培養(yǎng)18 h。取1 mL菌懸液4 ℃條件下12000 r/min離心2 min后,收集菌體,提取細(xì)菌DNA方法參考我們之前發(fā)表的文獻(xiàn)[19]進(jìn)行,提取好的樣本DNA于-20 ℃保存,用于后續(xù)基因檢測。

1.2.2金黃色葡萄球菌生物被膜形成相關(guān)基因檢測生物被膜形成相關(guān)基因的引物參考文獻(xiàn)[20],由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR的反應(yīng)體系:10×PCR buffer(Mg2+free)2 μL,25 mmol/L MgC121.6 μL,dNTPs(1.0 mmol/L)1.2 μL,Taq DNA聚合酶(5 unit/μL)0.3 μL,20 μmol/L的上下游引物各0.5 μL,模板1 μL,無菌超純水補(bǔ)足20 μL體系。PCR擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性5 min,再按95 ℃變性40 s,退火50 s(各基因退火溫度見參考文獻(xiàn)[20]),72 ℃延伸40 s,進(jìn)行35個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測:配置1%瓊脂糖凝膠,取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上樣,80 V電泳45 min,凝膠成像系統(tǒng)觀察與儲存電泳圖片。每一種基因的PCR陽性產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行測序和比對,以保證每對引物擴(kuò)增產(chǎn)物的真實性。

1.2.3試管法和微孔板法檢測菌株生物被膜的形成將實驗室保存的17株金黃色葡萄球菌食品分離菌株在BP平板上純化,挑取單菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基中,37 ℃,150 r/min過夜培養(yǎng),作為原始接種菌液。試管法和微孔板法均采用我們之前發(fā)表的文獻(xiàn)描述的具體步驟進(jìn)行操作[21]。其中,96孔板法中閾值(ODc)的定義為陰性控制吸光值的2倍。判定標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)三次重復(fù)所測得的吸光值,將金黃色葡萄球菌生物被膜形成能力分為不形成生物被膜菌株(OD≤ODc),生物被膜弱形成菌株(ODc≤OD≤2×ODc),以及生物被膜強(qiáng)形成菌株(2×ODc≤OD)三類。

表1　食源性金黃色葡萄球菌粘附素基因攜帶情況

1.2.4添加蛋白酶K和DNase Ⅰ對金黃色葡萄球菌生物被膜形成影響根據(jù)試管法和微孔板法的生物被膜實驗結(jié)果篩選出2株強(qiáng)生物被膜形成菌株,用于探索蛋白酶K和DNase Ⅰ單獨使用以及兩種酶聯(lián)合使用分別對金黃色葡萄球菌生物被膜形成能力的影響。具體操作如下:將培養(yǎng)過夜的2株菌分別接種于無菌的聚苯乙烯96 孔板中,每孔中加入100 μL的TSB培養(yǎng)基,10 μL(約106CFU)過夜培養(yǎng)的新鮮菌液,1 μL的酶(蛋白酶K或DNase Ⅰ或兩種酶聯(lián)合使用),37 ℃培養(yǎng),觀察細(xì)菌生長的不同時間點(4、8、12、16、20、24、28、32 h)兩種酶對被膜形成影響以及隨時間變化趨勢,每一組別都要做三次平行,同時設(shè)置對照組。

1.2.5數(shù)據(jù)處理和分析96孔板測得的三個平行數(shù)據(jù),均采用Excel軟件初步處理,進(jìn)一步采用SPSS 18.0數(shù)據(jù)分析軟件處理,組內(nèi)比較采用Duncan方法,以p<0.05為差異具有統(tǒng)計意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2　結(jié)果與分析

2.1食源性金黃色葡萄球菌粘附素基因的分布情況

以提取的17株金黃色葡萄球菌食品分離菌株DNA作為模版,對14種粘附素基因(bap,bbp,cna,clfA,clfB,ebpS,eno,fib,fnbA,fnbB,icaAD,icaBC,sasC,sasG)進(jìn)行PCR檢測,檢測結(jié)果詳見表1。從表1可以看出,17株菌株均攜帶clfB基因,檢出率為100%,均不攜帶bap,bbp和clfA基因。有13株菌擴(kuò)增出icaBC基因(76.5%),12株均擴(kuò)增出cna基因(70.6%),11株菌擴(kuò)增出eno基因(64.7%),10株菌分別擴(kuò)增出fib和icaAD基因(58.8%),9株菌擴(kuò)增出fnbA基因(52.9%),4株菌分別擴(kuò)增出sasC,sasG和ebps基因(23.5%),2株菌擴(kuò)增出fnbB基因(11.8%)。從各菌株自身攜帶的基因來看,47號菌株攜帶9種檢測的粘附素基因,29和68號攜帶8種,23、26和79攜帶7種,25、49、57和67號攜帶6種,14和48號攜帶5種,1和108號菌株攜帶4種,3和30號攜帶3種,10號攜帶2種。

2.2試管法和微孔板檢測生物被膜形成結(jié)果

根據(jù)試管法的結(jié)果,肉眼可以觀察到17株菌株在玻璃試管壁上均有生物被膜形成(詳見圖1),但不同菌株的被膜形成能力有差異,其中,10、26、30、48、49、57、67和79號菌株能夠在試管上形成明顯的被膜,結(jié)晶紫染色特別清晰可見,見圖1。根據(jù)96孔板的判定標(biāo)準(zhǔn),從圖1中可以看出1、23和25號菌株為弱生物被膜形成菌株,3、10、14、26、29、30、47、48、49、57、67、68、79和108號菌株均為強(qiáng)生物被膜形成菌株。但是通過Duncan分析17株菌株在微孔板上生物被膜形成能力的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),菌株10和30被膜形成能力顯著強(qiáng)于其它15株菌(p<0.05),這兩株菌株不論是在試管上,還是微孔板上都表現(xiàn)出很強(qiáng)的生物被膜形成能力。因此,選取10和30號菌株進(jìn)行后續(xù)的酶處理。

圖1　微孔板和試管法分析17株金黃色葡萄球菌分離菌株的生物被膜形成情況Fig.1　The results of biofilm formation ability for 17 S. aureus isolates by tube test and microtiter-plate test

2.3蛋白酶K和DNase Ⅰ處理對細(xì)菌生物被膜形成能力的影響

結(jié)合試管法與96孔板法的結(jié)果,挑選10號與30號兩株菌株進(jìn)行蛋白酶K、DNase Ⅰ以及兩種酶的聯(lián)合處理。兩種酶對兩株菌生物被膜形成影響以及隨時間的變化趨勢見圖2。其中,圖2A為10號菌株酶處理與對照組的分析結(jié)果,2B為30號菌株酶處理與對照組的分析結(jié)果。由圖2中的數(shù)據(jù)和變化趨勢,可以明確得出蛋白酶K和DNase I處理組的生物被膜形成能力明顯低于對照未處理組(p<0.05),并且蛋白酶K對金黃色葡萄球菌生物被膜形成抑制效果比DNase Ⅰ好。但是兩種酶聯(lián)合處理效果反而不好,與對照組比較,差異不顯著(p>0.05),詳見圖2。

圖2　蛋白酶K和DNase Ⅰ對金黃色葡萄球菌食品分離菌株的生物被膜形成影響Fig.2　The effect of Proteinase K(PK)and DNase I on the biofilm formation of S. aureus food isolates注:A為10號菌株;B為30號菌株。

3　結(jié)論與討論

從九十年代末,學(xué)者們就開始關(guān)注到食源性病原細(xì)菌可粘附到食品和食品接觸器具表面引發(fā)嚴(yán)重的衛(wèi)生問題和經(jīng)濟(jì)損失,導(dǎo)致食物的污染和腐敗變質(zhì),其原因就是細(xì)菌生物被膜的出現(xiàn)[22]。而對于金黃色葡萄球菌生物被膜形成的研究始于醫(yī)院病人體內(nèi)的慢性感染[8]。從醫(yī)院感染病人體內(nèi)最頻繁分離到的生物被膜形成菌株是葡萄球菌屬,其中,金黃色葡萄球菌可占到22%～39%,凝固酶陰性葡萄球菌占到15%～37.5%[23]。在食品行業(yè),金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食源性疾病一直以來備受關(guān)注,但是隨著研究的深入,這些食品分離菌株生物被膜形成以及它們對食品安全造成的隱患也引起了重視。由于食品介質(zhì)表面的類型不同,各種不同食品分離菌株在生物被膜形成能力和粘附素基因的分布上可能存在差異。因此,本研究以實驗室保存的17株食品分離菌株為研究對象,這些菌株全部來源于菜市場的涼拌熟食和肉類,對這些菌株生物被膜形成相關(guān)基因的檢測以及生物被膜形成影響的研究旨在為細(xì)菌生物被膜的控制策略提供部分基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

學(xué)者們從葡萄球菌屬醫(yī)院分離株和動物源分離株中識別出不同的粘附基質(zhì)分子,發(fā)現(xiàn)不同來源的菌株中粘附基質(zhì)分子的基因攜帶情況差異較大[24-27]。本研究通過對食品金黃色葡萄球菌分離菌株進(jìn)行14種生物被膜形成相關(guān)基因的檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)17株食品分離菌株中clfB基因檢出率最高,為100%,其次是icaBC基因76.5%,cna基因70.6%,eno基因64.7%,fib和icaAD基因分別為58.8%,fnbA基因52.9%,sasC,sasG和ebps基因分別為23.5%,fnbB基因11.8%,所有菌株均未檢測出bap,bbp和clfA基因。Xu等[28]的研究發(fā)現(xiàn)28株牛奶源金黃色葡萄球菌分離菌株中eno基因的攜帶率最高,為100%,其次是fib基因為92.9%,clfA基因為89.3%和clfB基因為85.7%,由于他們檢測的粘附素基因數(shù)量種類少,研究結(jié)果間存在一定的差異,不一致的原因可能是菌株來源不同。本次檢測菌株均來源于食品,這些菌株腸毒素基因攜帶率不高,根據(jù)我們以前的研究結(jié)果,我們推測攜帶傳統(tǒng)腸毒素基因的金黃色葡萄球菌產(chǎn)被膜形成能力差,原因可能是金黃色葡萄球菌傳統(tǒng)腸毒素的產(chǎn)生與耐熱核酸酶之間的相關(guān)性強(qiáng),而耐熱核酸酶能夠抑制細(xì)菌被膜形成[21]。本研究篩選的17株菌株均能在試管壁上形成肉眼可見的生物被膜,全部不攜帶傳統(tǒng)腸毒素基因,因此,從另一個側(cè)面支持了我們的猜測:大多強(qiáng)生物被膜形成的金黃色葡萄球菌可能不攜帶傳統(tǒng)腸毒素基因。當(dāng)然,這種猜測還需要在以后的研究中進(jìn)一步驗證。另外,學(xué)者認(rèn)為不同粘附素基因和群集感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控因子的協(xié)調(diào)表達(dá)是細(xì)菌生物被膜形成起始過程的關(guān)鍵[26-27]。從本研究的檢測結(jié)果來看,不同分離菌株攜帶粘附素基因差異性較大,結(jié)合試管法以及微孔板法生物被膜形成能力檢測結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)并非攜帶粘附素基因種類越多的菌株其生物被膜形成能力就越強(qiáng)。事實上,10號和30號菌株的生物被膜形成能力強(qiáng),但攜帶的粘附素基因種類卻很少,相反,29,47和68號菌株攜帶的基因種類最多,反而這幾株菌株的生物被膜形成能力弱?；诩?xì)菌生物被膜的形成受多種因素影響,猜測也許某些關(guān)鍵基因的組合表達(dá)才是生物被膜形成的關(guān)鍵。例如,有學(xué)者認(rèn)為FnBPA和FnBPB粘附蛋白分子可促使醫(yī)院感染分離的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的生物被膜聚集,并且認(rèn)為同時擁有fnbA和fnbB這兩個基因的菌株生物被膜形成能力明顯高于只擁有單一基因的菌株[29]。本研究中檢測的17株食源性菌株未發(fā)現(xiàn)fnbA和fnbB兩個基因同時共存的菌株。由于金黃色葡萄球菌生物被膜形成除了受環(huán)境的影響,更多依賴于不同分離菌株個體特性和不同粘附素基因特異性組成情況等,如研究者們對引起牛乳腺炎的金黃色葡萄球菌分離菌株V329進(jìn)行研究,證實生物被膜相關(guān)蛋白Bap在金黃色葡萄球菌生物被膜形成的起始粘附和胞間聚集過程是必須的,并且V329的ica位點突變對生物膜形成表型沒有任何影響[12,25]。但bap基因只是從牛乳腺炎分離株中發(fā)現(xiàn),到目前為止在任何人源的金黃色葡萄球菌分離菌株中還沒有發(fā)現(xiàn)[30]。在本研究中17株食源性分離菌株也均未檢測出bap基因。在我們先前針對四川地區(qū)不同動物源(雞和羊)部分菌株的研究也未檢測出bap基因[20],暗示這些菌株的生物被膜形成與bap基因之間關(guān)聯(lián)性不強(qiáng)。另外,研究者認(rèn)為金黃色葡萄球菌胞外粘附多糖(PIA/PNAG)在金黃色葡萄球菌生物被膜形成中占有重要的作用,PIA/PNAG是由icaADBC操縱子編碼的基因產(chǎn)物,因此,有人認(rèn)為ica操縱子編碼的胞外粘附多糖(PIA/PNAG)是理解生物被膜形成機(jī)制的橋梁[9]。本文中,ica基因的檢出率相對較高,說明食源性分離菌株大多可能是依賴于PIA/PNAG介導(dǎo)的生物被膜形成類型,但同時也存在不依賴于PIA/PNAG介導(dǎo)的生物被膜形成類型。另外,我們的研究中發(fā)現(xiàn)sasC和sasG的攜帶率約在23%左右,這與Schroeder等[30]的研究結(jié)果較一致,他們主要針對醫(yī)院源金黃色葡萄球菌的分離菌株進(jìn)行監(jiān)測,sasG基因的檢出率為33%,并且從部分菌株中還篩選到了新的SasC分子,同樣,他們在這些菌株中也未檢測出bap基因。值得一提的是,所有菌株中均能檢測出clfB基因,我們推測這個基因也許在細(xì)菌生物被膜形成過程中起著較為重要的作用,我們未來的研究可以針對該基因進(jìn)行敲出驗證,或許能夠得到新的發(fā)現(xiàn)。

進(jìn)一步在針對10號和30號菌株的酶處理實驗表明蛋白酶K和DNase Ⅰ的單獨作用對食源性金黃色葡萄球菌生物被膜形成抑制效果明顯,并且蛋白酶K效果優(yōu)于DNase Ⅰ,但聯(lián)合作用時效果反而變差,我們分析的原因是蛋白酶K和DNase Ⅰ之間有相互作用,導(dǎo)致酶的活性降低而引起抑制效果變?nèi)?。針對DNaseⅠ對生物被膜形成抑制的研究有多次報道,例如,我們以前的研究發(fā)現(xiàn)葡萄球菌耐熱核酸酶和DNaseⅠ對金黃色葡萄球菌生物被膜的形成可以起到抑制作用[21]。Mann[31]等也發(fā)現(xiàn)葡萄球菌核酸酶能夠降解胞外DNA,促進(jìn)細(xì)胞的分散,從而能夠抑制自身生物被膜的形成。相比較采用蛋白酶K處理生物被膜的報道較少,從本文的結(jié)果來看,蛋白酶K的處理效果很好,這也從另一個側(cè)面反映蛋白質(zhì)粘附素分子在分離菌株生物被膜形成中的貢獻(xiàn)。

關(guān)于食源性細(xì)菌生物被膜的研究目前已成為食品安全關(guān)注的一個熱點問題[32],還有許多新的因子和新的機(jī)制等待我們?nèi)ヌ剿?。特別是針對金黃色葡萄球菌不同分離菌株開展粘附素基因的相關(guān)研究能夠讓我們從中發(fā)現(xiàn)一些新的規(guī)律和新的特點,所有這些為進(jìn)一步探索食源性金黃色葡萄球菌生物被膜形成起主要作用的粘附素基因的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ),也為食源性金黃色葡萄球菌生物被膜形成菌株的檢測、消除和控制提供新的目標(biāo)靶點。

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Detection of adhesin genes ofStaphylococcusaureusfood isolates and the effect of Proteinase K and DNaseⅠon biofilm formation

MA Yisalan1,YU Bo-yang2,CHEN Juan1,LIU Ji1,TANG Jun-ni1,*

(1.College of Life Science and Technology,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China; 2.Chengdu No. 7 High School,Chengdu 610041,China)

To investigate 14 adhesin genes distribution inStaphylococcusaureusfood isolates,the DNA of 17S.aureusisolates was extracted and used for PCR amplification. Then,the biofilm formation ability of 17S.aureusisolates was detected by tube test and microtiter-plate test methods. Further,the effect of Proteinase K and DNaseⅠon biofilm formation was explored and discussed. The results showed that all the 17S.aureusisolates carriedclfBgene and the detection rate was 100%;then followed theicaBCgene(13/17,76.5%);cnagene(12/17,70.6%);enogene(11/17,64.7%);fibandicaADgene(10/17,58.8%);fnbAgene(9/17,52.9%);sasC,sasGandebpSgene(4/17,23.5%);and thefnbBgene(2/17,11.8%). Thebap,bbpandclfAgenes were not exist in all 17 strains. The tube test and microtiter-plate test methods showed all the 17 strains could form biofilm;however,the ability of biofilm formation among different strains had obvious difference. Especially,the strains of No. 10 and No. 30 had stronger biofilm formation ability than others(p<0.05). Proteinase K,DNaseⅠand the combination of these two enzymes were used to treat the biofilm formation during the bacteria growth process. The results showed the biofilm formation ability treated by Proteinase K and DNaseⅠwas weaker than control,and the effect of Proteinase K was better than that of DNaseⅠ.While the effect of two enzymes combination did not present significant difference in comparison with the control(p>0.05). The results of this study would provide basic data for food sourcesS.aureusbiofilm formation and control strategy.

Staphylococcusaureusfood isolates;Biofilm formation;Adhesin genes;Proteinase K;DNaseⅠ

2016-04-08

馬伊薩蘭(1991-)，女，碩士，研究方向：畜產(chǎn)品加工與安全，E-mail:403884179@qq.com。

唐俊妮(1971-)，女，博士，教授，研究方向：食品安全與食品微生物，E-mail：junneytang@aliyun.com。

國家自然科學(xué)基金(31071515, 31371781)；四川省應(yīng)用基礎(chǔ)項目(2014JY0253)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目(2015NZYQN59)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)17-0185-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.028