透性化處理對酵母細胞谷胱甘肽分泌能力的影響

牛書操,段　超,張　倩,段學輝

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室食品學院,江西南昌 330047)

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透性化處理對酵母細胞谷胱甘肽分泌能力的影響

牛書操,段超,張倩,段學輝*

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室食品學院,江西南昌 330047)

酵母細胞一般具有谷胱甘肽(GSH)的合成能力和儲存穩(wěn)定性。為了考察和促進酵母細胞的GSH分泌能力,實驗研究了低pH脅迫、凍融、細胞干燥、滲透壓沖擊和有機溶劑等透性化處理對酵母細胞膜通透性的影響。結果顯示:凍融法對酵母GSH的胞外分泌作用效果不明顯;低pH脅迫、細胞干燥、滲透壓沖擊和有機溶劑處理都能一定程度地改變酵母細胞膜通透性,促使GSH分泌到細胞外,其中低pH脅迫和滲透壓效果不穩(wěn)定,有機溶劑處理效果最好。在細胞酶催化前體氨基酸合成GSH的反應液中加入8%(v/v)的丙酮,酶催化合成48 h,GSH總產(chǎn)量達到551 mg/L,比對照組提高了51%,表明合適的透性化處理能夠促進酵母細胞內GSH的胞外分泌和積累。

酵母,細胞膜通透性,谷胱甘肽,分泌,酶催化

谷胱甘肽(glutathione,GSH)是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸三種氨基酸縮合而成的具有γ-谷氨?；蛶€基的生物活性三肽,對維持生物體內適宜的氧化還原環(huán)境起著至關重要的作用[1]。GSH是細胞內產(chǎn)物,積累到一定濃度時,GSH合成酶系受到反饋抑制[2],所以通常情況下菌體內GSH含量都比較低(占細胞干重的0.5%～1.0%)[3]。通過物理化學或基因方法可以提高細胞通透性,有利于細胞內合成的GSH分泌到胞外,如Nie[4]等研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)朊假絲酵母在強酸脅迫下具有將GSH分泌到胞外的能力;Yamada[5]等研究發(fā)現(xiàn)熱帶假絲酵母PK233在含有低濃度乙醇的培養(yǎng)基中生長時能在細胞外積累GSH;Rollini[6]等研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的表面活性劑或凍干處理可使菌體內大部分GSH分泌到胞外積累。此外,利用基因工程在細胞內超表達如Gex1p、Gex2p或Gxa1p基因也可以促進細胞內GSH分泌到細胞外積累[7-8]。

本文選用實驗室保藏的絮凝酵母SP5,通過調控細胞生長和處理的環(huán)境條件,考察低pH脅迫、凍融、細胞干燥、滲透壓沖擊和有機溶劑處理對培養(yǎng)酵母細胞的活性和GSH通透性的影響,探討改變酵母細胞GSH胞外分泌能力的環(huán)境條件,提高酵母細胞酶系催化合成GSH的效率,為促進細胞內GSH產(chǎn)物的穩(wěn)定合成和胞外分泌積累提供研究數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

絮凝酵母SP5,本實驗室保藏;酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉等 生化試劑;蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、硫酸銨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、硫酸鎂、氯化鎂、檸檬酸、硫酸,甲苯、三氯甲烷、四氫呋喃、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、乙二醇甲醚、石油醚、丙酮、正丁醇、正己烷、環(huán)己烷、谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷胱甘肽、肌醇、四氧嘧啶等試劑分析純。

生物安全柜蘇凈集團安泰公司;多用途水浴恒溫振蕩器江蘇太倉市實驗設備廠;生化培養(yǎng)箱、超級恒溫水浴槽上海精宏實驗設備有限公司;紫外可見分光光度計上海光譜儀器有限公司;離心機Thermo公司;電子天平Mettler Toledo公司;高壓滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠;雷磁pH計上海儀電科學儀器股份有限公司;冰箱Hair集團。

1.2菌體培養(yǎng)

參考Chen等[9]的方法。

1.3胞內GSH提取

參考Chen等[9]的方法,具體步驟為:取適量菌液于3000 r/min離心10 min,上清液用于測定胞外GSH含量,菌體去離子水洗三次,加入適量蒸餾水,混勻,95 ℃熱水浴中抽提15 min,冷卻至室溫,3000 r/min離心10 min,取上清液測定細胞內GSH含量,換算為mg/L。

1.4GSH測定

四氧嘧啶法[10]和四氧嘧啶補償法[11]測定GSH。

1.5細胞干重(DCW)測定

取10 mL發(fā)酵液于3000 r/min離心10 min,棄上清液,用去離子水洗滌菌體3次,置于65 ℃烘箱中干燥至恒重。

1.6細胞處理方法

1.6.1對照培養(yǎng)按10%(v/v)接種量將種子液接入裝有50 mL發(fā)酵液(不額外添加任何物質)的250 mL搖瓶中,30 ℃,160 r/min培養(yǎng)條件下菌體生長和GSH合成情況。

1.6.2低pH脅迫法參考文獻[4]的方法，酵母細胞培養(yǎng)24 h后,將發(fā)酵液pH分別調低至3.0、2.5、2.0、1.5,脅迫處理4 h。

1.6.3滲透壓沖擊法參考文獻[12]的方法，將酵母細胞充分懸浮在含10% NaCl或20%蔗糖的10 mmol/L Tris-HCl溶液(pH8.0)中,4 ℃冰箱中維持30 min,離心收集菌體,用一定量的10 mmol/L Tris-HCl溶液(pH 8.0)懸浮,4 ℃冰箱中維持30 min,3000 r/min離心收集菌體。

1.6.4凍融法參考文獻[13-14]的方法，將加水量為20%(g/g)的酵母細胞置于-20 ℃冰箱中冷凍保存1 h,30 ℃水浴融化30 min,反復凍融3次。

1.6.5干燥法參考文獻[15]的方法，將酵母濕細胞吸干表面水分,置于-20 ℃冰箱或室溫(25 ℃)中干燥一周。

1.6.6有機溶劑法發(fā)酵24 h后在裝有55 mL發(fā)酵液的250 mL搖瓶加入不同種類不同濃度的甲苯、三氯甲烷、四氫呋喃、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、乙二醇甲醚、石油醚、丙酮、正丁醇、正己烷或環(huán)己烷處理2.5 h,離心收集細胞。

1.7細胞存活率測定

采用平板涂布計數(shù)法[16]。

1.8酶法合成GSH反應條件

參考Chen等[9]的方法,具體步驟為:將4 g酵母濕細胞加入到裝有40 mL酶法合成反應液的250 mL搖瓶中,30 ℃,160 r/min振蕩培養(yǎng)。

2　結果與分析

2.1對照條件下絮凝酵母SP5的生長和GSH合成情況

對照培養(yǎng)條件下絮凝酵母SP5的生長和GSH合成情況如圖1所示。

圖1　對照條件下絮凝酵母SP5生長(a)和GSH合成(b)情況Fig.1　Flocculation yeast SP5 growth(a) and GSH synthesis(b)in natural culture conditions

從圖1a可以看到,在對照培養(yǎng)條件下絮凝酵母SP5的生長隨發(fā)酵時間延長而迅速增加,發(fā)酵到24 h時細胞濃度達到最高,細胞干重為7.49 g/L;發(fā)酵液的pH由初始的6.0逐漸降低并維持在4.5左右;圖1b顯示在對照培養(yǎng)條件下,絮凝酵母SP5合成的GSH主要在細胞內積累,并隨著發(fā)酵時間增加GSH積累濃度提高,當發(fā)酵時間達到20 h后細胞內積累的GSH濃度趨于穩(wěn)定,發(fā)酵到24 h時GSH的合成總量達到53.9 mg/L;發(fā)酵液中不能明顯檢測到細胞外積累的GSH。

2.2低pH對GSH胞外分泌的影響

發(fā)酵液的pH會影響底物和產(chǎn)物的解離狀態(tài),影響培養(yǎng)微生物細胞膜的帶電狀態(tài),改變細胞膜流動性和通透性,促進細胞對營養(yǎng)物質的吸收利用和代謝產(chǎn)物的分泌[4]。酵母細胞培養(yǎng)24 h后將發(fā)酵液pH從4.5分別調低至3.0、2.5、2.0、1.5,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后檢測其發(fā)酵液和培養(yǎng)細胞內的GSH含量,結果如圖2所示。

圖2　低pH處理后細胞內外GSH含量變化Fig.2　Changes of GSH content in cells after low pH treatment注:同一類別不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05),圖3～6同。

從圖2a可以看到,隨pH從3.0降低至2.0,細胞的GSH合成活性和生長量有所下降,合成的GSH主要積累在細胞內;當發(fā)酵液pH降低至1.5時,細胞合成的GSH有將近95%積累在細胞外,發(fā)酵液中細胞量明顯降低,表明低pH脅迫能夠改變酵母細胞膜通透性,促使細胞內GSH分泌到細胞外;但長時間處于過低pH環(huán)境(pH低于2)會降低細胞活性,甚至導致細胞自溶死亡,Nei等[4]在研究強酸脅迫促進產(chǎn)朊假絲酵母細胞內GSH的胞外分泌時也有類似現(xiàn)象。

分別取不同低pH脅迫處理過的酵母濕細胞4 g和未處理的對照組pH 4.5培養(yǎng)細胞4 g,進行酶法合成GSH發(fā)酵,圖2b結果顯示,低pH處理過的酵母細胞合成GSH濃度在363 mg/L左右,與對照組的濃度差別不大;pH1.5～3.0發(fā)酵液處理過的酵母細胞合成的GSH主要在細胞內積累,表明低pH脅迫處理對酵母細胞膜通透性的改善可能不穩(wěn)定,環(huán)境pH改變(回到正常pH),透性化細胞的GSH分泌能力會明顯下降,甚至可以恢復到對照組細胞的生理結構狀態(tài)。

2.3凍融法、干燥法和滲透壓沖擊法處理對酵母細胞分泌GSH能力的影響

一定的物理處理可以造成細胞壁和細胞膜的結構性損傷,提高細胞膜通透性[12-15]。用凍融法、干燥法和滲透壓沖擊法處理酵母細胞,檢測細胞內外GSH含量變化(圖3a),并用處理后的酵母細胞在與對照組細胞同樣條件下酶法合成GSH,結果如圖3b所示。

圖3　不同方法處理后細胞酶法合成GSH情況Fig.3　Enzymatic synthesis of GSHby yeast cells treated with different methods

從圖3a中可以看到,凍融法處理后酵母細胞內GSH含量變化不大;滲透壓沖擊法(10%NaCl和20%蔗糖)處理后細胞內近50%的GSH釋放到胞外;干燥法(冷凍干燥和室溫干燥)處理后細胞內GSH含量降低了80%。表明滲透壓沖擊法和干燥法可以明顯提高酵母細胞通透性,促使胞內GSH釋放到胞外。

從圖3b中可以看出,凍融法處理的酵母細胞胞內合成的GSH量與未處理的對照組細胞的合成量接近,主要在細胞內積累,胞外分泌不明顯;干燥法(冷凍干燥和室溫干燥)處理的細胞在復水活化后細胞膜通透性改變明顯,可將細胞內80%的GSH釋放到細胞外,處理細胞酶法合成的GSH大部分在胞外積累;滲透壓沖擊法處理酵母細胞合成GSH,在反應液中很難檢測到GSH,合成的GSH主要在細胞內積累,表明滲透壓沖擊法處理細胞的膜通透性改變不穩(wěn)定,透性化細胞GSH分泌能力可能很快喪失。

2.4不同有機溶劑處理對細胞分泌GSH能力的影響

有機溶劑可以在細胞膜中積累,破壞細胞被膜上脂類物質之間的相互作用,導致細胞膜通透性發(fā)生改變[5]。對照條件下培養(yǎng)24 h的酵母細胞,分別選擇不同的有機溶劑進行處理,考察細胞的耐受性和GSH的分泌水平,檢測處理后細胞內GSH含量,實驗結果如表1所示(log P是溶劑在辛醇和水中分配系數(shù)的對數(shù)值,用來表征溶劑的極性)。

表1　不同有機溶劑處理后細胞內GSH含量

圖4　不同有機溶劑對GSH發(fā)酵的影響Fig.4　Effect of different organic solvents on GSH fermentation

從表1中可以看到,有機溶劑丙酮、四氫呋喃、乙酸乙酯、正丁醇、三氯甲烷、甲苯等都可以改變細胞膜的通透性,導致細胞內GSH外泄;甲醇、乙醇、乙二醇甲醚、環(huán)己烷、正己烷、石油醚處理,細胞內GSH含量變化不大,胞外分泌不明顯,表明不僅有機溶劑的化學特性影響酵母細胞膜的通透性,還可能與其極性有關(極性低于3時對細胞膜通透性影響較大)[17]。

分別用2%、4%、6%、8%、10%(v/v)濃度的丙酮、四氫呋喃、乙酸乙酯、正丁醇、三氯甲烷、甲苯處理,繼續(xù)發(fā)酵2.5 h,檢測酵母細胞活性和細胞膜的通透性,結果如圖4 所示。

從圖4中可以看到,丙酮和甲苯處理細胞膜濃度越高,細胞膜通透性改變越大,胞內GSH分泌到細胞外越多(實際胞外GSH含量略低于胞內GSH減少量);濃度在2%～10%(v/v)的丙酮對細胞生長和細胞活性影響不大,但濃度達到6%(v/v)的甲苯就能明顯抑制細胞生長,濃度繼續(xù)升高甚至會使細胞失去活性。

圖4中顯示乙酸乙酯、四氫呋喃、三氯甲烷和正丁醇對絮凝酵母細胞膜通透性的改變存在臨界濃度現(xiàn)象(有機溶劑在細胞膜內積累到一定濃度時才會使細胞膜通透性發(fā)生改變),其中乙酸乙酯和四氫呋喃在達到臨界濃度(6%和8%)后細胞內GSH含量明顯下降;較低濃度三氯甲烷(2%)和正丁醇(2%)會嚴重抑制細胞生長和細胞活性,達到各自臨界濃度(6%和4%)后細胞內GSH含量急劇下降,細胞基本失去活性,甚至自溶死亡。

不同有機溶劑處理的酵母細胞用于酶法合成GSH,反應24 h檢測反應液和細胞內的GSH含量,結果如圖5所示。

圖5　不同有機溶劑處理后細胞酶法合成GSH情況Fig.5　Enzymatic synthesis of GSH by yeast cells treatment with different organic solvents

從圖5中可以看到,甲醇、乙醇、乙二醇甲醚、環(huán)己烷、正己烷和石油醚對酵母細胞膜通透性的改變作用不明顯,細胞酶法合成GSH胞內外含量與對照組差別不大;正丁醇、三氯甲烷和甲苯處理的細胞依然可以將細胞內部分GSH釋放到細胞外積累,但GSH總量明顯降低,表明這三種有機溶劑不但可能對細胞膜損傷較大,還可能會降低GSH合成酶系活性;丙酮、四氫呋喃和乙酸乙酯處理的酵母細胞膜具有一定的通透性,合成的GSH胞內積累為主,少量分泌細胞外,顯示反應液中加入一定量的丙酮、四氫呋喃或乙酸乙酯有利于酵母細胞內的GSH分泌到細胞外。

在酶法合成GSH反應液中分別加入丙酮(8%)、四氫呋喃(8%)或乙酸乙酯(6%),合成反應至24 h和48 h分別取樣,檢測反應液中、細胞內以及總的GSH含量,并與對照組比較,結果如圖6所示。

圖6　不同有機溶劑對酶催化合成GSH的影響Fig.6　Effect of different organic solvents on the synthesis of GSH by enzyme catalysis

從圖6看出,在酶合成反應液中加入一定量的丙酮、四氫呋喃或乙酸乙酯能夠改善酵母細胞膜通透性,促使細胞內GSH分泌,從而有利于減輕產(chǎn)物的反饋抑制,提高GSH的總產(chǎn)量。結果同時顯示,丙酮效果明顯比四氫呋喃和乙酸乙酯好,GSH總產(chǎn)量提高最多,酶法合成48 h時比24 h產(chǎn)量高;添加8%丙酮反應48 h,合成積累的GSH細胞內、反應液和總產(chǎn)量分別達到293、258和551 mg/L,比對照組的總產(chǎn)量366 mg/L提高了51%。

3　結論

一般情況下酵母細胞中的GSH主要在胞內合成積累,胞外分泌量很少。本研究采用物理或化學方法對酵母細胞進行透性化處理和脅迫刺激,以使細胞內的GSH分泌到胞外積累,提高GSH合成酶系催化效率。結果表明,凍融法對酵母GSH胞外分泌作用效果不明顯;低pH脅迫、滲透壓沖擊法、干燥法和有機溶劑法都能不同程度地改變酵母細胞膜通透性,增強GSH的胞外分泌能力,但是低pH脅迫和滲透壓沖擊法處理后酵母細胞膜通透性改變不穩(wěn)定,干燥法對細胞膜破損嚴重,影響GSH總合成量;有機溶劑法效果最好,在酶合成反應液中加入一定量的丙酮、四氫呋喃或乙酸乙酯可使胞內胞外同時積累GSH,既能減輕對合成酶系的反饋抑制,又能使GSH總合成量明顯提高。綜上所述,合適的透性化處理可實現(xiàn)GSH的胞外積累,有利于減少下游操作,降低生產(chǎn)成本,具有工業(yè)化胞外連續(xù)生產(chǎn)GSH的巨大潛力。

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Effects of permeabilized treatment on the secretion of glutathione in yeast cells

NIU Shu-cao,DUAN Chao,ZHANG Qian,DUAN Xue-hui*

(State Key Laboratory of Food Science and Technology,School of Food Science, Nanchang University,Nanchang 330047,China)

Yeast cells generally possess the ability of synthesis and storage stability of GSH. In order to investigate and promote GSH secreting ability of yeast cells,the effects of low pH stress,dry,freezing and thawing,osmotic shock and organic solvent on the membrane permeability of yeast cells was studied. The results showed that the cell membrane permeability of yeast cells changed not obvious after treated with freezing and thawing,but could be changed to a certain extent by low pH stress,osmotic shock and organic solvent treatment,which prompted GSH to be secreted into the cell. The effects of low pH stress and osmotic shock was not stable,while organic solvent was the most effective,8%(v/v)acetone was added to the enzymatic synthesis reaction solution,enzyme catalyzed synthesis of 48 h,the total yield of GSH reached 551 mg/L,which increased by 51% compared with the control. These results showed that permeabilized treatment could promote the secretion and accumulation ability of GSH in yeast cells.

yeast;membrane permeability;glutathione;secretion;enzyme catalysis

2016-02-26

牛書操 (1987-)，男，碩士研究生，研究方向：生物催化與轉化，E-mail:15727658138@163.com。

段學輝(1958-)，男，博士，教授，研究方向：食品生物技術，E-mail:xhduan@ncu.edu.cn。

南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室自由探索課題(201113)。

TS201

A

1002-0306(2016)17-0175-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.026