紅鳳菜抗氧化成分提取分離研究

任冰如,申玉香,劉俊康,滕杰暉,呂　寒,陳　劍,*

(1.江蘇省中國科學院植物研究所,江蘇南京 210014;2.鹽城工學院,化學與生物技術(shù)學院,江蘇鹽城 224051)

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紅鳳菜抗氧化成分提取分離研究

任冰如1,申玉香2,劉俊康2,滕杰暉1,呂寒1,陳劍1,*

(1.江蘇省中國科學院植物研究所,江蘇南京 210014;2.鹽城工學院,化學與生物技術(shù)學院,江蘇鹽城 224051)

目的 有效地從紅鳳菜中提取分離抗氧化活性成分。方法 以“乙醇提取-NKA大孔樹脂柱層析-聚酰胺柱層析-重結(jié)晶”的方法進行分離,測定各階段樣品的DPPH IC50、ABTS IC50、總酚及總黃酮含量,并作相關(guān)性分析。結(jié)果 大孔樹脂的30%乙醇洗脫物抗氧化活性最高(DPPH IC50為31.5 μg/mL,ABTS IC50為15.1 μg/mL)、總酚含量較高(22.8%)、未檢出黃酮苷元成分,50%乙醇洗脫物抗氧化活性較高(DPPH IC50為42.1 μg/mL,ABTS IC50為33.2 μg/mL)、總酚含量最高(26.3%)、總黃酮苷元及總黃酮含量均最高(分別為18.7%和33.7%);50%乙醇洗脫物經(jīng)聚酰胺柱層析得到的黃酮苷結(jié)晶Ⅰ、Ⅱ及其母液干燥物,其抗氧化活性、總酚及總黃酮含量均提高;DPPH IC50與總酚含量間存在顯著負相關(guān)(r=-0.883*)。結(jié)論 紅鳳菜提取物清除DPPH自由基的活性與其總酚含量顯著相關(guān),依次采用NKA大孔樹脂和聚酰胺柱層析可有效地富集抗氧化活性成分。

紅鳳菜,抗氧化,總酚,總黃酮

紅鳳菜(GynurabicolorDC.)為菊科菊三七屬植物[1],別名血皮菜、觀音菜、觀音莧、紫背天葵等,原產(chǎn)于我國南方各地,作為傳統(tǒng)民間藥全草入藥,具有涼血止血、解毒消腫的功用[2],紅鳳菜富含營養(yǎng)成分[3-4],作為保健蔬菜在我國多個地區(qū)有栽培和銷售?？茖W研究證明,由各種氧自由基所引發(fā)的氧化作用是導(dǎo)致身體中各組分和器官損傷、病變的重要原因之一[5],植物中廣泛存在著各類抗氧化活性成分[6],可作為有效的外源性物質(zhì)克服自由基對人體的危害。紅鳳菜的乙酸乙脂萃取物具有較高的總酚含量和抗氧化活性,并具有細胞毒性,尤其可引起人結(jié)腸癌細胞HCT116和HCT-15的細胞凋亡及細胞壞死[7],因此研究紅鳳菜的抗氧化活性成分具有重要意義。

DPPH和ABTS法是基于分光光度法來測定樣品抗氧化活性的方法,具有操作簡單、快速、高通量等優(yōu)點而被廣泛使用[8]。為了更深入地了解紅鳳菜的抗氧化活性及其有效成分,建立有效的提取分離方法,為紅鳳菜的開發(fā)利用提供依據(jù)和方法,本實驗采用“乙醇提取-大孔樹脂柱層析-聚酰胺柱層析-重結(jié)晶”的流程進行提取分離,在不同階段取樣,測定樣品對DPPH自由基和ABTS自由基的清除作用、樣品的總酚含量和總黃酮含量,并對各參數(shù)之間的相關(guān)性進行分析。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

紅鳳菜(GynurabicolorDC.)于2003年7月引自重慶,憑證標本號0648614,憑證標本保存于江蘇省中國科學院植物研究所標本館(NAS),新鮮莖葉于2012年9月采自江蘇省中國科學院植物研究所的實驗苗圃。

NKA大孔樹脂天津南開和成科技有限公司;蘆丁化學對照品中國藥品生物制品檢定所,批號100080-200306,供UV法含量測定,純度91.7%;沒食子酸對照品成都瑞芬思生物科技有限公司,液相色譜測得其純度為98.21%;FC(Folin & Ciocalten’s phenol)sigma-Alorich公司,濃度2 N,Lot:BCBM 1927V;DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)Sigma公司,Cat.NO:D913-2,Lot:S44112-089;ABTS(2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)上海生工生物公司,Lot:XP1204B2012J;槲皮素對照品中國藥品檢定研究院,批號100081-200907,純度96.5%;山柰酚對照品中國食品藥品檢定研究院,批號110861-200808,純度95.9%;分析純乙醇(95%)南京化學試劑有限公司;高效液相所用色譜純甲醇Tedia公司;過硫酸鉀上海凌峰化學試劑有限公司。

METTLER TOLEDO EL 204電子天平梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DIONEX ultimate 3000高效液相色譜儀美國戴安公司;SpectraMax Plus384酶標儀美國美谷分子儀器公司。

1.2實驗方法

1.2.1紅鳳菜提取物的制備紅鳳菜新鮮莖葉,用95%乙醇冷浸提取,減壓濃縮后冷沉去雜,得到的上清液為乙醇提取物,用大孔樹脂柱層析,依次用2倍床體積的體積分數(shù)為0、30%、50%、70%、95%乙醇-水溶液洗脫,得到水洗脫物、30%乙醇洗脫物、50%乙醇洗脫物、70%乙醇洗脫物和95%乙醇洗脫物,取50%乙醇洗脫液,再用聚酰胺柱層析,依次用2倍床體積的體積分數(shù)為0、30%、50%、70%、95%乙醇洗脫,每留份為1/10柱床體積,減壓濃縮后用聚酰胺薄層層析檢識黃酮類化合物[以BAW(正丁醇∶乙酸∶水=4∶1∶5)為展開劑,1 g/100 mL的AlCl3-乙醇溶液為顯色劑],留取有黃酮反應(yīng)的部分,在室溫放置直到結(jié)晶物充分析出,過濾,得到不同留份的黃酮苷結(jié)晶Ⅰ和黃酮苷結(jié)晶Ⅱ,將母液合并得到黃酮苷母液,以上樣品在水浴上蒸干后研磨成均勻粉末,55 ℃烘干至恒重,置干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2紅鳳菜提取物的抗氧化活性測定精密稱取紅鳳菜提取物2.00 mg左右,加入體積分數(shù)為80%的乙醇,配制成質(zhì)量體積為2～15 mg/mL的溶液,根據(jù)預(yù)備實驗稀釋成不同的工作濃度。樣品“乙醇提取物”、“水洗脫物”、“30%乙醇提取物”、“50%乙醇提取物”、“95%乙醇提取物”、“黃酮苷結(jié)晶Ⅰ”、“黃酮苷結(jié)晶Ⅱ”及“黃酮苷母液”的工作濃度,用于測定對DPPH自由基的清除活性時,分別為 10.12、5.00、1.12、1.04、2.64、5.02、1.12、0.43及0.66 mg/mL;用于測定對ABTS自由基的清除活性時,分別為 10.12、5.00、0.56、1.04、1.32、5.02、1.12、0.85及1.31 mg/mL。

1.2.2.1DPPH自由基清除活性的測定參照曾維才等[8]的方法并作改進,測定紅鳳菜樣品對DPPH自由基的清除活性,具體方法如下:用無水乙醇配制濃度為0.16 mmol/L的DPPH工作液,避光低溫保存。向96孔板中分別加入配成工作濃度的樣品溶液2、4、6、8、10、15、20、30、40 μL、用無水乙醇補足至100 μL,再加入DPPH工作液100 μL,25 ℃反應(yīng)30 min后,在 517 nm處測得樣品的吸光度(Ai);將體系中的樣品用無水乙醇代替,其他試劑不變,測定得空白對照的吸光度(Ao);將體系中的DPPH用無水乙醇代替,其他試劑不變,測得樣品本底的吸光度(Aj),每個樣品重復(fù)3次,取平均值,按以下公式計算清除率:清除率(%)=[Ao-(Ai-Aj)]/Ao×100。當清除率為50%時,反應(yīng)體系中樣品的濃度為半數(shù)清除率(DPPH IC50),以DPPH IC50表示樣品對DPPH自由基的清除活性。以抗壞血酸作陽性對照。

1.2.2.2ABTS自由基的清除活性的測定參照曾維才等[8]的方法并作改進,測定紅鳳菜樣品對ABTS自由基的清除活性,具體方法如下:將5 mL 7 mmol/L ABTS和88 mL 140 mmol/L過硫酸鉀溶液混合,在室溫、避光條件下靜置過夜,形成ABTS儲備液,該儲備液在室溫、避光的條件下表現(xiàn)穩(wěn)定。使用前用無水乙醇稀釋成ABTS工作液,要求其在734 nm 波長下的吸光度為 0.5±0.02。向96孔板中分別加入配成工作濃度的樣品溶液2、3、4、6、8、10、15、20、25 μL、用無水乙醇補足到體積為50 μL,再加入ABTS工作液200 μL,混勻,30 ℃反應(yīng)6 min后,在 734 nm處測定,得到樣品吸光度(Ai),將體系中的樣品用無水乙醇代替,其他試劑不變,測定得空白對照吸光度(Ao);將體系中的ABTS工作液用無水乙醇代替,其他試劑不變,測得樣品本底吸光度(Aj),每個樣品重復(fù)3次,取平均值,按以下公式計算清除率:清除率(%)=[Ao-(Ai-Aj)]/Ao×100。當清除率為50%時,反應(yīng)體系中樣品的濃度為半數(shù)清除率(ABTS IC50),以ABTS IC50表示樣品對ABTS自由基的清除活性。以抗壞血酸作陽性對照。

1.2.3紅鳳菜提取物的總酚含量測定參照張毛莉[9]等采用的Folin-Ciocalteu比色法,進行修改后測定總酚含量。工作曲線制作:精密稱取沒食子酸對照品5.59 mg,用去離子水定容到10 mL,再稀釋5倍得到?jīng)]食子酸對照品工作液,其質(zhì)量體積分數(shù)為0.1118 mg/mL,將市售的FC試劑稀釋10倍配制成FC工作液。分別取沒食子酸對照品工作液0、5、10、20、30、40、50 μL,加入96孔板的反應(yīng)孔中,用去離子水補足到50 μL,振蕩混勻后加入50 μL FC工作液,振蕩混勻后放置3 min,加入50 μL質(zhì)量體積分數(shù)為20%的Na2CO3,振蕩混勻反應(yīng)1 h后,用酶標儀測定A760。每個反應(yīng)重復(fù)3次,求平均值。測得沒食子酸工作曲線方程為: y=4.7718x-0.1707(r=0.9984),其中x為760 nm處的吸光值,y為反應(yīng)體系中的沒食子酸質(zhì)量(μg)。

表1　紅鳳菜不同提取物的抗氧化活性、總酚含量及總黃酮含量

注:“-”表示未檢測。樣品測定:精密稱取1.2.1中制備的紅鳳菜提取物3.00 mg左右,用體積分數(shù)80%乙醇配制成1 mg/mL的樣品溶液,取25 μL 樣品溶液,以與“工作曲線制作”相同的方法測得A760,求出樣品的總酚含量(%)。

1.2.4紅鳳菜提取物總黃酮含量測定工作曲線制作:采用任冰如[10]的方法測定,以槲皮素和山柰酚配制混合對照品溶液,其中槲皮素的質(zhì)量體積分數(shù)為13.82 μg/mL,山柰酚的質(zhì)量體積分數(shù)為13.71 μg/mL。色譜柱為Welch Material XB-C18柱(4.5 mm×250 mm,粒徑5 μm),以V(甲醇)∶V(0.4%磷酸水溶液)=55∶45為流動相,檢測波長為360 nm,流速1 mL/min,柱溫30 ℃。取混合對照品溶液,分別進樣5、10、15、20、25、30 μL,進行HPLC測定,記錄峰面積,以進樣量(x,μg)對峰面積積分值(y)進行線性回歸,得槲皮素的回歸方程為:y=0.0295x+0.0003(r=0.9994),在0.0691～0.4146 μg 范圍內(nèi)呈線性相關(guān);山柰酚的回歸方程分別為:y=0.0208x+0.0015(r=0.9997),在0.0686～0.4133 μg范圍內(nèi)呈線性相關(guān)(參見任冰如[10]的方法)。

樣品測定:精密稱取待測樣品2.50 mg左右,精密加入25 mL甲醇-25% HCl(4∶1)溶液,待樣品溶解后,在93 ℃水浴上回流1 h,冷卻后用分析純甲醇定容到50 mL,得到黃酮苷的酸解液,用于HPLC測定。樣品進樣量10 μL,根據(jù)峰面積積分值分別計算樣品中槲皮素和山柰酚含量,槲皮素和山柰酚之和為樣品中總黃酮苷元的含量(%),根據(jù)文獻[10,12]的測定結(jié)果和方法,將不同樣品中的槲皮素換算為槲皮素糖苷、山柰酚換算為山柰酚糖苷,不同樣品中的槲皮素糖苷與山柰酚糖苷之和為該樣品的總黃酮含量(%)。

1.2.5數(shù)據(jù)處理采用SPSS v16.0 軟件進行統(tǒng)計分析,求樣品的DPPH IC50、ABTS IC50、總酚含量、總黃酮苷元含量、總黃酮含量之間的相關(guān)性,以0.05水平表示顯著相關(guān),0.01水平表示極顯著相關(guān)。

2　結(jié)果與分析

2.1紅鳳菜提取物的抗氧化活性及其總酚、總黃酮含量

由表1可見,紅鳳菜乙醇提取物經(jīng)大孔樹脂柱層析,所得到的30%、50%和70%乙醇洗脫物抗氧化活性均明顯高于層析前的樣品(乙醇提取物),而其他洗脫物抗氧化活性較弱,故重點對30%、50%和70%乙醇洗脫部分進行分析。

表1顯示,30%乙醇洗脫物對DPPH自由基及ABTS+·的清除活性均最高,其DPPH IC50為31.5 μg/mL、ABTS IC50為15.1 μg/mL,該樣品總酚含量較高(22.8%),但未檢出黃酮苷元成分,說明該樣品的酚性物質(zhì)是黃酮以外的成分。

50%乙醇洗脫物也具有較高的抗氧化活性,該樣品總酚含量最高(26.3%),總黃酮苷元及總黃酮含量均最高(分別為18.7%和33.7%),是黃酮的富集部分。

70%乙醇洗脫物對DPPH自由基的清除能力低于30%洗脫物和50%洗脫物,但對ABTS+·的清除能力略高于50%乙醇洗脫物,其總酚含量較低。

因50%乙醇洗脫物是黃酮的富集部分,故進一步采用聚酰胺柱層析分離純化,得到黃酮苷結(jié)晶Ⅰ、黃酮苷結(jié)晶Ⅱ及其母液的干燥物,用以分析紅鳳菜黃酮成分的抗氧化活性。由表1可見黃酮苷結(jié)晶物及其母液的抗氧化活性均較純化前提高,其中黃酮苷結(jié)晶Ⅱ?qū)PPH自由基、ABTS+·的清除作用均最強,總酚及總黃酮苷元含量均最高,由于其總黃酮含量高達99.7%,可以確定該樣品抗氧化活性的主要成分為黃酮,酚性物質(zhì)的主要組成也是黃酮;黃酮苷結(jié)晶Ⅰ的抗氧化活性低于結(jié)晶Ⅱ,總酚及總黃酮苷元含量也都低于結(jié)晶Ⅱ,黃酮苷結(jié)晶Ⅰ的總黃酮含量為97.1%,說明其抗氧化活性的主要成分及酚性物質(zhì)的主要組成也均為黃酮;黃酮苷母液部分的抗氧化活性高于黃酮苷結(jié)晶Ⅰ,總酚及總黃酮苷元含量均與黃酮苷結(jié)晶Ⅰ相近,黃酮苷母液部分的總黃酮含量為84.8%,說明樣品中存在其他非黃酮成分,其抗氧化活性物質(zhì)除黃酮外還有非黃酮成分。

表2　紅鳳菜提取物的抗氧化活性與總酚、總黃酮含量的相關(guān)性

注：*：在0.05水平上顯著相關(guān)；**：在0.01水平上顯著相關(guān)。

2.2紅鳳菜提取物抗氧化活性與化學成分的相關(guān)性分析

紅鳳菜乙醇提取物經(jīng)大孔樹脂柱層析,得到的30%、50%及70%乙醇洗脫物以及將50%乙醇洗脫物進一步分離得到的黃酮苷均具有較強抗氧化活性,這些物質(zhì)的體外抗氧化活性(對DPPH自由基及ABTS+·的清除活性)、總酚含量、總黃酮含量之間的相關(guān)性如表2所示。

結(jié)果表明,不同提取物的DPPH IC50與ABTS IC50之間無顯著相關(guān)性;不同提取物的ABTS IC50與總酚含量、總黃酮含量之間無顯著相關(guān)性;不同提取物DPPH IC50與總黃酮苷元及總黃酮苷含量之間均無顯著相關(guān)性。

不同提取物的DPPH IC50與總酚含量之間存在顯著負相關(guān)(r=-0.883*),說明總酚含量越高,清除DPPH自由基的活性越強。

不同提取物的總酚含量與總黃酮苷含量及總黃酮苷元含量之間具有極顯著的相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)分別達到0.922**和0.955**,說明不同提取物的酚性物質(zhì)主要來自黃酮。

3　討論

分析結(jié)果表明,紅鳳菜提取物的總酚含量越高,清除DPPH自由基的活性越強,說明從紅鳳菜中提取分離酚性物質(zhì)具有重要意義。紅鳳菜乙醇提取物經(jīng)大孔樹脂柱層析,得到的30%、50%和70%乙醇洗脫物抗氧化活性均明顯高于層析處理前的樣品,50%乙醇洗脫物經(jīng)過聚酰胺柱層析后得到黃酮成分,其抗氧化活性又均較純化前提高,因此依次采用這兩種層析方法可有效地富集紅鳳菜中的抗氧化活性成分。

紅鳳菜不同提取物的DPPH IC50與ABTS IC50無顯著相關(guān)性,其原因可能是兩種方法測定抗氧化活性所基于的反應(yīng)原理不同從而導(dǎo)致測定結(jié)果存在差異[8]。紅鳳菜不同提取物的ABTS IC50與總酚、總黃酮含量之間無顯著相關(guān)性,提示樣品中含有可清除ABTS+·自由基的非酚性物質(zhì)。

紅鳳菜提取物清除DPPH自由基的活性與總酚含量顯著相關(guān),總酚含量又與總黃酮含量及總黃酮苷元含量極顯著相關(guān),但總黃酮含量及總黃酮苷元含量均與DPPH IC50無顯著相關(guān),其原因是黃酮為酚性物質(zhì)的一部分,即除黃酮以外提取物還含其他酚性物質(zhì),這在30%乙醇洗脫物有明確體現(xiàn)。由于30%乙醇洗脫物的抗氧化活性最高,其中的酚性物質(zhì)主要是黃酮以外的成分,Chen Jian等[11]檢測到紅鳳菜含有多種酚性酸,如咖啡?？鼘幩帷⑾愣辊？鼘幩帷⑽乎？鼘幩?、二咖啡?？鼘幩岬?推測這些酚性酸類物質(zhì)是其中的抗氧化有效成分。研究結(jié)果顯示,紅鳳菜黃酮主要由槲皮素、山柰酚以及以槲皮素、山柰酚為苷元的黃酮苷組成[12],而黃酮以外的酚性成分,其結(jié)構(gòu)、含量、抗氧化強度以及純化方法均值得進一步分析研究。

測定結(jié)果顯示,黃酮苷母液樣品的總酚含量及總黃酮苷元含量分別與黃酮苷結(jié)晶Ⅰ樣品的總酚含量及總黃酮苷元含量相近,由于黃酮苷結(jié)晶Ⅰ中的酚性物質(zhì)主要是黃酮,所以黃酮苷母液樣品中的酚性物質(zhì)也主要是黃酮,即在黃酮苷母液樣品中,黃酮是主要的酚性成分,非黃酮則主要為非酚性成分。黃酮苷母液樣品的總黃酮含量為84.8%,表明非黃酮成分亦即非酚性成分約為15%。母液樣品的抗氧化活性高于黃酮苷結(jié)晶Ⅰ,推測是其中的非酚性成分具有更強抗氧化活性或非酚性成分與黃酮苷之間有協(xié)同作用[13],實際情況也有待深入研究。

4　結(jié)論

紅鳳菜提取物清除DPPH自由基的活性與其總酚含量顯著相關(guān),依次采用NKA大孔樹脂和聚酰胺柱層析可有效地富集抗氧化活性成分。

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Isolation of the antioxidant components fromGynurabicolor

REN Bing-ru1,SHEN Yu-xiang2,LIU Jun-kang2,TENG Jie-hui1,LV Han1,CHEN Jian1,*

(1.Institute of Botany,Jiangsu Province and the Chinese Academy of Sciences,Nanjing 210014,China; 2.Department of Chemsitry and Biotechnology,Yancheng Technology College,Yancheng 224051,China)

Objective To isolate the antioxidant components fromGynurabicolor. Methods Fresh stems and leaves were extracted and isolated following the project of “ethanol extract-NKA macroporous resin column chromatograph-polyamide column chromatograph-recrystallize”,DPPH IC50,ABTS IC50,total phenols content and total flavonoids content about the samples at different treatment stages were measured and their correlations were analyzed. Results After NKA macroporous resin column chromatography,30% ethanol elution possesses the highest antioxidant activity(DPPH IC5031.5 μg·mL-1and ABTS IC5015.1 μg·mL-1)with higher total phenols content(22.8%),but flavonoid aglycone had not been detected;50% ethanol elution owns more antioxidant activity(DPPH IC5042.1 μg·mL-1and ABTS IC5033.2 μg·mL-1)with the highest content of total phenols(26.3%),total flavonoid aglycones(18.7%)and total flavonoids(33.7%);all the samples of flavonoid crystalⅠ,crystalⅡ and their mother liquor had higher antioxidant activity,total phenols and total flavonoids content than the sample chromatographed with polyamide column before;DPPH IC50of different extracts had significant negative correlation(r=-0.883*)with total phenols content ofG.bicolor. Conclution The activity of scavenging DPPH radical was significantly correlated with the total phenols content in extracts ofG.bicolor,antioxidant components can be effectively enriched followed by NKA macroporous resin and polyamide column chromatography.

Gynurabicolor;antioxidant;total phenols;total flavonoids

2016-01-29

任冰如(1964-)，女，博士，研究員，從事植物資源研究與開發(fā)，E-mail：bingruren@126.com。

陳劍(1980-)，男，博士，助理研究員，從事植物化學研究，E-mail：chenjian80@aliyun.com。

江蘇省產(chǎn)學研聯(lián)合創(chuàng)新資金(BY2012213);江蘇省科技基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)計劃-科技公共服務(wù)平臺項目(BM2011117)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)17-0153-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.021