蠶蛹蛋白源血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽抑制機(jī)理研究

王朝陽,趙鐘興,陶萌良,王欣輝,孫華菊,魏雅男

(廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,廣西高校資源化工應(yīng)用新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530004)

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蠶蛹蛋白源血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽抑制機(jī)理研究

王朝陽,趙鐘興*,陶萌良,王欣輝,孫華菊,魏雅男

(廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,廣西高校資源化工應(yīng)用新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530004)

以純化得到的兩條具有ACE抑制活性的肽(P1和P2)為基礎(chǔ),通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI TOF MS)確定P1、P2的氨基酸序列,并采用固相合成法合成,隨后對它們的抑制動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究,最后用Sybyl軟件分別將其與ACE進(jìn)行分子對接。結(jié)果表明:P1的氨基酸序列為Gly-Asn-Pro-Trp-Met(IC50值為12.61 μg/mL),為非競爭性抑制肽,抑制常數(shù)Ki,1=0.037 mmol/L;P2的氨基酸序列為Asn-Arg-Tyr-Leu-Arg(IC50值為14.68 μg/mL),為競爭性抑制肽,其抑制常數(shù)Ki,2=0.020 mmol/L;P1、P2都能與ACE活性位點(diǎn)氨基酸殘基形成氫鍵。P1、P2可以作為預(yù)防高血壓的功能性食品,為蠶蛹蛋白的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

蠶蛹蛋白,血管緊張素轉(zhuǎn)換酶,抑制肽,分子對接,抑制動(dòng)力學(xué)

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin I-Converting enzyme,ACE,EC3.4.15.1)是一種在人體內(nèi)廣泛存在的二羧肽酶,能夠催化血管緊張素Ⅰ生成血管緊張素Ⅱ,同時(shí)使舒緩激肽降解引起機(jī)體血壓升高[1]。目前,市場上常用藥物如卡托普利、賴諾普利等ACE抑制劑類藥物易引起干咳、味覺障礙、皮疹等副作用[2],越來越多的學(xué)者開始從自然界中尋找安全高效的ACE抑制劑類藥物。

蠶蛹是蠶蛾科昆蟲家蠶蛾的蛹,是桑蠶產(chǎn)業(yè)的主要副產(chǎn)物。研究表明,蠶蛹富含蛋白質(zhì),且氨基酸比例適當(dāng),是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來源,其水解產(chǎn)物具有抗氧化、抗疲勞、降血壓等功能[3-6]。本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中已從蠶蛹蛋白酶解液中得到具有ACE抑制活性的肽P1和P2[7-8],本實(shí)驗(yàn)通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI TOF MS)確定氨基酸序列,并對其抑制動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究,最后運(yùn)用Sybyl軟件分別模擬所得肽與ACE活性位點(diǎn)結(jié)合情況,為蠶蛹源ACE抑制肽的工業(yè)化和應(yīng)用提供理論和技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料與設(shè)備

肽P1(Gly-Asn-Pro-Trp-Met)和P2(Asn-Arg-Tyr-Leu-Arg)從蠶蛹蛋白酶解產(chǎn)物中分離純化得到[8],確定其氨基酸序列后由上海吉爾生化有限公司合成(經(jīng)高效液相色譜法鑒定其純度98%以上)。

馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)美國Sigma公司;甲醇(色譜純)天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;賴諾普利(標(biāo)準(zhǔn)品)中國食品藥品檢定研究院;其他試劑均為分析純。

1260高效液相色譜儀美國安捷倫科技有限公司;SHZ-88水浴恒溫振蕩器金壇市醫(yī)療器械廠;4800基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1肽序列結(jié)構(gòu)鑒定將純化得到的肽P1和P2樣品配成超純水溶液用于鑒定其氨基酸序列。取1 μL樣品在MALDI靶板上點(diǎn)樣晾干后加入1 μLα-氰基-4-羥基肉桂酸溶液,并以不加樣品的α-氰基-4-羥基肉桂酸溶液為空白對照。儀器工作模式為:一級質(zhì)譜采用Refletor Positive,分子量為500～1500 u;二級質(zhì)譜采用1KV positive。采用正離子模式和自動(dòng)獲取數(shù)據(jù)的模式采集數(shù)據(jù)[9]。

1.2.2肽的固相合成按照鑒定出的肽的一級序列,采用固相合成法合成肽P1(Gly-Asn-Pro-Trp-Met)和P2(Asn-Arg-Tyr-Leu-Arg),該工作由上海吉爾生化有限公司完成,采用高效液相和電噴霧電離質(zhì)譜檢測合成肽的純度及分子量,經(jīng)高效液相色譜法鑒定其純度大于98%。

1.2.3抑制活性的測定根據(jù)呂汶駿等[7]檢驗(yàn)ACE抑制活性的方法并加以改進(jìn),將ACE、HHL用硼酸緩沖液(濃度為0.1 mol/L、pH8.3,含NaCl 0.3 mol/L)分別配制0.1 U/mL ACE溶液和5.8 mmol/L HHL溶液。取適量樣品、硼酸緩沖液和ACE溶液共460 μL于離心管中,在37 ℃條件下保溫10 min;再加入40 μL HHL溶液反應(yīng),1 h后加入1.0 mol/L HCl溶液100 μL中止反應(yīng),同時(shí)以不加樣品為空白樣。反應(yīng)液濾膜過濾后色譜分析。

使用Agilent 1260色譜系統(tǒng),色譜柱為ZORBAX SB C18色譜柱(4.0 mm×150 mm,5 μm);流動(dòng)相為甲醇∶水=15∶85(v/v)(含0.1%三氟乙酸);流速為1.0 mL/min;檢測波長為228 nm。根據(jù)空白和樣品反應(yīng)液中馬尿酸峰面積計(jì)算抑制率。

式中,A為空白反應(yīng)液中馬尿酸的峰面積,mAU;B為樣品反應(yīng)液中馬尿酸的峰面積,mAU。

1.2.4抑制肽與ACE可逆反應(yīng)類型判別根據(jù)1.2.3所述實(shí)驗(yàn)方法,在加樣和空白的反應(yīng)體系中,分別利用不同濃度ACE進(jìn)行反應(yīng)初速度檢測,并以賴諾普利為陽性對照。以ACE濃度[E]為橫坐標(biāo),反應(yīng)初速度(V0)為縱坐標(biāo)作圖,結(jié)合動(dòng)力學(xué)曲線特征推斷P1和P2對ACE的抑制類型。

1.2.5抑制肽對ACE抑制類型判別根據(jù)1.2.3所述實(shí)驗(yàn)方法,在HHL濃度分別為0.696、1.044、1.392、1.740、2.088 mmol/L的條件下,測定空白樣和樣品(P1、P2)濃度分別為20、40 μg/mL時(shí)ACE酶促反應(yīng)速度,以賴諾普利為陽性對照(濃度分別為0.0001 μg/mL和0.0002 μg/mL)。繪制底物濃度[S]和反應(yīng)初速度(V0)的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖判斷P1和P2對ACE的抑制類型。不同類型抑制劑具有不同的動(dòng)力學(xué)方程式,其中,非競爭性抑制劑的動(dòng)力學(xué)方程如式(1)所示,競爭性抑制劑的動(dòng)力學(xué)方程如式(2)所示[10],計(jì)算ACE米氏常數(shù)Km與P1和P2抑制常數(shù)Ki。

式(1)

式(2)

式中,V0-反應(yīng)初速度,mmol/(L·min);vmax-最大反應(yīng)速度,mmol/(L·min);[S]-底物HHL的濃度,mmol/L;[I]-ACE抑制肽的濃度,mmol/L;Km-米氏常數(shù)。

1.2.6抑制肽與ACE活性中心的模擬對接利用Sybyl X-2.1.1軟件構(gòu)建多肽分子,使用Powell方法在Tripos力場下進(jìn)行優(yōu)化,采用Gasteiger-Huckel算法對各原子賦予電荷,完成后對多肽進(jìn)行模擬退火計(jì)算搜索低能構(gòu)象,初始溫度為1000 K,冷卻溫度為100 K,高溫平衡時(shí)間為1000 fs,降溫時(shí)間為1000 fs,進(jìn)行10個(gè)循環(huán),對搜索到的低能構(gòu)象再進(jìn)行能量優(yōu)化,將得到的構(gòu)象進(jìn)行對接計(jì)算。

從PDB數(shù)據(jù)庫中下載ACE-賴諾普利復(fù)合物三維模型(代碼:1086)[11],使用Sybyl X-2.1.1的默認(rèn)流程進(jìn)行蛋白準(zhǔn)備,用MMFF99力場進(jìn)行分子優(yōu)化后加氫、加電荷,同樣采用Gasteiger-Huckel算法賦予電荷,為處理方便,刪除復(fù)合物中的所有水分子,使用Surflex-dock模式進(jìn)行對接,分子對接的原型分子是采用automatic模式產(chǎn)生的,其余參數(shù)為默認(rèn),每個(gè)對接分子保留20個(gè)構(gòu)象,選用Total_Score 打分最高的構(gòu)象進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1氨基酸序列的結(jié)構(gòu)鑒定

對蠶蛹蛋白中性蛋白酶水解產(chǎn)物分離得到的兩條肽進(jìn)行MALDI TOF MS解析。由圖1可知,它們的分子離子峰分別為604.31 u和721.34 u,通過解析得到P1氨基酸序列為Gly-Asn-Pro-Trp-Met(圖1a所示,b1～b5為肽P1的分子識別峰)、P2氨基酸序列為Asn-Arg-Tyr-Leu-Arg(圖1b所示,y1～y5為肽P2的分子識別峰),并對其ACE抑制活性進(jìn)行測定,得到IC50值分別為12.61 μg/mL(P1)和14.68 μg/mL(P2)。對目前有關(guān)蠶蛹蛋白源ACE抑制多肽的文獻(xiàn)進(jìn)行整理發(fā)現(xiàn)IC50值在5.01～47.00 μg/mL范圍內(nèi)[12-15],與這些多肽相比本實(shí)驗(yàn)中得到的蠶蛹蛋白源ACE抑制多肽具有較高的抑制活性。

圖1　抑制肽的MALDI TOF MS圖譜Fig.1　MALDI TOF MS spectrum of inhibitory peptide

2.2抑制肽對ACE可逆反應(yīng)類型判別

根據(jù)抑制劑與酶結(jié)合的特點(diǎn)和作用方式,可以將抑制劑分為可逆性抑制劑和不可逆性抑制劑。根據(jù)1.2.3的實(shí)驗(yàn)方法,以酶濃度[E]為橫坐標(biāo),反應(yīng)初速度(V0)為縱坐標(biāo)作圖,如圖2所示。當(dāng)反應(yīng)體系中不存在抑制劑時(shí),反應(yīng)速率曲線通過坐標(biāo)系原點(diǎn);當(dāng)反應(yīng)體系中分別加入P1、P2、賴諾普利后,反應(yīng)速率曲線通過原點(diǎn),但斜率比無抑制劑時(shí)減小,由此可以判斷P1、P2、賴諾普利對ACE均為可逆性抑制[16]。

圖2　抑制劑對ACE的抑制動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2　Inhibition kinetic curves of inhibitor on ACE

2.3抑制肽對ACE的抑制類型判別

根據(jù)抑制劑、底物和酶三者的相互關(guān)系,可逆抑制又可分為競爭性抑制、非競爭性抑制和反競爭性抑制三種類型。根據(jù)1.2.4所述實(shí)驗(yàn)方法,繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖,見圖3。加入P1的兩條速率曲線與沒有抑制劑的速率曲線相交于橫坐標(biāo)說明P1為非競爭性抑制劑(圖3a),加入P2、賴諾普利的兩條速率曲線與沒有抑制劑的速率曲線相交于縱坐標(biāo),說明P2、賴諾普利為競爭性抑制劑(圖3b和圖3c)。

圖3　抑制劑對ACE的Lineweaver-Burk圖Fig.3　Lineweaver-Burk plots of inhibitors against ACE

將圖3a～圖3c中的數(shù)值分別帶入到式(1)、式(2)中,得到ACE的米氏常數(shù)Km=2.45 mmol/L,與文獻(xiàn)值相差不大(2.6 mmol/L)[17]。同時(shí)得到P1的抑制常數(shù)Ki,1=0.037 mmol/L,P2的抑制常數(shù)Ki,2=0.020 mmol/L,賴諾普利的抑制常數(shù)Ki,3=0.99×10-7mmol/L。抑制劑的抑制常數(shù)越小,其對酶的抑制作用越強(qiáng)。和賴諾普利相比,肽P1和P2對ACE的抑制作用較弱,與IC50值趨勢相同。

2.4抑制肽與ACE活性中心的模擬對接

2.4.1對接結(jié)果分析分子對接方法是從已知結(jié)構(gòu)的受體(靶蛋白或活性位點(diǎn))和配體出發(fā),通過化學(xué)計(jì)量學(xué)方法模擬分子的幾何結(jié)構(gòu)和分子間相互作用力來進(jìn)行分子間相互作用識別并預(yù)測受體—配體復(fù)合物結(jié)構(gòu)的方法[18]。為了研究抑制肽與ACE的相互作用,使用Sybyl軟件中的Surflex-dock模塊將常用藥物賴諾普利、底物HHL及P1、P2與ACE進(jìn)行了分子對接,分子對接結(jié)果如圖4所示。

圖4　復(fù)合物的相互作用模型Fig.4　The interaction models of complex

在圖4a中賴諾普利與ACE的Glu162、Gln281、His353、Ala354、Lys511、Tyr520形成氫鍵,圖4b中HHL與ACE的Gln281、His353、Ala354、Lys511、His513、Tyr520形成氫鍵(圖4b),與文獻(xiàn)中的記錄吻合[19-20]。在圖4c中P1與ACE的Thr166、Gln281、Thr372、Asp377、Lys511、His513、Tyr520形成氫鍵,圖4d中P2與ACE的Gln281、Ala356、Glu403、Asp415、Lys511、Tyr520形成氫鍵。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,ACE活性中心主要由三部分構(gòu)成(S1,S2和S1’),其中S1由Ala354,Glu384和Tyr523等氨基酸殘基組成,S2由Gln281、His353、Lys511、His513和Tyr520等氨基酸殘基組成,而S1’僅由氨基酸殘基Glu62組成[21]。P1能夠與活性中心的Gln281、Lys511、His513和Tyr520形成氫鍵,P2能夠與活性中心的Gln281、Lys511和Tyr520形成氫鍵,與已報(bào)道的蠶蛹蛋白源ACE抑制肽Ala-Ser-Leu[12](與活性中心Gln281、His353和Ala354形成氫鍵)和Ala-Pro-Pro-Pro-Lys-Lys[15](與活性中心的Glu162和His353形成氫鍵)相比,P1和P2能夠占據(jù)較多活性中心的氨基酸殘基。

2.4.2分子疊加分析將對接后的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行疊加,如圖5所示,賴諾普利分子和HHL分子能夠重疊,說明與賴諾普利結(jié)合后的ACE不能與底物HHL繼續(xù)結(jié)合,從分子結(jié)構(gòu)上支持了賴諾普利屬于競爭性抑制劑[11]。同時(shí),P2也可以和HHL分子進(jìn)行疊合,而P1不能與HHL疊合,從分子結(jié)構(gòu)上證明P2為競爭性抑制劑,P1為非競爭性抑制劑,與2.3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖5　HHL、賴諾普利、P1、P2與1086結(jié)構(gòu)疊加Fig.5　Overlap of HHL,lisinopril,P1,P2 with 1086

3　結(jié)論

通過MALDI TOF MS對多肽序列進(jìn)行分析,得到P1氨基酸序列為Gly-Asn-Pro-Trp-Met,P2氨基酸序列為Asn-Arg-Tyr-Leu-Arg,其IC50分別為12.61 μg/mL和14.68 μg/mL。通過抑制動(dòng)力學(xué)曲線可知,P1、P2均為可逆性抑制;P1為非競爭性抑制劑,其抑制常數(shù)為Ki,1=0.037 mmol/L;P2為競爭性抑制劑,其抑制常數(shù)為Ki,2=0.020 mmol/L。分子對接結(jié)果表明,P1與ACE的Thr166、Gln281、Thr372、Asp377、Lys511、His513、Tyr520形成氫鍵;P2與ACE的Gln281、Ala356、Glu403、Asp415、Lys511、Tyr520形成氫鍵;與已報(bào)道的蠶蛹蛋白源ACE抑制多肽相比,可以占據(jù)更多ACE活性口袋中的氨基酸殘基。將對接后的分子進(jìn)行疊加,P1不能和HHL分子重合,P2可以和HHL分子重合,從分子水平上證明了P1為非競爭性抑制肽,P2為競爭性抑制肽。

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Inhibition mechanism of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide from silkworm pupa protein

WANG Chao-yang,ZHAO Zhong-xing*,TAO Meng-liang,WANG Xin-hui,SUN Hua-ju,WEI Ya-nan

(School of Chemistry and Chemical Engineering,Guangxi University,Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of New Technology and Application in Resource Chemical Engineering,Nanning 530004,China)

Basing on two angiotensin I-converting enzyme(ACE)inhibitory peptides(P1 and P2)which were purified before,the amino acid sequences of P1 and P2 were determined by MALDI TOF MS,and then they were synthesized by solid phase peptide synthesis. Subsequently,their inhibition kinetics was studied. Finally,their molecular dockings to ACE were studied by Sybyl,respectively. Results showed that P1 was Gly-Asn-Pro-Trp-Met with an IC50value of 12.61 μg/mL,which was a non-competitive inhibition peptide with a Ki,1value of 0.037 mmol/L,and P2 was Asn-Arg-Tyr-Leu-Arg with an IC50value of 14.68 μg/mL,which was a competitive inhibition peptide with a Ki,2value of 0.020 mmol/L,and both of them could form hydrogen bond with the residue amino acid in the active site of ACE. P1 and P2 could be used as functional food against hypertension,which provide a theoretical basis for further development and utilization of silkworm pupa protein.

silkworm pupa protein;angiotensin I-converting enzyme;inhibitory peptides;molecular docking;inhibition kinetics

2016-03-03

王朝陽(1990-)，男，碩士研究生，研究方向：生物化工，E-mail：wcyang14@163.com。

趙鐘興(1979-)，男，博士，副教授，研究方向：生物化工，E-mail：zzxx@gxu.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金(31401629)；廣西自然科學(xué)基金(2013GXNSFBA019031)；廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃(YCSZ2015026)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)17-0148-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.020