新疆家蠶抗菌肽在釀酒酵母中表達(dá)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)及活性分析

劉東亮,劉　軍,張富春

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆烏魯木齊 830046)

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新疆家蠶抗菌肽在釀酒酵母中表達(dá)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)及活性分析

劉東亮,劉軍,張富春*

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆烏魯木齊 830046)

本研究對(duì)新疆家蠶抗菌肽在釀酒酵母INVSc1菌株中分泌表達(dá)過(guò)程進(jìn)行了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)及活性測(cè)定。結(jié)果表明,選擇培養(yǎng)基中酵母表現(xiàn)為典型的S型生長(zhǎng)曲線;誘導(dǎo)培養(yǎng)基中酵母表現(xiàn)為波浪式緩慢上升的曲線,上升的時(shí)間和速度與酵母的初始接菌密度有關(guān)。誘導(dǎo)過(guò)程補(bǔ)加少量20%半乳糖誘導(dǎo)劑可以明顯抑制酵母的生長(zhǎng),同時(shí),酵母細(xì)胞平板計(jì)數(shù)結(jié)果也表明補(bǔ)加半乳糖使釀酒酵母出芽增殖減緩,菌落計(jì)數(shù)減少。研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)過(guò)程補(bǔ)加半乳糖不僅可以使發(fā)酵液中總蛋白的含量提高約50%,還可以使酵母分泌蛋白的時(shí)間提前?？咕鷮?shí)驗(yàn)表明,抗菌肽對(duì)大腸桿菌抑菌效果較好,發(fā)酵液上清對(duì)大腸桿菌的最大抑菌圈直徑為52 mm;對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性較弱,最大抑菌圈直徑為20 mm。

新疆家蠶抗菌肽,釀酒酵母,蛋白表達(dá),抑菌活性

抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類具有生物活性的小分子多肽,作為抵御病原體入侵的第一道防線,是生物體天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分[1-4]。通常所說(shuō)的抗菌肽一般為陽(yáng)離子抗菌肽(Cationic antimicrobial peptides,CAMPs),由12～50個(gè)氨基酸組成,帶有2個(gè)以上的正電荷以及50%左右的疏水氨基酸組分[5]。家蠶抗菌肽是世界上第一個(gè)被分離鑒定的抗菌肽,1980年由Hultmark等[6-7]從惜古比天蠶的蠶蛹中分離得到,并將其命名為cecropin。截至2016年5月,國(guó)際權(quán)威抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)APD(http://aps.unmc.edu/AP/main.php)共收錄了世界范圍內(nèi)2706條抗菌肽,它們大多具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤、抗寄生蟲(chóng)等多種生物活性[8-9]。

新疆家蠶抗菌肽(CecropinXJ),屬于cecropin B家族,是一種典型的兩親性α-螺旋陽(yáng)離子抗菌肽,其分子量約為4080 u,由37個(gè)氨基酸殘基組成[10]。新疆家蠶抗菌肽基因cecropinXJ首先由李金耀等[11]從新疆家蠶品種新蠶三號(hào)組織中經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)的方法獲得,并構(gòu)建到原核表達(dá)載體,在大腸桿菌BL21細(xì)胞中成功表達(dá)。此外cecropinXJ基因被劉忠淵[12-13]、夏麗潔[14]等構(gòu)建到真核表達(dá)載體并分別在畢赤酵母和釀酒酵母中高效表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物具有較好的抗細(xì)菌、耐高溫、耐高鹽、耐酸堿,以及低溶血等生物活性。

酵母系統(tǒng)表達(dá)抗菌肽的優(yōu)勢(shì)在于其不僅可以使抗菌肽進(jìn)行分泌表達(dá),利于后期的分離純化,還可以在抗菌肽表達(dá)后對(duì)其進(jìn)行翻譯后加工、糖鏈合成[13]以及羧基端酰胺化[15]等修飾工作,最大程度保留了抗菌肽自身的理化特性。本研究利用釀酒酵母INVSc1菌株分泌表達(dá)CecropinXJ,探討了發(fā)酵種子接種密度以及發(fā)酵過(guò)程增補(bǔ)誘導(dǎo)劑對(duì)抗菌肽發(fā)酵以及酵母自身生長(zhǎng)的影響,為新疆家蠶抗菌肽發(fā)酵條件的優(yōu)化和工業(yè)生產(chǎn)提供參考資料。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

pYES2/CT/αFactor-cecropinXJ家蠶抗菌肽重組表達(dá)質(zhì)粒以及含有該重組質(zhì)粒的釀酒酵母INVSc1株由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保藏[14];大腸桿菌EscherichiacoliDH5α和金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus測(cè)試菌株本實(shí)驗(yàn)室保藏。SD選擇培養(yǎng)基(尿嘧啶缺陷型,Ura-),誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Ura-)培養(yǎng)基均購(gòu)自Clontech公司;BCA Protein Assay Kit購(gòu)自TIANGEN公司;96微孔ELISA板購(gòu)自JET BIOFIL公司;其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

牛津杯(6 cm×8 cm×10 mm)東臺(tái)市吉泰不銹鋼制品廠;Benchmark Plus微孔板分光光度計(jì)BIO-RAD公司;SORVALL LYNX 6000高速離心機(jī)Thermo Scientific公司;ZHWY-111C恒溫培養(yǎng)振蕩器上海智城分析儀器制造有限公司;GNP-9050型隔水式恒溫培養(yǎng)箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;-80 ℃超低溫冰箱SANYO公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1酵母培養(yǎng)根據(jù)invitrogen公司酵母實(shí)驗(yàn)手冊(cè)進(jìn)行酵母的培養(yǎng)及誘導(dǎo)[16]。取-80 ℃保存的含有pYES2/CT/αFactor-cecropinXJ重組質(zhì)粒的釀酒酵母INVSc1菌種在固體選擇培養(yǎng)基(Ura-)上劃線,30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。挑取酵母單克隆接種于15 mL液體選擇培養(yǎng)基中(Ura-),30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)30 h。將酵母培養(yǎng)物接種于50 mL的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(Ura-),30 ℃恒溫振蕩過(guò)夜培養(yǎng),1500×g離心10 min,棄上清。將收集的酵母細(xì)胞重懸于100 mL新鮮的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(Ura-),并調(diào)整酵母細(xì)胞在培養(yǎng)基中的光密度值(OD600)為0.4和0.8各2瓶,30 ℃恒溫培養(yǎng)振蕩器培養(yǎng)136 h。培養(yǎng)至36 h時(shí)，分別在1#和3#酵母培養(yǎng)體系中補(bǔ)加少量20%無(wú)菌半乳糖溶液；培養(yǎng)至92 h時(shí)，1#，2#，3#，4#酵母培養(yǎng)體系均補(bǔ)充加入少量的20%無(wú)菌半乳糖溶液。

1.2.2酵母生長(zhǎng)曲線的測(cè)定采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定酵母懸液OD值并繪制酵母的生長(zhǎng)曲線[17]。取酵母單克隆接種于液體選擇培養(yǎng)基(Ura-),30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)30 h,每隔3 h取酵母培養(yǎng)物測(cè)定OD600光密度值,繪制酵母生長(zhǎng)曲線。將酵母培養(yǎng)物接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基,為了研究起始接菌密度對(duì)酵母又到表達(dá)時(shí)間的影響,調(diào)整酵母細(xì)胞在培養(yǎng)基中的光密度值(OD600)分別為0.4和0.8[16],30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),分別收集0,2,4,8,12,16,20,24,28,32 h酵母培養(yǎng)物測(cè)定OD600光密度值,繪制抗菌肽誘導(dǎo)階段的酵母生長(zhǎng)曲線。

1.2.3酵母計(jì)數(shù)采用倍比稀釋法進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)[18-19]。取誘導(dǎo)時(shí)間為0,4,12,24,36,44,68 h的酵母培養(yǎng)物,分別用誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Ura-)稀釋10-3,10-4和10-5不同倍數(shù),取10 μL稀釋液滴加到固體選擇培養(yǎng)基(Ura-)上,置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),每個(gè)稀釋梯度計(jì)數(shù)3次。

1.2.4發(fā)酵液蛋白質(zhì)含量的測(cè)定分別取誘導(dǎo)時(shí)間為0,2,4,8,12,16,20,24,28,32,36,40,44,52,68,76,84,92,100,112,124,136 h的酵母發(fā)酵液1 mL,1500×g離心10 min,收集上清。用BCA法[20]測(cè)定不同誘導(dǎo)時(shí)間發(fā)酵液中總蛋白在562 nm處吸光度。

1.2.5發(fā)酵液抑菌活性的測(cè)定分別取誘導(dǎo)時(shí)間為0,4,12,36,52,76 h的酵母發(fā)酵液1 mL,1500×g離心10 min,收集上清,用0.22 μm的無(wú)菌濾膜進(jìn)行過(guò)濾。采用牛津杯抑菌圈法[21]檢測(cè)不同發(fā)酵時(shí)期發(fā)酵液中抗菌肽對(duì)E.coliDH5α和S.aureus細(xì)菌的抑制效果,每個(gè)牛津杯中加入100 μL濾出液。

1.2.6數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Mean±SD表示(n=4),采用單因素方差分析,所有統(tǒng)計(jì)計(jì)算均采用GraphPad Prism 6(version 6.01)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析,p<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果與分析

2.1誘導(dǎo)前后酵母細(xì)胞生長(zhǎng)情況的監(jiān)測(cè)

挑取4個(gè)釀酒酵母單克隆,分別在15 mL選擇培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)30 h,對(duì)酵母不同生長(zhǎng)階段的菌體密度進(jìn)行分光光度計(jì)測(cè)定,并繪制了酵母的生長(zhǎng)曲線圖,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知,0～6 h為延滯期,6～27 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,27 h時(shí)培養(yǎng)物在600 nm處的吸光值達(dá)到最大,OD600為1.1。盡管釀酒酵母的生殖方式屬于出芽生殖,不同于細(xì)菌的二分裂繁殖,但本研究中檢測(cè)到的釀酒酵母INVSc1菌株的生長(zhǎng)曲線類似于細(xì)菌典型的S2型曲線。

圖1　釀酒酵母在選擇培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況(n=4)Fig. 1　The growth curve of Saccharomyces cerevisiae INVSc1 strain in selective medium(n=4)

將選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的釀酒酵母接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基。酵母細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的初始濃度OD600分別設(shè)定為0.4和0.8兩個(gè)水平,比較誘導(dǎo)過(guò)程初始菌體濃度對(duì)抗菌肽發(fā)酵的影響。選取0,2,4,8,12,16,20,24,28,32,36,40,44,52,68,76,84,92,100,112,124,136 h時(shí)間點(diǎn),對(duì)釀酒酵母在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況進(jìn)行了監(jiān)測(cè),結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知,釀酒酵母在誘導(dǎo)過(guò)程中菌體密度增大。當(dāng)初始光密度值為0.8時(shí),3#和4#酵母培養(yǎng)物24 h后菌體密度開(kāi)始明顯增加;當(dāng)OD600為0.4時(shí),1#和2#酵母培養(yǎng)物培養(yǎng)52 h后菌體密度才開(kāi)始緩慢增加。整體而言,酵母光密度值增加水平不如在選擇培養(yǎng)基中增加明顯,為了說(shuō)明誘導(dǎo)過(guò)程是否影響了酵母的增殖,分別在1#和3#單克隆菌株培養(yǎng)至36 h時(shí)補(bǔ)充加入少量20%無(wú)菌半乳糖溶液,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與加入等量無(wú)菌水的2#和4#單克隆菌株相比,半乳糖的加入明顯降低了酵母的吸光值。當(dāng)培養(yǎng)至92 h時(shí),1#,2#,3#,4#酵母培養(yǎng)體系均補(bǔ)充加入少量的20%無(wú)菌半乳糖溶液,隨后4個(gè)培養(yǎng)體系中的酵母光密度值均發(fā)生了明顯降低。這些結(jié)果表明誘導(dǎo)過(guò)程影響了酵母細(xì)胞的增殖。

圖2　釀酒酵母在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況Fig.2　The growth curve of Saccharomyces cerevisiae INVSc1 strain in induction medium注:1#,2#,3#,4# 代表來(lái)源于不同的酵母單克隆。

2.2發(fā)酵液中酵母細(xì)胞數(shù)目的監(jiān)測(cè)

為了直觀反映誘導(dǎo)培養(yǎng)基中酵母生長(zhǎng)情況的變化,對(duì)不同誘導(dǎo)時(shí)間的發(fā)酵液稀釋不同倍數(shù),在四分區(qū)的培養(yǎng)板上進(jìn)行酵母細(xì)胞計(jì)數(shù)。選擇對(duì)1#和4#培養(yǎng)體系中的細(xì)胞分別進(jìn)行計(jì)數(shù),酵母在平板上的生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖3和圖4,菌落計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)見(jiàn)圖5。

圖3　1#釀酒酵母在不同誘導(dǎo)時(shí)間的菌落計(jì)數(shù)Fig.3　The colony counting of Saccharomyces cerevisiae 1# at different induction periods注:0,4,12,24,36,44,68代表不同誘導(dǎo)時(shí)間(h);10-3,10-4,10-5代表稀釋倍數(shù)，圖4同。

圖4　4#釀酒酵母在不同誘導(dǎo)時(shí)間的菌落計(jì)數(shù)Fig.4　The colony counting of Saccharomyces cerevisiae 4# at different induction periods

如圖3和圖4所示,當(dāng)稀釋度為10-3時(shí),仍可以看到固體培養(yǎng)基生長(zhǎng)了大量的酵母單克隆,不利于細(xì)胞計(jì)數(shù);當(dāng)稀釋度為10-4和10-5,可以清晰地分辨固體培養(yǎng)基生長(zhǎng)的酵母單克隆,利于酵母細(xì)胞計(jì)數(shù)。分別對(duì)1#和4#培養(yǎng)體系稀釋度為10-4和10-5的酵母發(fā)酵液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)(表1所示),并繪制了不同誘導(dǎo)時(shí)間的菌落數(shù)變化曲線圖,結(jié)果見(jiàn)圖5。圖5顯示,當(dāng)稀釋度為10-4時(shí),誘導(dǎo)4 h,1#培養(yǎng)體系中酵母細(xì)胞的數(shù)目增多,4#培養(yǎng)體系中酵母細(xì)胞的數(shù)目明顯減少;4～68 h內(nèi)的計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,1#培養(yǎng)體系中酵母細(xì)胞的數(shù)目先減少,后維持大致一致,4#培養(yǎng)體系中酵母細(xì)胞的數(shù)目呈現(xiàn)緩慢增加的趨勢(shì),這與圖2中相同時(shí)間段內(nèi)反映的結(jié)果一致。

圖5　釀酒酵母在不同誘導(dǎo)時(shí)間的菌落數(shù)變化折線圖Fig.5　The counting curve of Saccharomyces cerevisiae at different induction periods注:1#,4#代表來(lái)源于不同的酵母單克隆;10-4,10-5代表稀釋倍數(shù)。

2.3發(fā)酵液中總蛋白含量的監(jiān)測(cè)

與非誘導(dǎo)培養(yǎng)相比,誘導(dǎo)過(guò)程中酵母細(xì)胞生長(zhǎng)受限,數(shù)目緩慢增加,表明其細(xì)胞內(nèi)的代謝過(guò)程發(fā)生了微妙的變化。誘導(dǎo)過(guò)程中,蛋白質(zhì)的表達(dá)是酵母細(xì)胞的主要生命活動(dòng)。因此,本研究用BCA法分別對(duì)1#,2#,3#,4#酵母培養(yǎng)體系的總蛋白含量進(jìn)行了連續(xù)監(jiān)測(cè)繪成曲線,如圖6所示,2#培養(yǎng)體系中總蛋白的含量在52 h之后才出現(xiàn)明顯增加;4#培養(yǎng)體系總蛋白含量在36 h后就出現(xiàn)明顯增加,這可能與兩種培養(yǎng)體系中初始酵母光密度值不同有關(guān)。盡管1#和3#兩種培養(yǎng)體系的初始酵母光密度值也不同,但二者總蛋白的含量在36 h之后都發(fā)生了非常顯著增加,表明半乳糖的補(bǔ)充使酵母分泌蛋白的時(shí)間提前。40 h時(shí),1#和3#兩種培養(yǎng)體系總蛋白在562 nm的吸光值幾乎比36 h時(shí)增加了50%,這種增加趨勢(shì)一直持續(xù)到70 h左右才出現(xiàn)降低,這與1#和3#培養(yǎng)體系在36 h補(bǔ)充加入少量半乳糖誘導(dǎo)劑有關(guān)。同時(shí)注意到,補(bǔ)充誘導(dǎo)劑的效應(yīng)遠(yuǎn)大于初始酵母光密度值差異的效應(yīng)。所以盡管1#和3#培養(yǎng)體系初始酵母光密度值存在差異,但在同時(shí)補(bǔ)充半乳糖后,二者總蛋白含量被提升到了同樣高的水平。類似地,在92 h第二次補(bǔ)加半乳糖以后,四個(gè)培養(yǎng)體系中總蛋白質(zhì)的含量又出現(xiàn)了反彈上升。

圖6　酵母誘導(dǎo)過(guò)程中發(fā)酵液總蛋白含量變化情況Fig.6　Evaluation of the protein content in medium during induction periods注:1#,2#,3#,4# 代表來(lái)源于不同的酵母單克隆。

2.4發(fā)酵液抗菌活性的監(jiān)測(cè)

本研究對(duì)新疆家蠶抗菌肽酵母發(fā)酵液的抗細(xì)菌活性進(jìn)行了測(cè)定,測(cè)試菌株為常見(jiàn)的革蘭氏陰性菌E.coli和革蘭氏陽(yáng)性菌S.aureus。結(jié)果如圖7所示,不同誘導(dǎo)時(shí)間的抗菌肽發(fā)酵液對(duì)E.coli均具有明顯的抑菌活性,0,4,36,44,68、76 h的抑菌圈較大,其中0 h抑菌圈可能與抗菌肽本底表達(dá)有關(guān);抗菌肽發(fā)酵液對(duì)S.aureus的抑菌活性沒(méi)有對(duì)E.coli的抑菌活性高,僅44,68、76 h的誘導(dǎo)發(fā)酵液顯示出較大的抑菌圈,這可能與發(fā)酵液中抗菌肽的有效濃度以及S.aureus對(duì)抗菌肽的敏感度有關(guān)。抑菌圈直徑大小見(jiàn)圖8。

圖7　酵母發(fā)酵液上清對(duì)不同細(xì)菌抑菌效果的評(píng)價(jià)Fig.7　The antimicrobial effects of fermentation liquor on E.coli and S.aureus注:0,4,12,24,36,44,68,76代表不同誘導(dǎo)時(shí)間發(fā)酵液(h)。

圖8　不同誘導(dǎo)時(shí)間酵母發(fā)酵液上清的抑菌圈柱形圖Fig.8　The inhibitory zone of fermentation liquor on E.coli and S.aureus

3　結(jié)論

微生物的生長(zhǎng)、發(fā)酵及代謝產(chǎn)物的積累受到培養(yǎng)基類型、誘導(dǎo)劑、溫度、通氣量、培養(yǎng)時(shí)間等諸多非生物因素的影響[22]。前期研究,夏麗潔等[14]對(duì)釀酒酵母系統(tǒng)表達(dá)Cecropin XJ進(jìn)行了優(yōu)化及搖瓶培養(yǎng),本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步討論了酵母初始接種量以及誘導(dǎo)過(guò)程中補(bǔ)加誘導(dǎo)劑對(duì)酵母生長(zhǎng)和抗菌肽發(fā)酵的影響,以期為酵母培養(yǎng)和Cecropin XJ的發(fā)酵生產(chǎn)提供參考。

首先對(duì)釀酒酵母生產(chǎn)菌株INVSc1在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況進(jìn)行了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),初步掌握了酵母在不同生產(chǎn)階段的增殖情況;然后對(duì)發(fā)酵階段不同時(shí)期的酵母數(shù)目進(jìn)行了平板菌落計(jì)數(shù)。酵母在發(fā)酵過(guò)程中,細(xì)胞機(jī)能常會(huì)出現(xiàn)退化、增殖力下降、自溶等現(xiàn)象,造成酵母數(shù)量的減少[23];另一方面抗菌肽表達(dá)并分泌到培養(yǎng)基中,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)以及抗菌肽的積累很可能對(duì)酵母細(xì)胞也產(chǎn)生一定的毒害作用,因此造成發(fā)酵階段酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程受到抑制[24]。另外,發(fā)酵液中總蛋白的含量并不是在誘導(dǎo)一開(kāi)始就快速增加,而是在經(jīng)過(guò)一段調(diào)整期之后才開(kāi)始增加,本研究發(fā)現(xiàn)初期酵母接菌量的多少直接影響到調(diào)整期的長(zhǎng)短,初始接種密度為0.8比接種密度0.4的調(diào)整期縮短近16 h(圖6)。誘導(dǎo)期間隨著時(shí)間的延長(zhǎng),誘導(dǎo)劑被不斷消耗,抗菌肽的發(fā)酵也會(huì)受到影響。因此,本研究討論了誘導(dǎo)過(guò)程補(bǔ)加誘導(dǎo)劑的作用,我們發(fā)現(xiàn)補(bǔ)加誘導(dǎo)劑不僅可以縮短調(diào)整期,還可以有效促進(jìn)酵母細(xì)胞的蛋白表達(dá)和分泌,補(bǔ)加誘導(dǎo)劑后可以使抗菌肽的高效表達(dá)維持30 h(圖6)左右,所以誘導(dǎo)過(guò)程中補(bǔ)加一定量的半乳糖誘導(dǎo)劑十分必要,如果發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng),建議30 h補(bǔ)加一次半乳糖。

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Real-time monitoring the Cecropin XJ expression inSaccharomycescerevisiaeand evaluation of antibacterial activity

LIU Dong-liang,LIU Jun,ZHANG Fu-chun*

(Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering,College of Life Science and Technology,Xinjiang University,Urumqi 830046,China)

In the present study,the expression process of Cecropin XJ in INVSc1 strain ofSaccharomycescerevisiaewas real-timely monitored. Firstly,the growth states of yeast in SD selective medium(Ura-)and induction medium were measured,respectively. The result showed that a sigmoid growth curve and a wave-like rising curve were respectively observed in selective medium and induction medium. During the induction process,the rising rate of growth curve was related to the cell density at the beginning of induction. Furthermore,the growth of yeast was obviously suppressed after refilling some 20% galactose in induction culture. Similarly,the plate colony-counting assay indicated that galactose supplement lead to the decrease of yeast proliferation and colony numbers during the induction phase. Additionally,galactose supplement not only increased the protein content by 50% in the culture,but accelerated the protein secretion from yeast. The antibacterial assay revealed that the expression product exerted a significantly bactericidal ability againstE.coliwith the biggest inhibitory zone diameter of 52 mm,and a weak ability againstS.aureuswith a inhibitory zone diameter of 20 mm.

Cecropin XJ;Saccharomycescerevisiae;protein expression;antimicrobial activity

2016-03-01

劉東亮(1984-)，男，博士研究生，研究方向：新疆家蠶抗菌肽，E-mail：biove1986@126.com。

張富春(1962-)，男，博士，教授，研究方向：新疆生物資源的開(kāi)發(fā)及利用，E-mail：zfcxju@qq.com。

新疆維吾爾族自治區(qū)高新技術(shù)研究和發(fā)展項(xiàng)目(201110101)；新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金(XJDX0201-2014-02)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)17-0129-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.016