酶解蝦副產(chǎn)物制備抗氧化肽的研究

劉亞楠,王延輝,亞力坤江·阿山,錢炳俊,姚曉敏,張建華,鐘耀廣,*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306;2.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院,上海 200240)

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酶解蝦副產(chǎn)物制備抗氧化肽的研究

劉亞楠1,王延輝2,亞力坤江·阿山2,錢炳俊2,姚曉敏2,張建華2,鐘耀廣1,*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306;2.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院,上海 200240)

以蝦副產(chǎn)物為原料,采用α-胰凝乳蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶進(jìn)行酶解制備抗氧化肽。酶解液經(jīng)透析、Sephadex G-15凝膠過(guò)濾層析、離子交換色譜和反向高效液相色譜分離,以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力和鐵離子還原能力(FRAP)為指標(biāo)進(jìn)行純化,得到了高抗氧化活性組分F1。質(zhì)譜分析結(jié)果表明組分F1中有三個(gè)肽,對(duì)這三個(gè)肽進(jìn)行序列合成并測(cè)定其活性,發(fā)現(xiàn)十肽GCKVALIVVG的活性最高,其DPPH自由基清除能力按抗壞血酸當(dāng)量計(jì)(AAE)為(16.10±0.02) μmol AAE/g pro,鐵離子還原能力為(245.37±0.03) μmol AAE/g pro。本實(shí)驗(yàn)研究制備并分離純化得到高活性的抗氧化肽,為蝦副產(chǎn)物的生產(chǎn)應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

蝦副產(chǎn)物,酶解,分離純化,抗氧化肽

氧化反應(yīng)會(huì)對(duì)食品和生物系統(tǒng)產(chǎn)生很多不利的影響,是引起食品腐敗,營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)下降和食品安全的重要原因[1]。近些年,抗氧化劑在國(guó)內(nèi)外得到蓬勃的發(fā)展,用途越來(lái)越廣泛。不僅用于含脂肪食品的抗氧化防御,而且作為功能因子用于保健食品及化妝品等的開(kāi)發(fā)[2]。人工合成的抗氧化劑因具有潛在的副作用而受到限制[3],因此天然、無(wú)毒副作用的食源性抗氧化肽的研究成為熱點(diǎn)。

我國(guó)蝦類資源極為豐富,2015年我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量超過(guò)120萬(wàn)t。在蝦仁加工業(yè)飛速發(fā)展的同時(shí),產(chǎn)生了大量副產(chǎn)物,這既造成了生物資源的浪費(fèi),又污染了環(huán)境。蝦副產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量較高,如果能選用合適的酶對(duì)其進(jìn)行酶解制備抗氧化肽,將提高蝦副產(chǎn)物的利用價(jià)值[4],變廢為寶。

抗氧化肽構(gòu)效關(guān)系(QSAR)的研究發(fā)現(xiàn),抗氧化活性強(qiáng)的肽鏈N端氨基酸大多高度疏水且電荷數(shù)較低,比如丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸和亮氨酸[5];中心位置氨基酸可以形成較多的氫鍵,如精氨酸,賴氨酸和組氨酸[6]。另外,酪氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、賴氨酸和色氨酸都與抗氧化功能有關(guān),其中C末端為酪氨酸或色氨酸等芳香族氨基酸的小肽有很強(qiáng)的抗氧化活性[7]。α-胰凝乳蛋白酶優(yōu)先剪切羧基端為酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的肽鍵,嗜熱菌蛋白酶則從疏水性氨基酸殘基的N-側(cè)水解。因此,選擇這兩種酶組合水解應(yīng)能夠獲得抗氧化活性較高的肽段。本實(shí)驗(yàn)借鑒QSAR研究成果,選擇α-胰凝乳蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶對(duì)蝦副產(chǎn)物進(jìn)行酶解,并通過(guò)透析、凝膠過(guò)濾層析、離子交換色譜和反相高效液相色譜(RP-HPLC)進(jìn)行分離純化,制備得到活性高的抗氧化肽。實(shí)現(xiàn)了蝦副產(chǎn)物資源的充分利用,為抗氧化肽的制備提供新途徑。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

南美白對(duì)蝦上海海旭水產(chǎn)有限公司;α-胰凝乳蛋白酶(10000 U/mg protein)、嗜熱菌蛋白酶(175 U/mg protein)、三硝基苯磺酸(TNBS)、HPLC標(biāo)準(zhǔn)肽混合物H2016、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;透析袋美國(guó)Spectrum公司;Sephadex G-15、DEAE Sephacel美國(guó)GE公司;乙腈(色譜級(jí))德國(guó)Merck Millipore公司;三氟乙酸(TFA)、鄰苯二甲醛(OPA)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

多功能粉碎機(jī)上海正慧工貿(mào)公司;恒溫水浴鍋上海齊欣儀器公司;恒溫干燥箱德國(guó)Binder公司;臺(tái)式pH計(jì)瑞士Mettler-Toledo公司;5424型高速冷凍離心機(jī)德國(guó)Eppendorf公司;UVmini-1240型分光光度計(jì)日本Shimadzu公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、電腦數(shù)顯恒流泵、自動(dòng)部份收集器上海滬西分析儀器廠;高效液相色譜系統(tǒng)(600 Controller 泵;717 plus自動(dòng)進(jìn)樣器;2996紫外檢測(cè)器;Anpel LAG-5000G無(wú)油空氣發(fā)生器)美國(guó)Waters公司;酶標(biāo)儀瑞士帝肯公司;納升液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀德國(guó)Bruke Dionex公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1原料準(zhǔn)備將南美白對(duì)蝦剝除蝦仁后將剩余的蝦頭與蝦殼洗凈,放于恒溫干燥箱中60 ℃烘16 h,用多功能粉碎機(jī)粉碎,并過(guò)60目篩。

1.2.2蝦副產(chǎn)物總蛋白最佳提取時(shí)間的確定稱取0.4 g的蝦殼粉,加入6 mL磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L,pH8.0)中,37 ℃搖床分別孵育0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4和6 h。利用Bradford試劑盒測(cè)定總蛋白液濃度[8]。

1.2.3最佳酶解時(shí)間的確定采用α-胰凝乳蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶依次水解上述蝦副產(chǎn)物蛋白提取液。首先添加1.12%(w/w)的α-胰凝乳蛋白酶于pH8.0、37 ℃條件下對(duì)蛋白液分別酶解0.25、0.5、1、2、4和6 h,測(cè)定蛋白水解度(DH)。確定α-胰凝乳蛋白酶的最佳酶解時(shí)間。然后,對(duì)其酶解液進(jìn)行第二步酶解。添加0.56%(w/w)的嗜熱菌蛋白酶于pH8.0,70 ℃分別酶解1、2、4、6、8 h,以DH為指標(biāo)選取最佳酶解時(shí)間。

DH的測(cè)定參考Adler-Nissen[9]方法并進(jìn)行修改:取0.1 mL酶解液樣品于試管中,加入2.2 mL磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L,pH 8.2)和2 mL 0.1% TNBS溶液混勻,50 ℃避光水浴1 h。加入4 mL 0.1 mol/L鹽酸終止反應(yīng),室溫靜置30 min,于340 nm測(cè)定混合液吸光值。以不同濃度的L-亮氨酸替代樣品,作標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照下式計(jì)算[10]:

式中:ht為反應(yīng)后氨基態(tài)氮濃度(mmol/g);h0為反應(yīng)前氨基態(tài)氮濃度(mmol/g);htot為每克原料蛋白的肽鍵毫摩爾數(shù)(mmol/g),蝦副產(chǎn)物的htot=8.073 mmol/g[11]。

1.2.4抗氧化肽的分離純化

1.2.4.1透析將上述酶解液依次利用1000 u和500 u的CE透析袋于去離子水中進(jìn)行透析12 h,每4 h換液1次。取<500 u和500～1000 u兩種組分,分別測(cè)定兩組分的抗氧化活性,方法見(jiàn)1.2.6。選擇活性較高的組分進(jìn)行下一步分離純化。

1.2.4.2凝膠過(guò)濾層析將上述組分經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后,用Sephadex G-15(1.6 cm×90 cm)凝膠柱層析分離,上樣量為1 mL。洗脫液為去離子水,流速為0.5 mL/min,每管按3 mL收集,共收集100管,于214 nm檢測(cè)[12]。測(cè)定各洗脫峰的抗氧化活性,選取抗氧化活性高的組分,進(jìn)行下一步分離純化。

1.2.4.3離子交換色譜將洗脫峰收集后濃縮,用于離子交換色譜,上樣量為2 mL。洗脫液為NaCl溶液(溶解在0.05 mol/L,pH8.0 Tris-HCl緩沖液中),流速為0.8 mL/min,每管收集4 mL,按表1進(jìn)行洗脫,于214 nm檢測(cè)其吸光值。收集各峰,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后檢測(cè)活性,選取活性較高的組分進(jìn)行下一步分離純化。

表1　DEAE Sephacel離子交換色譜洗脫程序

1.2.4.4RP-HPLC將抗氧化活性較強(qiáng)的洗脫峰收集后,采用RP-HPLC進(jìn)一步分離。色譜條件:C18反相色譜柱Inersil ODS-3(4.5 nm×250 nm),檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm;流動(dòng)相:A液,0.05% TFA超純水;B液,0.05% TFA+100% CH3CN,以A、B液各50%進(jìn)行洗脫,流速0.5 mL/min。

1.2.4.5質(zhì)譜分析采用納升液相色普-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)抗氧化肽組分G1-2-1進(jìn)行鑒定,實(shí)驗(yàn)條件如下:色譜條件:使用Thermofisher Dionex C18柱(150 mm×75 um,3 μm)作為色譜柱,流動(dòng)相分別為含0.1%葉酸的乙腈溶液和含0.1%葉酸的雙蒸水(過(guò)0.22 μm的水系濾膜),實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫的方式,流速為250 nL/min;柱后按分流比為1∶50進(jìn)行分流;監(jiān)測(cè)和記錄205～400 nm范圍內(nèi)的紫外光譜;柱溫為58 ℃。質(zhì)譜條件:負(fù)離子模式檢測(cè);檢測(cè)范圍350～1500 m/z;樣品孔電壓20 V;源毛細(xì)管電壓2100 V;MCP檢測(cè)電壓2100 V;噴霧氣流量設(shè)為2 L/min;脫溶劑的氣流量設(shè)為350 L/h;脫溶劑溫度設(shè)為150 ℃;離子源溫度是100 ℃;序列搜索軟件:mascot2.4。

1.2.5多肽含量的測(cè)定根據(jù)Church[13]的OPA方法進(jìn)行改進(jìn):將40 mg OPA溶于1 mL甲醇中,與2.5 mL 20%(w/w)SDS溶液和25 mL 0.1 mol/L四硼酸鈉溶液混合,并添加0.1 mLβ-羥基乙醇,最后用去離子水定容至50 mL,制成OPA溶液。將50 μL組分與2 mL OPA液混合,室溫反應(yīng)2 min,立即于340 nm下測(cè)定吸光值。

1.2.6抗氧化活性的測(cè)定

1.2.6.1DPPH自由基清除率參照Saiga等[14]的方法進(jìn)行測(cè)定,并將結(jié)果表示為抗壞血酸(AAE)當(dāng)量。

1.2.6.2鐵離子還原能力(FRAP)參照Benzie等[15]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7多肽的合成確認(rèn)抗氧化肽的氨基酸序列之后,通過(guò)吉爾生化上海有限公司按測(cè)定多肽序列進(jìn)行合成,方法采用固相多肽合成技術(shù)[16]。合成多肽后,對(duì)其進(jìn)行抗氧化活性鑒定。

1.2.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)了三次平行實(shí)驗(yàn),每次平行實(shí)驗(yàn)設(shè)置三組平行。利用IBM SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,p<0.05表示具有顯著性差異。

2　結(jié)果與討論

2.1蝦副產(chǎn)物總蛋白提取時(shí)間優(yōu)化

選取不同濃度的小牛血清蛋白(BSA)在562 nm處測(cè)定吸收值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1,蝦副產(chǎn)物總蛋白濃度隨時(shí)間變化見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示,隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng),水溶性蝦蛋白濃度逐漸上升,1.5 h時(shí)水溶性蝦蛋白濃度達(dá)到23.14%±0.01%,2 h時(shí)水溶性蝦蛋白濃度為23.49%±0.01%,此后3、4、6 h得到的水溶性蝦蛋白濃度無(wú)顯著增長(zhǎng)(p>0.05)。故選取2 h為蝦蛋白提取時(shí)間。

圖1　BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of BSA concentration

圖2　不同時(shí)間下蝦副產(chǎn)物總蛋白濃度曲線Fig.2　Protein concentration at different times

2.2酶解時(shí)間的確定

蛋白質(zhì)水解度是指蛋白質(zhì)酶解過(guò)程中,被裂解的肽鍵占總肽鍵數(shù)的百分比。亮氨酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3。一個(gè)亮氨酸分子被認(rèn)為含有一個(gè)α-氨基,因此以亮氨酸的濃度表示α-氨基的濃度,從而計(jì)算出相應(yīng)的水解度。

圖3　亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3　Standard curve of Leucine

用α-胰凝乳蛋白酶對(duì)蝦副產(chǎn)物提取液進(jìn)行酶解,得到蝦副產(chǎn)物水解度隨時(shí)間變化的曲線見(jiàn)圖4。如圖所示,隨著時(shí)間的增長(zhǎng),DH逐漸增大,在4 h時(shí)DH達(dá)到16.43%,6 h時(shí)為16.49%,兩者無(wú)顯著差異(p>0.05)。故選用4 h作為α-胰凝乳蛋白酶最佳水解時(shí)間,對(duì)蝦副產(chǎn)物進(jìn)行批量水解,供第二步酶解使用。

圖4　蝦副產(chǎn)物α-胰凝乳蛋白酶水解度曲線Fig.4　Effect of enzymolysis time on the DH of α-chymotrymotrypsin hydrolysate

用嗜熱菌蛋白酶對(duì)α-胰凝乳蛋白酶酶解液進(jìn)行第二步酶解,得到DH變化如圖5所示。由圖可知,隨著時(shí)間的增長(zhǎng),DH逐漸上升,6 h時(shí)DH達(dá)到5.50%,8 h時(shí)為5.60%,6 h后變化不大(p>0.05)。因此選6 h為嗜熱菌蛋白酶最佳酶解時(shí)間,批量制備酶解液,進(jìn)行下一步分離純化。第二步酶解的水解度低于第一步酶解,這可能與蝦副產(chǎn)物蛋白的自身氨基酸序列和酶的特異性切割位點(diǎn)組成有關(guān)。

圖5　嗜熱菌蛋白酶水解度曲線Fig.5　Effect of enzymolysis time on the DH of Thermolysin hydrolysate

2.3抗氧化肽的分離純化

2.3.1透析已報(bào)道的生物活性肽的相對(duì)分子質(zhì)量(Mw)大多在3000 u以下,抗氧化肽多是2000 u以下的短肽[17]。故選用1000 u和500 u的CE透析袋依次對(duì)酶解液進(jìn)行透析,得到<500 u和500～1000 u兩種組分。為比較不同組分的抗氧化活性,需確定其肽濃度。首先,以HPLC標(biāo)準(zhǔn)肽混合物H2016作為參照,繪制了肽濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖6)。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線中,肽標(biāo)準(zhǔn)物濃度和吸光度值的相關(guān)系數(shù)R2=0.9999,線性相關(guān)性較強(qiáng),可用公式y(tǒng)=0.2904 x+0.001計(jì)算透析后各組分的濃度。然后,建立了抗壞血酸DPPH自由基清除能力標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖7)和FRAP體系測(cè)抗氧化能力所用的標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖8)。

圖6　多肽濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6　Standard curve of peptide mixture concentration

圖7　抗壞血酸的DPPH自由基清除能力標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7　Standard curve of DPPH radical scavenging ability of AAE

圖8　抗壞血酸的鐵離子還原能力標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8　Standard curve of ferric reducing antioxidant power of AAE

圖9　兩種組分的抗氧化活性Fig.9　The antioxidant activity of two components

如圖9所示,兩種不同相對(duì)分子質(zhì)量的蝦副產(chǎn)物水解組分均顯示出一定的DPPH自由基清除能力和鐵離子還原能力。其中<500 u組分的DPPH自由基清除能力為(1.99±0.01) μmol AAE/g,鐵離子還原能力為(9.46±0.37) μmol AAE/g;500～1000 u組分表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性,上述兩指標(biāo)值分別為(3.87±0.03) μmol AAE/g和(14.65±0.08) μmol AAE/g。選擇500～1000 u的組分進(jìn)行下一步分離純化。

2.3.2凝膠過(guò)濾層析所得500～1000 u的組分經(jīng)Sephadex G-15凝膠過(guò)濾層析色譜柱分離,洗脫曲線和抗氧化活性分別如圖10和圖11所示。由結(jié)果可知,通過(guò)凝膠層析,共得到3個(gè)分離組分(G1至G3)?；钚澡b定表明G1具有最強(qiáng)的抗氧化活性,其DPPH自由基清除能力為(7.96±0.06) μmol AAE/g,鐵離子還原能力為(53.11±0.21) μmol AAE/g,因此選擇G1進(jìn)行下一步的分離純化。

圖10　Sephadex G-15凝膠過(guò)濾色譜Fig.10　Elution profile of peptides on Sephadex G-15 chromatography

圖11　Sephadex G-15洗脫組分的抗氧化活性Fig.11　The antioxidant activity of components purified by Sephadex G-15 chromatography

圖12　G1的DEAE Sephacel離子交換色譜圖Fig.12　Elution profile of fraction G1through DEAE Sephacel chromatography

圖13　DEAE Sephacel洗脫組分的抗氧化活性Fig.13　The antioxidant activity of components purified by DEAE Sephacel chromatography

2.3.3離子交換色譜多次收集組分G1進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,所得濃縮液用DEAE Sephacel離子色譜柱分離,結(jié)果見(jiàn)圖12。其中H1是未吸附組分,H2、H3和H4是吸附組分。收集各組分測(cè)定其抗氧化活性,見(jiàn)圖13。由結(jié)果可知,H2具有最高的清除活性,DPPH自由基清除能力為(10.54±0.03) μmol AAE/g,FRAP為(89.29±0.01) μmol AAE/g。因此選擇H2進(jìn)行下一步的分離純化。

2.3.4RP-HPLC將經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、透析脫鹽后的組分H2,用Inersil ODS-3柱反相高效液相色譜進(jìn)行分離,結(jié)果如圖14所示。

圖14　H2的RP-HPLC色譜圖Fig.14　Elution profile of fraction H2 by RP-HPLC

分離后共得到F1和F2兩個(gè)峰,多次收集兩個(gè)峰進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,所得兩組分濃縮液肽濃度稀釋至同一水平,分別測(cè)定其抗氧化活性,結(jié)果如圖15所示。F1具有較高的抗氧化活性,其DPPH自由基清除能力為(14.91±0.09) μmol AAE/g,鐵離子還原能力為(112.53±0.54) μmol AAE/g。

圖15　HPLC洗脫組分的抗氧化活性Fig.15　Antioxidative activities of the fractions isolated by RP-HPLC

2.3.5質(zhì)譜分析及活性鑒定由表2可知,通過(guò)α-胰凝乳蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶兩步酶解之后,組分F1中含有3個(gè)主要的肽,分別為十四肽YSLKMGGVSVVVIA,十三肽DISHNQRGAILVR,十肽GCKVALIVVG。確認(rèn)抗氧化肽的氨基酸序列后,對(duì)多肽進(jìn)行合成。分別測(cè)定三種不同多肽的抗氧化活性,結(jié)果如表2,由測(cè)定結(jié)果可知,十肽GCKVALIVVG具有最高的抗氧化性,其DPPH自由基清除能力為(16.10±0.02) μmol AAE/g,鐵離子還原能力為(245.37±0.03) μmol AAE/g。通過(guò)測(cè)定短肽的DPPH自由基清除能力和鐵離子還原能力,發(fā)現(xiàn)結(jié)果具有一致性,當(dāng)一種活性指標(biāo)高時(shí),另外一個(gè)活性指標(biāo)也高。其DPPH自由基清除能力與Faithong[18]等人從泰國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵磷蝦產(chǎn)品中和Jiang[19]等人酶解藍(lán)圓鲹肌肉獲得的抗氧化肽測(cè)定結(jié)果相近。鐵離子還原能力高于Ajibola等人[20]研究的非洲山藥豆水解組分,低于Bougatef等人[21]從美國(guó)星鯊肌肉獲得的組分。

表2　三種多肽抗氧化活性測(cè)定

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選用α-胰凝乳蛋白酶與嗜熱菌蛋白酶在優(yōu)化條件下依次對(duì)蝦副產(chǎn)物進(jìn)行酶解,經(jīng)過(guò)透析、凝膠層析色譜、離子交換層析和RP-HPLC分離純化得到抗氧化活性高的組分,經(jīng)質(zhì)譜分析,其抗氧化能力較強(qiáng)組分為十肽GCKVALIVVG,該肽的DPPH自由基清除能力為(16.10±0.02) μmol AAE/g pro,鐵離子還原能力為(245.37±0.03) μmol AAE/g pro。

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Preparation of antioxidant peptides from Shrimp byproducts by enzymolysis

LIU Ya-nan1,WANG Yan-hui2,Yalikunjiang Ashan2,QIAN Bing-jun2, YAO Xiao-min2,ZHANG Jian-hua2,ZHONG Yao-guang1,*

(1. College of Food Science & Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China; 2. School of Agriculture & Biology,Shanghai JiaoTong University,Shanghai 200240,China)

To prepare antioxidant peptides by specific enzyme hydrolysis,using shrimp byproducts as raw material. Alpha-chymotrypsin and thermolysin were chosen to hydrolysis the shrimp byproducts. The fractions showing high antioxidative activity were isolated from the hydrolysates by dialysis and using consecutive chromatographic methods including Sephadex G-15 gel filtration,DEAE Sephacel ion exchange chromatography,and Inersil ODS-3 reverse phase high-performance liquid chromatography. The antioxidant activity was assayed based on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)radical scavenging ability and ferric-reducing antioxidant power(FRAP). The fraction(F1)obtained after a series of separation showed high antioxidant activity. Three peptides were found in fraction F1by time-of-flight mass spectrometry analysis. The decapeptide had the highest concentration and antioxidant activity. Its DPPH radical scavenging activity was(16.10±0.02) μmol AAE/g protein and FRAP was(245.37±0.03) μmol AAE/g protein. The peptide which showed high antioxidant activity were obtained from shrimp byproducts,the results provided theoretical basis for the production and application of the byproduct of shrimp.

Shrimp byproducts;enzymatic hydrolysis;separation and purification;antioxidant peptides

2016-04-08

劉亞楠(1990-),女,碩士研究生,研究方向:食品工程,E-mail:Liu_Yanan1990@163.com。

鐘耀廣(1965-),男,博士,教授,研究方向:食品安全,E-mail:ygzhong@shou.edu.cn。

國(guó)家海洋局公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201205031)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)17-0090-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.009