小麥胚芽抗氧化肽對(duì)高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖的保護(hù)作用

曹小舟,陳海娟,劉永祥,寧鈞宇,沈新春,*

(1.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210023;2.北京市疾病預(yù)防控制中心,北京 100013)

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小麥胚芽抗氧化肽對(duì)高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖的保護(hù)作用

曹小舟1,陳海娟1,劉永祥1,寧鈞宇2,沈新春1,*

(1.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210023;2.北京市疾病預(yù)防控制中心,北京 100013)

目的:研究小麥胚芽抗氧化肽對(duì)高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖的保護(hù)作用。方法:用高糖誘導(dǎo)的VSMCs模型,將培養(yǎng)的VSMCs隨機(jī)分為三大組:正常組(5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖組(25 mmol/L葡萄糖,G)和實(shí)驗(yàn)組(25 mmol/L葡萄糖+不同濃度的抗氧化肽)。采用噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)快速比色法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)抗氧化肽對(duì)VSMCs增殖活性及其細(xì)胞周期分布影響;通過酶標(biāo)法測(cè)定在不同處理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi)總抗氧化能力(total antioxidation capacity,T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量變化。結(jié)果:小麥胚芽抗氧化肽可有效抑制高糖誘導(dǎo)的VSMCs增殖(p<0.01),阻滯細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換,顯著提高了細(xì)胞中總抗氧化能力,GSH-Px和SOD酶水平(p<0.01),降低了細(xì)胞中MDA水平(p<0.01)。結(jié)論:小麥胚芽抗氧化肽對(duì)高糖誘導(dǎo)的VSMCs增殖具有明顯的保護(hù)作用。

小麥胚芽抗氧化肽,血管平滑肌細(xì)胞,高糖,保護(hù)作用

小麥胚芽,又稱胚芽、麥芽粉,約占小麥籽粒的2%～3%,是整個(gè)麥粒營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最高的部分,富含豐富的B族維生素、VE、不飽和脂肪酸、賴氨酸、膳食纖維和一些具有功能性的微量元素[1-2]。脫脂后的小麥胚芽蛋白質(zhì)含量約為30%,它由清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白等組成。其中,清蛋白含量最高約占總蛋白的34.4%,必需氨基酸組成十分合理,含有人體必需的8種氨基酸,是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì),蘊(yùn)藏著許多具有生物活性的氨基酸序列,已被作為天然營(yíng)養(yǎng)源應(yīng)用于食品加工中[3-4]。近年來,許多研究者發(fā)現(xiàn)[5-8]麥胚蛋白酶解產(chǎn)物在DPPH自由基清除能力、Fe2+螯合能力、抑制脂質(zhì)過氧化能力等多種體外抗氧化體系中均表現(xiàn)出很高的活性,還有很多研究通過建立細(xì)胞氧化應(yīng)激模型[9-10]和小鼠動(dòng)物模型[11]證實(shí)了麥胚蛋白酶解產(chǎn)物體內(nèi)的抗氧化活性。

動(dòng)脈粥樣硬化是一種炎性血管病變,是心血管疾病的主要病理基礎(chǔ)。血管壁的重要構(gòu)成成分是血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs),位于血管中層及內(nèi)膜。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床資料表明,VSMCs的異常增殖是引起動(dòng)脈粥樣硬化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[12-14]。因此,VSMCs的體外培養(yǎng)已成為研究細(xì)胞生物學(xué)與多種疾病之間關(guān)系的重要方法。本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)VSMCs,用高糖刺激VSMCs異常增殖,建立VSMCs增殖模型,從細(xì)胞增殖率、抗氧化酶系和細(xì)胞周期等不同方面來探究小麥胚芽抗氧化肽對(duì)高糖誘導(dǎo)的VSMCs增殖的保護(hù)作用,旨在確證小麥胚芽抗氧化肽在細(xì)胞水平的生物抗氧化性,這將為小麥胚芽抗氧化肽開發(fā)成抗氧化功能性食品或功能因子提供重要的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

小麥胚芽抗氧化肽生工生物工程(上海)股份有限公司制備,純度95%以上;血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)北京疾控中心;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、Penicillin-Streptomycin(100×)、Trypsin EDTA(0.05%)Gibco公司;噻唑藍(lán)(MTT)、45%葡萄糖Sigma公司;異丙醇、NP-40、鹽酸、PBS緩沖液、無水乙醇國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒、超氧化物酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、微量蛋白含量測(cè)定(BCA法)試劑盒南京建成生物工程研究所;RIPA細(xì)胞裂解液、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒碧云天生物試劑公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Spectra Max多功能酶標(biāo)儀美國(guó)Bio Tek公司;生物安全柜、CO2培養(yǎng)箱、SL16R臺(tái)式冷凍離心機(jī)美國(guó)Thermo Fisher公司;WH-2微型漩渦混合儀上海滬西分析儀器廠有限公司;熒光倒置顯微鏡卡爾·蔡司公司;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋國(guó)華電器有限公司;流式細(xì)胞儀Accuri C6美國(guó)BD公司;JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎儀寧波新藝超聲設(shè)備有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1小麥胚芽抗氧化肽的制備小麥胚芽抗氧化肽Ala-Arg-Glu-Gly-Glu-Thr-Val-Val-Pro-Gly(AREGETVVPG,1014.46 Da)[15]委托生工生物工程(上海)股份有限公司用化學(xué)法合成(純度95%以上),作為本研究用的小麥胚芽抗氧化肽樣品。

1.2.2細(xì)胞傳代培養(yǎng)及分組細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),用0.05%的胰酶消化傳代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)48 h后,棄培養(yǎng)液,隨機(jī)分為三大組:正常組(5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖組(25 mmol/L葡萄糖,G)和實(shí)驗(yàn)組(25 mmol/L葡萄糖+不同濃度的抗氧化肽)。

1.2.3噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的VSMCs,用0.05% EDTA-胰蛋白酶溶液消化后,用含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液調(diào)至5×104個(gè)/mL,接種于96孔板,每孔100 μL,細(xì)胞數(shù)目為5×103個(gè)/孔,置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。按1.2.2進(jìn)行分組處理,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,每孔加入10 μL 5 mg/mL的MTT溶液(PBS溶液配制,過0.22 μm無菌膜除菌),繼續(xù)培養(yǎng)4 h后;棄上清加入100 μL異丙醇溶解液,37 ℃恒溫振蕩器中避光反應(yīng)15 min后,在酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定A[16]。細(xì)胞增殖率(%)=[(As-A0)/(An-A0)]×100,其中,As為待測(cè)樣品組,An為正常對(duì)照組,A0為空白對(duì)照組。

1.2.4細(xì)胞總抗氧化能力(T-AOC)、抗氧化酶活性(SOD、GSH-Px)和MDA的檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的VSMCs,用0.05% EDTA-胰蛋白酶溶液消化后,用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液調(diào)至1×105個(gè)/mL,接種于24孔板,每孔500 μL,使細(xì)胞數(shù)目為5×104/孔,待細(xì)胞完全貼壁后,換用不含血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,使細(xì)胞同步于G0期。按1.2.2進(jìn)行分組處理,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后除去培養(yǎng)液,各孔加入200 μL細(xì)胞裂解液,冰上裂解細(xì)胞15 min后,冰水浴條件下超聲波破碎(功率300 W,3～5 s/次,間隔10 s,重復(fù)3次)吸取各組細(xì)胞勻漿液,按照試劑盒說明書分別測(cè)定T-AOC、SOD、GSH-Px的活力和細(xì)胞MDA的含量。酶活表示為U/mg蛋白。

1.2.5流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期分布取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的VSMCs,用0.05% EDTA-胰蛋白酶溶液消化后,用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液調(diào)至1×105個(gè)/mL,接種于6孔板,每孔2 mL,使細(xì)胞數(shù)目為2×105/孔,待細(xì)胞完全貼壁后,換用不含血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,使細(xì)胞同步于G0期。按1.2.2進(jìn)行分組處理,孵育48 h后,棄培養(yǎng)液,PBS洗滌后以0.05% EDTA-胰蛋白酶溶液消化收集細(xì)胞。PBS洗滌2次,70%冷乙醇固定,4 ℃過夜。將細(xì)胞懸液1000 r/min離心5 min,棄乙醇,PBS洗滌兩次,棄上清液,沉淀加入碘化丙啶染色液500 μL(PI 50 μg/mL,RNase A 20 μg/mL),37 ℃避光染色30 min,流式細(xì)胞儀上測(cè)定細(xì)胞周期分布,并按公式增殖指數(shù)(Proliferation index,%)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)(100計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)PI[17-18]。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用Origin 7.5繪圖軟件繪圖,JMP 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢測(cè)。p<0.05代表差異具有顯著性,p<0.01代表差異具有高度顯著性。

2　結(jié)果與分析

2.1小麥胚芽抗氧化肽對(duì)高糖誘導(dǎo)的VSMCs增殖的影響

不同濃度的小麥胚芽抗氧化肽對(duì)高糖誘導(dǎo)的VSMCs增殖的影響如表1所示。以正常組作為對(duì)照組,高糖能明顯促進(jìn)VSMCs增殖,細(xì)胞數(shù)量高出對(duì)照組42.58%(p<0.01)。經(jīng)過5、10、20、30和40 μg/mL的抗氧化肽孵育24 h后,細(xì)胞增殖率分別下降至138.93%、132.64%、122.55%、104.08%和103.95%。當(dāng)抗氧化肽的濃度為30、40 μg/mL時(shí),VSMCs增殖率降幾乎達(dá)到了和正常組一致的水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,一定濃度的小麥胚芽抗氧化肽可以保護(hù)細(xì)胞,有效抑制高糖引起的VSMCs增殖過快。

表1　不同濃度小麥胚芽抗氧化肽對(duì)高糖誘導(dǎo)的VSMCs增殖的影響

注:##:與正常組相比有高度差異(p<0.01);*:與高糖組相比有顯著差異(p<0.05);**:與高糖組相比有高度差異(p<0.01)。

表2所示為不同濃度的小麥胚芽抗氧化肽對(duì)正常糖孵育的VSMCs生長(zhǎng)的影響。結(jié)果顯示,在5、10、20、30 μg/mL的濃度條件下,抗氧化肽對(duì)正常糖孵育的VSMCs生長(zhǎng)狀態(tài)無任何不良影響,表明低濃度的抗氧化肽對(duì)細(xì)胞沒有任何毒性(p>0.05)。當(dāng)抗氧化肽的濃度為40 μg/mL時(shí),細(xì)胞的存活率降到了95.56%(p<0.05),表明此濃度的抗氧化肽對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性。

表2　 不同濃度小麥胚芽抗氧化肽對(duì)正常糖孵育的VSMCs存活率的影響

注:*:與0 μg/mL相比存活率有顯著差異(p<0.05)。

2.2小麥胚芽抗氧化肽對(duì)高糖誘導(dǎo)的VSMCs總抗氧化能力(T-AOC)的影響

T-AOC包括酶與非酶在內(nèi)的全部抗氧化物,是一個(gè)能夠全面反映抗氧化能力的指標(biāo)。由圖1可知,經(jīng)過25 mmol/L的葡萄糖處理后,VSMCs中的T-AOC與正常組相比有顯著的降低(p<0.01)。低濃度的抗氧化肽具有一定的提高T-AOC的作用,但效果不明顯(p>0.05)。與高糖組相比,加入10 μg/mL和30 μg/mL的小麥胚芽抗氧化肽后,VSMCs中的T-AOC分別提高了59.22%和81.47%(p<0.01)。表明小麥胚芽抗氧化肽可以通過提高抗氧化能力來保護(hù)細(xì)胞。

圖1　小麥胚芽抗氧化肽對(duì)VSMCs中T-AOC水平的影響Fig.1　Effects of wheat germ AOP on T-AOC content in VSMCs 注:G:高糖(下同);##:與正常組相比有高度差異(p<0.01);*:與高糖組相比有顯著差異(p<0.05);**:與高糖組相比有高度差異(p<0.01),圖2、圖3、圖5同。

2.3小麥胚芽抗氧化肽對(duì)高糖誘導(dǎo)的VSMCs中GSH-Px和SOD酶水平的影響

自由基對(duì)細(xì)胞的損傷包括:過剩的自由基攻擊細(xì)胞,使質(zhì)膜中的不飽和脂肪酸氧化,從而破壞細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu),使膜功能失常,導(dǎo)致細(xì)胞死亡;使DNA鏈斷裂、交聯(lián);抑制核酸的生物合成等[19]。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下,機(jī)體自身的抗氧化防御系統(tǒng)通過酶促(谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px、超氧化物歧化酶SOD、過氧化氫酶CAT)與非酶促(維生素、氨基酸和金屬蛋白)兩個(gè)作用體系來清除過多的自由基,維持機(jī)體的平衡狀態(tài)[20]。Ryu等[21]對(duì)海藻多肽抗氧化作用的研究中,通過分析GSH-Px、SOD等指標(biāo)的變化來評(píng)價(jià)海藻多肽對(duì)氧化損傷細(xì)胞的保護(hù)作用;范金波等[22]通過建立過氧化氫誘導(dǎo)損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV-304)模型,測(cè)定了抗氧化酶系,如SOD、CAT、GSH-Px酶的水平,確證了絲膠抗氧化肽在細(xì)胞水平的生物抗氧化功能。因此,本研究通過測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組VSMCs的GSH-Px和SOD活性水平,進(jìn)一步分析小麥胚芽抗氧化肽對(duì)高糖誘導(dǎo)的VSMCs的抗氧化作用。

由圖2可知,正常組VSMCs中的抗氧化酶GSH-Px和SOD活性均在較高的水平,經(jīng)25 mmol/L的葡萄糖處理48 h后,高糖組細(xì)胞中的GSH-Px和SOD活性分別降低至106.04 U/mg蛋白和113.38 U/mg蛋白(p<0.01)。同高糖組相比,各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中GSH-Px和SOD的活性隨著抗氧化肽濃度的升高,酶活性均有不同程度的提高。相比高糖組的GSH-Px活力,5、10、30 μg/mL抗氧化肽組分別提高了10.30%、16.44%和28.30%;相比高糖組的SOD活力,5、10、30 μg/mL抗氧化肽組分別提高了8.36%、20.79%和34.46%。統(tǒng)計(jì)分析表明,10 μg/mL和30 μg/mL實(shí)驗(yàn)組的GSH-Px和SOD酶活性均極顯著高于高糖組(p<0.01)。

圖2　小麥胚芽抗氧化肽對(duì)VSMCs中GSH-Px(a)和SOD(b)酶水平的影響Fig.2　Effects of wheat germ AOP on GSH-Px(a)and SOD(b)activities in VSMCs

為對(duì)抗氧化應(yīng)激引起的各種損傷,有氧生物在進(jìn)化過程中發(fā)展了多種抗氧化防御機(jī)制[23]。作為生物防御體系的關(guān)鍵酶,GSH-Px和SOD能夠清除外源性產(chǎn)生的活性氧,減輕自由基對(duì)細(xì)胞的攻擊,其活力的變化可間接的反映細(xì)胞受損的情況及修復(fù)能力的強(qiáng)弱[24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,小麥胚芽抗氧化肽可能是通過增加機(jī)體清除自由基的能力來減輕氧化應(yīng)激,從而維持細(xì)胞的穩(wěn)定狀態(tài),發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的功能。

2.4抗氧化肽對(duì)高糖誘導(dǎo)的VSMCs中MDA水平的影響

作為氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物,細(xì)胞的受損程度可由細(xì)胞內(nèi)MDA的含量間接反映[25]。各組細(xì)胞的MDA含量見圖3。高糖組的MDA含量與正常組相比顯著升高(p<0.01),說明高糖環(huán)境使質(zhì)膜脂質(zhì)過氧化而積累大量產(chǎn)物MDA?？寡趸牡奶砑?能顯著降低細(xì)胞內(nèi)MDA的含量。統(tǒng)計(jì)分析表明,10 μg/mL和30 μg/mL的抗氧化肽對(duì)細(xì)胞中的MDA具有極顯著的清除作用,分別降低了21.94%和38.71%(p<0.01)。結(jié)果表明小麥胚芽抗氧化肽可以通過減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的生成發(fā)揮其抗氧化作用。

圖3　小麥胚芽抗氧化肽對(duì)VSMCs中MDA水平的影響Fig. 3　Effects of wheat germ AOP on MDA content in VSMCs

2.5小麥胚芽抗氧化肽對(duì)高糖誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞周期是指以有絲分裂方式增殖的細(xì)胞從親代分裂結(jié)束到子細(xì)胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程。處于增殖周期的正常細(xì)胞,其所處的不同細(xì)胞周期(G0/G1期、S期、G2/M期)DNA含量也不同,相比G0/G1期,處于G2/M期的細(xì)胞DNA含量增加一倍,處于S期的細(xì)胞DNA含量介于兩者之間[26]。

如圖4所示,經(jīng)25 mmol/L的葡萄糖刺激誘導(dǎo)后,高糖組b圖中G0/G1期細(xì)胞數(shù)分別由正常組a圖中的77.35%減少到64.73%,而處于S期的細(xì)胞數(shù)則由正常組的6.15%增加到20.23%,說明高糖環(huán)境可以促進(jìn)細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期。加入不同濃度(10 μg/mL和30 μg/mL)的小麥胚芽抗氧化肽后,實(shí)驗(yàn)組被阻滯于G0/G1期的細(xì)胞上升至70.73%和74.78%,而S期的細(xì)胞數(shù)目減少到14.03%和8.58%。進(jìn)一步計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù),結(jié)果如圖5所示,加入25 mmol/L的葡萄糖后,增殖指數(shù)由正常組的22.65%增加到高糖組的35.27%(p<0.01),加入抗氧化肽(10 μg/mL和30 μg/mL)孵育48 h后,高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖指數(shù)降至29.27%和25.22%(p<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小麥胚芽抗氧化肽主要是抑制高糖誘導(dǎo)的G0/G1期細(xì)胞進(jìn)入S期,從而抑制細(xì)胞增殖的進(jìn)程。

圖4　各組細(xì)胞DNA流式圖Fig.4　The DNA content by flow cytometry注:a.正常組;b.高糖組;c.10 μg/mL抗氧化肽實(shí)驗(yàn)組;d.30 μg/mL抗氧化肽實(shí)驗(yàn)組。

圖5　小麥胚芽抗氧化肽對(duì)VSMCs周期的影響Fig.5　Effects of wheat germ AOP on cell cycle

3　結(jié)論

通過建立高糖誘導(dǎo)的VSMCs模型,研究小麥胚芽抗氧化肽對(duì)細(xì)胞抗氧化酶系水平、中間產(chǎn)物水平和細(xì)胞周期的影響,評(píng)價(jià)其對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:小麥胚芽抗氧化肽可以顯著提高高糖誘導(dǎo)的VSMCs中T-AOC、GSH-Px和SOD酶活性,降低MDA含量,阻滯細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換,進(jìn)而抑制高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖。這些數(shù)據(jù)均表明小麥胚芽抗氧化肽具有良好的抗氧化活性,可以作為一種功能性食品添加劑應(yīng)用于食品工業(yè),其機(jī)制可能與增加機(jī)體清除自由基的能力和保護(hù)細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化有關(guān),其詳細(xì)機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

[1]Luthria DL,Lu YJ,Maria KM. Bioactive phytochemicals in wheat:Extraction,analysis,processing,and functional properties[J]. Journal of Functional Food,2015,18(B):910-925.

[2]Shurpalekar SR,Haridas RP. Wheat germ[J]. Advances in Food Research,1977,12:187-304.

[3]Arshad MU,Anjum FM,Zahoor T. Nutritional assessment of cookies supplemented with defatted wheat germ[J]. Food Chemistry,2007,102:123-128.

[4]Ge Y,Sun A,Ni Y,et al. Some nutritional and functional properties of defatted wheat germ protein[J]. Journal of agricultural and food chemistry,2000,48(12):6215-6218.

[5]Cheng YH,Wang Z,Xu SY. Antioxidant properties of wheat germ protein hydrolysates evaluatedinvitro[J]. Journal of Central South University,2006,13:160-165.

[6]Zhu KX,Lian CX,Guo XN,et al. Antioxidant Activities and Total Phenolic Contents of Various Extracts from Defatted Wheat Germ[J]. Food Chemistry,2011,126(3):1122-1126.

[7]Adom KK,Sorrells ME,Liu RH. Phytochemicals and antioxidant activity of milled fractions of different wheat varieties[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2005,53(6):2297-2306.

[8]Zhu KX,Zhou HM,Qian HF. Antioxidant and free radical scavenging activities of wheat germ protein hydrolysates(WGPH)prepared with alcalase[J]. Process Biochemistry,2006,41(6):1296-1302.

[9]Cheng YH,Zhang L,Sun W,et al. Protective effects of a wheat germ peptide(RVF)against H2O2-induced oxidative stress in human neuroblastoma cells[J]. Biotechnology Letters,2014,36(8):1615-1622.

[10]Zhu KX,Guo X,Guo XN,et al. Protective effects of wheat germ protein isolate Hydrolysates(WGPIH)against hydrogen peroxide-induced oxidative stress in PC12 cells[J]. Food Research International,2013,53:297-303.

[11]王才立,張志國(guó),王成忠,等. 不同分子質(zhì)量小麥胚芽多肽的體內(nèi)抗氧化活性[J]. 食品科學(xué),2013,34(7):275-278.

[12]Angeli FS,Shannon RP. Beyond glycemic control:cardiovascular effects of incretin-based therapies[J]. Frontiers of Hormone Research. 2014,43:144-157.

[13]Doran AC,Meller N,Mcnamara CA. Role of smooth muscle cells in the initiation and early progression of atherosclerosis[J]. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology,2008,28(5):812-819.

[14]Laakso M. Hyperglycemia and cardiovascular disease in type 2 diabetes[J]. Diabetes,1999,48(5):937-942.

[15]陳思遠(yuǎn),劉永祥,曹小舟,等. 麥胚清蛋白分離制備高活性抗氧化肽的工藝[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,49(12)：2379-2388.

[16]Saravanan BC,Sreekumar C,Bansal GC,et al. A rapid MTT colorimetric assay to assess the proliferative index of two Indian strains of Theileria annulata[J]. Veterinary Parasitology,2003,113(3-4):211-216.[17]Li L,Gao T,He SY,et al. Effect of heparin-derived oligosaccharide on vascular smooth muscle cell proliferation through inhibition of PKC-αexpression[J]. Acta Pharmacologica Sinica,2012,47(8):993-1000.

[18]Li JT,Zhang JL,He H,et al. Apoptosis in human hepatoma HepG2 cells induced by corn peptides and its anti-tumor efficacy in H22 tumor bearing mice[J]. Food and Chemical Toxicology,2013,51:297-305.

[19]Evans JL,Goldfine ID,Maddux BA,et al. Are oxidative stress-activated signaling pathways mediators of insulin resistance and beta-cell dysfunction?[J]. Diabetes,2003,52(1):1-8.

[20]Fransen M,Nordgren M,Wang B,et al. Role of peroxisomes in ROS/RNS-metabolism:implications for human disease[J]. Biochimica et Biophysica Acta,2012,1822(9):1363-1373.

[21]Ryu B,Himaya SW,Qian ZJ,et al. Prevention of hydrogen peroxide-induced oxidative stress in HDF cells by peptides derived from seaweed pipefish,Syngnathus schlegeli[J]. Peptides,2011,32(4):639-647.

[22]范金波,周素珍,鄭立紅,等. 絲膠抗氧化肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV-304)損傷的保護(hù)作用[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào),2014,14(8):49-53.

[23]Sandhu SK,Kaur G. Alterations in oxidative stress scavenger system in aging rat brain and lumphocytes[J]. Biogerontology,2002,3(3):161-173.

[24]崔志文,黃琴,黃怡,等. 枯草芽孢桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞抗氧化功能的影響研究[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2011,23(2):293-298.

[25]Draper HH,Hadley M. Malondialdehyde determination as index of lipid peroxidation[J]. Methods in Enzymology,1990,186:421-431.

[26]Weber H,Huhns S,Jonas L,et al. Hydrogen peroxide-induced activation of defense mechanisms against oxidative stress in rat pancreatic acinar AR42J cells[J]. Free Radical Biology and Medicine,2007,42(6):830-841.

Protective effects of wheat germ antioxidant peptide on proliferation of vascular smooth muscle cells exposed to high glucose

CAO Xiao-zhou1,CHEN Hai-juan1,LIU Yong-xiang1,NING Jun-yu2,SHEN Xin-chun1,*

(1.College of Food Science and Engineering/Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety/Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing, Nanjing University of Finance and Economics,Nanjing 210023,China; 2.Beijing Center for Diseases Control and Prevention,Beijing 100013,China)

Objective:To evaluate the protective effects of wheat germ antioxidant peptide(AOP)on proliferation of vascular smooth muscle cells(VSMCs)exposed to high glucose. Methods:VSMCs were randomly divided into 3 groups,normal control group(5.5 mmol/L glucose),model control group(25 mmol/L glucose)and treatment groups(25 mmol/L glucose in different concentration of AOP). MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)assays were used to measure VSMCs proliferation,cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry. The activities of total antioxidation capacity(T-AOC),glutathione peroxidase(GSH-Px),superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)were measured by enzyme-linked immunosorbent assay. Results:VSMCs proliferation that was enhanced by high glucose was effectively suppressed by wheat germ AOP(p<0.01),and the cell cycle G1/S phase transition was also blocked. In addition,antioxidative enzyme(T-AOC,GSH-Px and SOD)activities in VSMCs exposed to high glucose were significantly increased in the presence of AOP(p<0.01),whereas the MDA level was decreased(p<0.01). Conclusion:These results indicated that wheat germ AOP exhibited significant protective effects on proliferation of VSMCs exposed to high glucose.

wheat germ antioxidant peptides(AOP);vascular smooth muscle cells(VSMCs);high glucose;protective effects

2016-03-03

曹小舟(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品深加工與副產(chǎn)品綜合利用，E-mail：15951912672@163.com。

沈新春(1966-)，男，博士，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品深加工與副產(chǎn)品綜合利用、分子營(yíng)養(yǎng)， E-mail：shenxinchun@njue.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31271983、81170268)；江蘇省自然科學(xué)基金 (BK20141484)；江蘇省高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目(14KJA550002)；2015年度江蘇省高校優(yōu)秀科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)、江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目。

TS213.2

A

1002-0306(2016)17-0049-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.001