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    甘草次酸對(duì)自由基清除作用的電化學(xué)研究

    2016-10-31 08:56:52郭泰春雷新明李飛云王國(guó)英史高峰
    甘肅科技 2016年6期
    關(guān)鍵詞:次酸玻碳伏安

    郭泰春,雷新明,李飛云,王國(guó)英,史高峰

    (蘭州理工大學(xué),甘肅 蘭州 730050)

    甘草次酸對(duì)自由基清除作用的電化學(xué)研究

    郭泰春,雷新明,李飛云,王國(guó)英,史高峰

    (蘭州理工大學(xué),甘肅蘭州730050)

    研究了應(yīng)用電化學(xué)分析方法測(cè)定甘草次酸對(duì)自由基的清除作用。用石墨烯修飾玻碳電極,建立了一種應(yīng)用石墨烯修飾玻碳電極的電化學(xué)方法測(cè)定甘草次酸及其對(duì)·OH(羥基),O2·-(超氧),ROOH(脂質(zhì)過(guò)氧)自由基的清除作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:甘草次酸的檢出限為2.24×10-3g/L,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為8.94%(n=5)。同時(shí),甘草次酸對(duì)3種自由基均具有清除作用,清除能力大小為:O2·->ROOH>·OH,清除率與濃度呈良好的線性關(guān)系。該方法具有易于操作、靈敏度好、檢出限低以及價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。

    甘草次酸;自由基;石墨烯;修飾電極;清除能力;線性關(guān)系

    在正常的人體生理代謝過(guò)程中,人體本身的防御體系可以保持體內(nèi)氧自由基的平衡[1~3],但在機(jī)體產(chǎn)生病變、紫外線照射、化學(xué)毒物及藥物影響、電離輻射等,此時(shí)自由基的平衡體系受到破壞[4],從而引發(fā)機(jī)體自由基穩(wěn)衡態(tài)紊亂,產(chǎn)生多余自由基,進(jìn)而引發(fā)心臟病、動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥等嚴(yán)重疾病并加速衰老過(guò)程[5~7]。由于化學(xué)合成的抗氧化劑存在致癌、毒副作用等安全問(wèn)題,因而,天然抗氧化劑是減輕細(xì)胞氧化損傷、預(yù)防相關(guān)疾病等最有效措施[8,9]。而甘草次酸是目前較有代表意義的抗衰老中藥活性成分,具有抗心律失常和抗缺氧、抗炎、抗免疫、抗腫瘤和抗氧化等作用。

    石墨烯是一種新型碳材料,其碳原子緊密堆積成單層二維蜂窩狀晶格結(jié)構(gòu),具有高比表面和優(yōu)異的電化學(xué)性能,高化學(xué)物理穩(wěn)定性以及生物相容性等性質(zhì),被用于超靈敏傳感器和電化學(xué)傳感器等領(lǐng)域[12~13]。

    自由基的檢測(cè)方法有:鄰苯三酚自氧化法、化學(xué)發(fā)光測(cè)定、熒光分光光度法、電子自旋共振技術(shù)與自旋捕捉法、氣相色譜法等已有報(bào)道。這些檢測(cè)體系重現(xiàn)性差,儀器復(fù)雜,操作繁瑣,分析時(shí)間長(zhǎng)[14]。因此本文用石墨烯修飾玻碳電極檢測(cè)甘草次酸對(duì)自由基的清除作用的研究未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道,該方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器

    所有實(shí)驗(yàn)均在CHI660B電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)中進(jìn)行,采用三電極系統(tǒng),其中玻碳電極(Φ=3mm)作為工作電極,甘汞電極為輔助電極,鉑片電極為對(duì)電極。電熱蒸餾水器(北京科偉永興儀器有限公司),超聲波清洗器(KQ5200DE,北京科偉永興儀器有限公司)。微量移液器(上海求精生化試劑儀器有限公司)。鐵氰化鉀(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司),甘草酸單銨鹽(實(shí)驗(yàn)室自制),石墨烯懸浮液(實(shí)驗(yàn)室自制),氧化鋁粉末(0.05μm,美國(guó)GaossUnion公司)。

    1.2電極處理

    玻碳電極先后在1500#,2000#金相砂紙上打磨,完后用蒸餾水清洗電極表面。接著在麂皮上撒上少量Al2O3,然后滴加少量的蒸餾水,用玻碳電極上絕緣的部分稍微攪勻。直到電極表面呈鏡面,在鐵氰化鉀溶液中掃描循環(huán)伏安曲線。氧化還原峰電位之差ΔEp在80mV以下,電極方可使用。本實(shí)驗(yàn)所測(cè)ΔEp=79mV。然后在打磨好的電極上滴加一定量的石墨烯懸浮液,在通風(fēng)處風(fēng)干數(shù)小時(shí)后待用。

    1.3甘草次酸制備

    稱量12g甘草酸單銨鹽,溶于100mL8%的硫酸溶液中,100℃下反應(yīng)12h,得到7.5g灰白色甘草次酸粗品,水洗直至pH不再變化,50℃下干燥后,溶于氯仿中,煮沸10min,趁熱過(guò)濾,濃縮,50℃下干燥。將以上甘草次酸粗品溶于80%的乙醇溶液中,80℃下保溫,待懸浮物基本溶解,冰水浴析出沉淀,過(guò)濾,干燥,得到0.8g含量為91.59%(HPLC)精制甘草次酸。

    1.4自由基的配制

    羥基自由基(·OH):稱取0.3g七水硫酸亞鐵晶體,定容至100mL容量瓶中,標(biāo)為A液。精確稱取0.05g30%的雙氧水,定容至50mL容量瓶中,標(biāo)為B液。A、B液均在0~4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

    脂質(zhì)過(guò)氧自由基(ROOH)::稱取0.3g卵磷脂溶于30mL磷酸鹽緩沖溶液(G,50mm/mol,pH7.4)中,冰水浴2h,標(biāo)為C液。取0.01g氯化鐵,定容至50mL容量瓶中,0.01g抗壞血酸,定容至50mL容量瓶中,分別標(biāo)記為D、E液,0~4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

    超氧自由基(O2·-):稱取0.01g核黃素,用70%甲醇溶解定容至10mL容量瓶中,標(biāo)為F液。稱取0.02g甲硫氨酸,定容至50mL容量瓶中標(biāo)為H液。0~4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.5自由基清除實(shí)驗(yàn)

    自由基產(chǎn)生體系和產(chǎn)生條件見(jiàn)表1,分別設(shè)置對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。反應(yīng)原理如下:

    羥基自由基(·OH):雙氧水與亞鐵離子反應(yīng)生成·OH,即H2O2+Fe2+→·OH+H2O+Fe3+,由于·OH活性高[15],存活時(shí)間太短,用儀器很難檢測(cè)到,因此在反應(yīng)體系中加入抗氧化劑(捕捉劑)能有效捕捉· OH,起到一定的清除作用。

    脂質(zhì)過(guò)氧自由基(ROOH):Fe3+與抗壞血酸誘導(dǎo)脂質(zhì)體過(guò)氧化,即ROOH+Fe3+→ROO·+H++Fe2+。

    超氧自由基(O2·-):參照Beauchamp的光化學(xué)方法[16],即在還原劑甲硫氨酸存在下,核黃素分子吸收一個(gè)光子被還原,在O2條件下,自氧化產(chǎn)生O2·-。

    表1 自由基反應(yīng)體系

    2 結(jié)果與討論

    2.1甘草次酸的電化學(xué)行為

    在50mmol/LPBS(磷酸鹽緩沖溶液pH7.4),掃描速率為100mV/s,電勢(shì)范圍為-0.4~0.8V,富集時(shí)間為30s的條件下,加入一定量的甘草次酸溶液,記錄氧化峰電流和氧化峰電位。如圖1所示為修飾電極和裸電極分別測(cè)定甘草次酸的線性掃描伏安行為。結(jié)果表明:甘草次酸在裸玻碳電極上(圖1a)出現(xiàn)了1個(gè)弱的氧化峰,Epa為0.33V,而在相同緩沖液和測(cè)定條件下樣品在石墨烯修飾玻碳電極上(圖1b)的氧化峰電流明顯增大,說(shuō)明石墨烯修飾玻碳電極對(duì)甘草次酸產(chǎn)生了電催化氧化作用。

    圖1 甘草次酸在裸玻碳電極(a),修飾電極(b)上的線性掃描伏安圖

    2.2線性范圍、檢出限

    在上述緩沖溶液和測(cè)定條件下,用石墨烯修飾電極測(cè)定了不同濃度的甘草次酸的線性掃描伏安行為,濃度范圍為0.016-0.08g/L。如圖2所示(上)表示不同濃度下甘草次酸的電化學(xué)行為,由圖可知隨著濃度的不斷增加,甘草次酸的峰電流不斷增加,在濃度為0.016-0.08g/L(a-f)的范圍內(nèi)呈良好的線性范圍,如圖2(下)所示,線性回歸方程為:Ip(μA)=2c(g/L)+6.08,R2=0.995,檢出限為2.24×10-3g/L,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為8.94%(n=5)。見(jiàn)表2為甘草次酸的含量測(cè)定結(jié)果與加樣回收率。

    圖2?。ㄉ希┍硎静煌瑵舛认赂什荽嗡岬木€性掃描伏安曲線,(下)表示甘草次酸濃度與峰電流的線性關(guān)系

    表2 甘草次酸樣品的測(cè)定結(jié)果

    2.3甘草次酸對(duì)自由基的清除作用

    甘草次酸對(duì)·OH,O2·-,ROOH自由基的清除效果,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組線性掃描伏安曲線如圖3所示,在甘草次酸的出峰位置Ep=0.33V處實(shí)驗(yàn)組峰電流小于對(duì)照組峰電流,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組的一部分甘草次酸用于清除自由基,證明甘草次酸對(duì)自由基具有清除作用。其清除效果見(jiàn)表3。由表3數(shù)據(jù)可知,甘草次酸對(duì)3種自由基的清除效果為O2·->ROOH>· OH。清除率計(jì)算公式如下:

    圖3 甘草次酸對(duì)自由基清除作用的線性掃描伏安曲線,b表示對(duì)照組,a表示實(shí)驗(yàn)組

    配制2、4、6、8、10ug/mL的甘草次酸樣品,測(cè)定其對(duì)自由基清除效果的線性伏安行為。圖4為甘草次酸對(duì)自由基清除率與濃度的關(guān)系,由圖可知甘草次酸對(duì)O2·-自由基的清除能力最強(qiáng),對(duì)ROOH和· OH的清除能力次之。

    圖4 甘草次酸對(duì)3種自由基的清除作用與濃度關(guān)系

    表3 甘草次酸對(duì)自由基的清除率數(shù)據(jù)表

    3 結(jié)語(yǔ)

    皮膚的衰老和色斑的沉積都與自由基有著密切的關(guān)系,而大多數(shù)合成類藥物具有毒性且具有副作用,因此有必要尋找合適的天然抗氧劑來(lái)對(duì)抗和清除自由基。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,具有清除氧自由基的作用的中藥有效成分甘草次酸,將作為抗皺、美白等化妝品的主要成分,具有發(fā)展?jié)摿Α1疚慕⒘耸┬揎楇姌O的電化學(xué)分析方法測(cè)定了甘草次酸對(duì)·OH、ROOH、O2·-自由基的電化學(xué)行為,這種方法具有成本低、靈敏度高、且易于操作等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果滿意。

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    G633.8

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