尼莫地平對帕金森病模型小鼠黑質(zhì)iNOS和COX-2表達的抑制作用

李雅鑫，　徐　帆，　秦麗娟，　張宇新，　周洪霞，　耿　菲，　張　田

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尼莫地平對帕金森病模型小鼠黑質(zhì)iNOS和COX-2表達的抑制作用

李雅鑫1，徐帆1，秦麗娟2，張宇新3，周洪霞3，耿菲3，張?zhí)?

目的研究尼莫地平對1-甲基-4-苯基-1、2、3、6四氫吡啶(MPTP)所誘導的帕金森病(PD)模型小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的保護作用。方法雄性健康C57BL/6N小鼠隨機分為對照組，腹腔注射生理鹽水；模型組，腹腔注射MPTP(25 mg/kg)；尼莫地平治療組，每次注射MPTP前3 h灌胃給予尼莫地平(15 mg/kg)。觀察各組小鼠行為學變化，免疫組織化學和免疫蛋白印跡法觀察中腦黑質(zhì)酪氨酸羥化酶(TH)、誘導型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)和環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase，COX-2)的表達變化。結(jié)果與對照組小鼠比較，MPTP模型組小鼠出現(xiàn)典型的PD癥狀，中腦黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元大量丟失，iNOS和COX-2陽性細胞顯著增多，蛋白水平明顯升高；經(jīng)尼莫地平處理后，上述情況得到明顯改善。結(jié)論在此PD小鼠模型中，尼莫地平通過抑制炎癥因子iNOS和COX-2的表達，可對多巴胺能神經(jīng)元起到一定的保護作用。

帕金森病；酪氨酸羥化酶；誘導型一氧化氮合酶；環(huán)氧化酶-2；尼莫地平；小鼠

帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)是僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)的第二常見神經(jīng)變性疾病。中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的退行性變是PD的關鍵病理學特征。目前，PD病因和發(fā)病機制尚不十分清楚，因而臨床上缺乏有效的標本兼治方法。隨著我國老齡化社會的到來，PD發(fā)病率將呈逐年上升趨勢，必然會給家庭和社會帶來沉重負擔。因此，闡明PD發(fā)病機制以及如何防治已成為PD研究的核心與焦點問題。目前認為，炎癥反應可能是PD的重要發(fā)病機制之一[1]，尼莫地平(Nimodipine，NIM)是1，4-二氫吡啶類鈣通道拮抗劑，易透過血腦屏障。近年研究顯示，尼莫地平對AD動物模型所致的神經(jīng)元損傷有一定的保護作用[2]；尼莫地平能通過其抗炎作用，從而有效的保護多巴胺能神經(jīng)元[3]。有證據(jù)表明，iNOS和COX-2作為非常重要的炎癥因子，參與了PD的發(fā)病過程[4]。那么，尼莫地平是否能夠通過抑制iNOS和COX-2的表達，從而對多巴胺神經(jīng)元起到保護作用呢？為此，本實驗主要觀察尼莫地平對MPTP誘導的PD小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的保護作用，從而為PD的預防、治療、延緩疾病的發(fā)展提供一條新的思路。

1　材料與方法

1.1動物及試劑雄性健康C57BL/6N小鼠45只，12～14周齡，體質(zhì)量25～30 g，清潔級，購于北京維通利華公司，自由進食，飲水，室溫25±2 ℃，單籠喂養(yǎng)。MPTP(Sigma，USA)；兔抗人iNOS單克隆抗體(CANYAN，USA)；兔抗鼠COX-2多克隆抗體，預染蛋白Marker(天津灝洋生物公司)；大鼠抗TH單克隆抗體(Chemicon，USA)；尼莫地平(德國拜耳醫(yī)藥)；UltraSensitiveSP超敏試劑盒(福州邁新公司)。

1.2動物分組和模型制備實驗動物隨機分為3組，每組15只。模型組：腹腔注射MPTP(25 mg/kg，生理鹽水溶解)，每天1次，連續(xù)7 d；尼莫地平治療組：在MPTP注射前3 h灌胃給予尼莫地平預處理(15 mg/kg)，每天1次，連續(xù)7 d；對照組：注射與模型組等量生理鹽水。

1.3行為學檢測采用懸掛實驗衡量小鼠的力量及肢體運動協(xié)調(diào)情況。每次注射后1 h將受試小鼠雙前爪懸掛于一條張緊的水平電線上，觀察其后爪抓握電線的情況并評分，評測時間是1 min。如小鼠用兩后爪抓住電線，記3分；如用一后爪抓住電線，記2分；如果小鼠兩后爪均抓不住電線，記1分；最后計算總得分。

1.4組織固定、取材MPTP第7次注射后12 h每組隨機取9只C57BL/6N小鼠。腹腔麻醉后，經(jīng)左心室插管用生理鹽水(室溫)灌注，再用4%的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液緩慢灌注固定，迅速切取中腦黑質(zhì)部位腦塊，放于4%多聚甲醛后固定48 h(4 ℃)，固定好的腦組織經(jīng)蒸餾水沖洗、梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋，包埋后，石蠟切片機做連續(xù)冠狀切片，片厚5 m，4 ℃保存?zhèn)溆?。每組15只小鼠中隨機取6只進行Westernblot分析。小鼠麻醉后，迅速斷頭取腦，分離中腦黑質(zhì)部分，置入細胞裂解液中，低溫勻漿，4 ℃震蕩30 min后，12000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5免疫組織化學免疫組織化學染色采用SP法，步驟如下：切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水后，用TBS(pH7.4±0.2)洗3次，每次5 min；組織切片進行水浴法抗原修復；降至室溫；TBS洗3次，每次5 min；每張切片加入過氧化氫(25l)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，TBS洗3次，每次5 min；每張切片滴加10%正常山羊血清(25 μl)室溫孵育15 min，同一組織相鄰切片分別加入兔抗人iNOS單克隆抗體(1∶150)，兔抗鼠COX-2多克隆抗體(1∶150)，大鼠抗TH單克隆抗體(1∶300)，4 ℃過夜，TBS洗3次，每次5 min；加入二抗(生物素標記羊抗兔IgG，1∶150)室溫孵育20 min；TBS洗3次，每次5 min；加入鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶溶液(25l)室溫孵育20 min，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.6Western blot檢測蛋白定量后取4倍體積樣品緩沖液，95 ℃變性10 min。蛋白上樣量為30 g/lane，10% SDS-PAGE電泳，將蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，依分子量大小切取條帶，加入封閉液室溫下震蕩2 h后，取相應條帶分別加入兔抗人iNOS單克隆抗體(1∶300)，兔抗鼠COX-2多克隆抗體(1∶200)，大鼠抗TH單克隆抗體(1∶400)，4 ℃過夜。室溫孵育1 h后，TBST洗5次，每次3 min；分別加入二抗(生物素標記羊抗兔IgG，1∶500)室溫孵育1 h，TBST洗5次，每次3 min；加入鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶溶液室溫下孵育0.5 h，TBST洗5次，每次3 min；DAB顯色，掃描蛋白印跡條帶，作定量分析。

1.7統(tǒng)計學處理免疫組織化學染色數(shù)據(jù)，采用CMIAS真彩醫(yī)學圖像自動分析系統(tǒng)進行陽性細胞記數(shù)。各組每只動物的3張腦片數(shù)值相加后取平均值。實驗結(jié)果使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，q檢驗，以P<0.05差異具有統(tǒng)計學意義；免疫印跡法統(tǒng)計分析同上。

2　結(jié)　果

2.1行為學檢測注射MPTP后，模型組小鼠出現(xiàn)典型PD樣癥狀，表現(xiàn)為豎毛、翹尾、震顫和運動變緩等特征。懸掛實驗中，與對照組小鼠比較，抓電線的能力明顯下降。羅格列酮處理后，抓握電線的能力有所提高(P<0.05，見表1)。

2.2免疫組織化學檢測對照組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)偶見iNOS和COX-2陽性細胞；與對照組比較，模型組iNOS和COX-2陽性細胞顯著增多，呈棕黃色；對照組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)可見大量TH陽性神經(jīng)元，排列整齊，神經(jīng)纖維密集；模型組TH陽性神經(jīng)元大量丟失；經(jīng)尼莫地平治療后，TH陽性神經(jīng)元丟失程度明顯減輕，iNOS和COX-2陽性細胞較模型組顯著減少。圖像分析結(jié)果顯示差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。

2.3Westernblot檢測結(jié)果顯示，對照組小鼠中僅有微量iNOS、COX-2蛋白表達；模型組小鼠中iNOS、COX-2表達水平顯著升高；經(jīng)尼莫地平處理后，iNOS、COX-2蛋白表達水平較模型組明顯下降(P<0.05，見表3)；模型組TH表達較對照組降低，治療后出現(xiàn)明顯升高，模型組和尼莫地平處理組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表3)。

表1　小鼠懸掛實驗的評分結(jié)果(n﹦±s)

*P<0.05 vs 對照組；**P<0.05 vs 模型組

表2　各組小鼠中腦黑質(zhì)iNOS、COX-2和TH陽性細胞數(shù)

*P<0.05 vs 對照組；**P<0.05 vs 模型組

表3　各組小鼠黑質(zhì)iNOS、COX-2和TH蛋白表達水平

*P<0.05 vs 對照組；**P<0.05 vs 模型組

3　討　論

PD是中老年人常見的神經(jīng)退行性疾病之一，諸多機制參與了其發(fā)病過程，如中腦黑質(zhì)區(qū)氧化應激、慢性炎癥反應等。大量證據(jù)表明，炎癥反應與PD發(fā)生密不可分[5]。COX-2和iNOS作為重要的炎癥介質(zhì)，在多種PD模型中表達明顯增高，同時伴有多巴胺神經(jīng)元的大量丟失[6，7]，說明其可能參與了多巴胺神經(jīng)元變性丟失的過程。本實驗結(jié)果顯示，MPTP注射7 d后，與對照組比較，模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元顯著丟失，而iNOS和COX-2顯著表達，Westernblot結(jié)果顯示了同樣的趨勢。以上這些證據(jù)表明，炎癥因子iNOS和COX-2可能與多巴胺能神經(jīng)元丟失密切相關。

目前左旋多巴類藥物仍是治療該病的主要藥物，但長期應用會引起一系列嚴重的并發(fā)癥?？寡字委熞殉蔀榻關D治療的研究熱點。尼莫地平屬于臨床上常用的L型鈣通道拮抗劑，有報道顯示，在體外細胞培養(yǎng)中尼莫地平能通過減輕炎癥反應，從而起到保護多巴胺能神經(jīng)元的作用[8]。另有研究認為[9]，尼莫地平能顯著減輕PD大鼠模型所誘發(fā)的炎癥反應，從而對多巴胺神經(jīng)元起到保護作用。為進一步證實尼莫地平的抗炎作用，本實驗用其作為藥物干預，觀察了它對iNOS和COX-2表達的影響。結(jié)果顯示，與模型組比較，尼莫地平治療組中腦黑質(zhì)區(qū)iNOS和COX-2陽性細胞大幅減少，蛋白水平顯著下降，而TH陽性神經(jīng)元丟失程度明顯減輕。為進一步證實尼莫地平的神經(jīng)保護作用，本實驗采用懸掛試驗[10]衡量小鼠的力量及肢體運動協(xié)調(diào)情況，評估小鼠的運動功能，結(jié)果顯示模型組小鼠產(chǎn)生PD樣體征，肢體協(xié)調(diào)能力差，與對照組小鼠比較，運動能力明顯下降，尼莫地平處理后運動能力有很大改善。

綜上所述，在本實驗條件下，MPTP可誘導模型小鼠中腦黑質(zhì)iNOS和COX-2的高表達，最終參與多巴胺神經(jīng)元的變性丟失過程；尼莫地平可在一定程度上抑制iNOS和COX-2的表達，推測其可能通過影響炎癥的發(fā)展進程而對多巴胺神經(jīng)元起到一定的保護作用。

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Inhibitory effects of nimodipine on expressions of iNOS and COX-2 in substantia nigra of mice with Parkinson’s disease

LIYaxin，XUFan，QINLijuan，etal.

(SchoolofBasicmedicalSciences，NorthChinaUniversityofScienceandTechnology，Tangshan063000，China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of nimodipine on the dopaminergic neurons in the substantia nigra(SN)of MPTP-induced mouse model of Parkinson’s disease(PD). MethodsHealthy male C57BL/6N mice were randomly divided into three groups：control group which was treated with saline；model group which was injected with MPTP intraperitoneally；nimodipine group which was treated with nimodipine before injection of MPTP. The behavioral changes of different groups were observed，immunohistochemistry and Western blot methods were used to investigate the positive cell numbers and the protein expression of COX-2，iNOS and TH. ResultsCompared with control group，the MPTP model group showed PD-like symptoms with marked loss of Tyrosine hydroxylase(TH)-positive neurons，however，the expression level of COX-2 and iNOS increased significantly. After treating with nimodipine，the above changes were alleviated obviously. ConclusionIn the mouse model of Parkinson’s disease induced by MPTP，nimodipine may play a protective role on the dopaminergic neurons by inhibiting the expression of inflammatory mediators COX-2 and iNOS.

Parkinson’s disease；Tyrosine hydroxylase；Inducible nitric oxide synthase；Cyclooxygenase-2；Nimodipine；Mouse

1003-2754(2016)09-0799-03

2016-03-20；

2016-07-20

國家自然科學基金資助項目(No 81101912)；華北理工大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(No X2016243)

(1.華北理工大學基礎醫(yī)學院麻醉專業(yè)，河北 唐山 063000；2.華北理工大學基礎醫(yī)學院生理學系，河北 唐山 063000；3.華北理工大學基礎醫(yī)學院解剖學系，河北 唐山 063000)

張?zhí)?，E-mail：zhangtian791229@126.com

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