枸杞多糖對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其抗氧化應(yīng)激的機(jī)制研究

葛建彬，　盧紅建，　宋新建，　李　梅，　陳丹丹，　吳　鋒

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枸杞多糖對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其抗氧化應(yīng)激的機(jī)制研究

葛建彬1，2，盧紅建1，宋新建1，李梅2，陳丹丹3，吳鋒3

目的探討枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides，LBP)對缺血再灌腦損傷小鼠的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。方法通過頸總動脈栓線造成大腦中動脈缺血，缺血2 h后將栓線拔出以實現(xiàn)大腦中動脈血流再灌注，形成小鼠短暫性大腦中動脈阻塞(transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO)模型，觀察LBP(25 mg/kg，50 mg/kg和100 mg/kg)對小鼠腦梗死范圍，腦含水量，神經(jīng)癥狀的影響，采用Westernblot法檢測缺血大腦皮質(zhì)NOX4蛋白的表達(dá)，采用DHE染色法檢測腦組織中ROS的生成，采用分光光度計檢測缺血側(cè)腦組織勻漿SOD活力，GSH-Px活力，及MDA含量。結(jié)果LBP對缺血再灌注小鼠神經(jīng)癥狀有明顯的改善作用，能明顯降低腦梗死范圍和腦含水量。Westernblot結(jié)果顯示：小鼠缺血再灌后，缺血側(cè)大腦皮質(zhì)NOX4蛋白水平明顯增高，LBP能顯著降低NOX4蛋白水平。DHE染色顯示，LBP能顯著降低缺血再灌后ROS的生成。LBP能升高SOD和GSH-Px活力，降低MDA含量。結(jié)論LBP對缺血再灌注小鼠腦損傷有明顯保護(hù)作用，該作用可能與其抑制腦缺血再灌注引起的氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

枸杞多糖；腦缺血；氧化應(yīng)激；NOX4；ROS

腦梗死(cerebralischemia，CI)，是臨床常見病和多發(fā)病，具有極高的病死率和致殘率，且近年來有年輕化的趨勢，在發(fā)展中國家是第二或第三位導(dǎo)致個體死亡的原因，嚴(yán)重危害人類健康[1]。

枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides，LBP)是從茄科植物枸杞的成熟果實中提取而得的一種水溶性蛋白雜多糖，是枸杞的主要活性成分之一，具有調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤、延緩衰老、降血脂、降血糖等多種藥理作用[2]。最近Gao等[3]的研究表明，LBP通過調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元的凋亡和再生，從而提高腦外傷大鼠的認(rèn)知能力；Yang等[4]亦報道，LBP通過保護(hù)血腦屏障對腦缺血再灌注引起的腦損傷產(chǎn)生保護(hù)作用，提示LBP在神經(jīng)系統(tǒng)損傷中可能發(fā)揮重要作用。本實驗采用線栓法建立小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，觀察LBP對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及對氧化應(yīng)激的影響，以探討其治療缺血性腦卒中的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康6周齡ICR小鼠，清潔級，雄性，體質(zhì)量20～25 g，由南通大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2藥物與試劑枸杞多糖(LBP，寧夏沃福百瑞生物食品工程有限公司)；尼莫地平注射液(拜耳醫(yī)藥)；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；NOX4(CellSignalingTechnology公司)；β-actin(Sigma公司)；SOD，GSH-Px，MDA試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.3主要儀器體視顯微鏡(SZM45，寧波舜宇)，UV-2501PC紫外可見分光光度計(日本島津)，電子天平(AL104，Mettler-Toledo公司)，超聲細(xì)胞破碎儀(Sonics&Meterials公司)，蛋白定量儀(Biorad公司)，電泳儀(powerPAC2000，Biorad公司)，共聚焦熒光顯微鏡(C1SL，Nikon公司)，離心機(jī)(MicroCL21R，ThermoScientific，德國)。

1.4實驗分組將實驗小鼠隨機(jī)分為6組，每組30只，分別為假手術(shù)組、MCAO模型組、LBP大劑量組(100 mg/kg)、LBP中劑量組(50 mg/kg)、LBP小劑量組(25 mg/kg)和尼莫地平組(4 mg/kg)組。各組動物腹腔注射給藥，1次/d，連續(xù)7 d，末次給藥1 h后進(jìn)行手術(shù)。假手術(shù)組和模型組每次注射等量生理鹽水，其余實驗步驟與LBP干預(yù)組相同。

1.5小鼠腦缺血再灌注損傷(MCAO)模型的制備參考Longa等[5]的方法，制備小鼠腦缺血再灌注模型：用4%水合氯醛(350 mg/kg)將小鼠腹腔注射麻醉，仰臥位固定，注意保持呼吸通暢。酒精棉球頸部消毒，用手術(shù)剪沿頸中打開1 cm左右的切口。在體視顯微鏡下鈍性分離下頜下腺，游離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈，頸總動脈上用一絲線扎緊。在頸外動脈與頸總動脈分叉處用絲線打一松結(jié)，將頸外動脈遠(yuǎn)端用絲線結(jié)扎，用一燒紅的手術(shù)鑷將頸外動脈熔斷游離；用絲線將頸內(nèi)動脈扎緊，用顯微眼科手術(shù)剪刀將頸外動脈剪一小孔，將線栓通過小孔向下插入至頸外動脈，松開頸內(nèi)動脈上的線結(jié)，將線栓緩慢向頸內(nèi)動脈方向插入，直至感到阻力時即止，為防止出血，將頸外動脈上線結(jié)扎緊。頸部傷口常規(guī)縫合。缺血2 h后，將線栓拔出，使動脈血重新流通24 h。假手術(shù)組手術(shù)步驟同前，不插入線栓。術(shù)后將動物置于室溫25～28 ℃，自由飲水、進(jìn)食。

1.6神經(jīng)癥狀評分小鼠腦缺血再灌注24 h后，采用Longa(0-4分)5分制[5]對小鼠的神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評分：0分：活動正常，無神經(jīng)功能障礙者；1分：左前肢不能完全伸直；2分：爬行時向左轉(zhuǎn)圈者；3分：爬行時向左側(cè)傾倒；4分：意識喪失，不能行走者。

1.7腦梗死體積的測定小鼠腦缺血再灌注24 h后，斷頭取腦，迅速置于-20 ℃冰箱中冷凍20 min后取出，去除嗅球、小腦和低位腦干，在操作臺上將腦組織由前向后行2.0 mm厚的連續(xù)5片冠狀切片，將腦片置于1%的TTC(0.1 ml，1 mol/L KH2PO4)磷酸鹽緩沖液中，37 ℃避光溫浴30 min。用掃描儀按順序掃描染色后的腦片，采用計算機(jī)軟件系統(tǒng)測量腦梗死面積，并計算腦梗死區(qū)占大腦總體積的百分比。

1.8腦含水量測定小鼠腦缺血再灌注24 h后，快速斷頭取腦，稱取左右大腦半球濕重，置于電熱恒溫干燥箱中110～115 ℃烘烤至恒重，稱取干重。計算腦含水量，計算公式為：含水量=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%。

1.9WesternBlotting檢測將取好的小鼠大腦缺血側(cè)皮質(zhì)組織置于0.8 ml細(xì)胞裂解液中，低溫下超聲勻漿。離心機(jī)中12000 r/min、4 ℃離心10 min，分取上清液，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｈ∩鲜鎏幚磉^的1 μl溶液，采用BCA法測定各組蛋白含量，用配置好的細(xì)胞裂解液按比例調(diào)整蛋白濃度。樣品中加入上樣緩沖液，混合均勻后于95 ℃變性處理5 min。上樣，安排β-actin參照，SDS-PAGE電泳，電壓110 V，分離蛋白質(zhì)。電泳結(jié)束后，取出凝膠置于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡，凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用TBST溶液洗膜，常溫封閉1 h。封閉結(jié)束后，TBST溶液洗膜，將膜放入塑料袋中，按0.1 ml/cm2加入一抗溶液(NOX4，β-actin，1∶1000，5%脫脂牛奶溶液)，混勻后將塑料袋中的氣泡去除，用封膜機(jī)封口，置于4 ℃中過夜。次日取出硝酸纖維素膜，用TBST溶液漂洗3次，每次10 min。在膜上加入熒光二抗(1∶20000，用5%脫脂牛奶稀釋)，室溫下雜交爐中輕輕振蕩1 h，取出膜，PBS溶液中洗膜3次，每次10 min。用Odyssey Western Blot機(jī)器掃描獲取Western條帶圖片。

1.10DHE染色法檢測腦組織中ROS配置染色工作液：將染色液(ReagentB)置入冰槽里融化，稀釋液(ReagentC)置于室溫預(yù)熱。吸取500 μl染色液(ReagentB)至1.5 ml離心管，再加入500 μl稀釋液(ReagentC)，混合均勻，避光放置。小鼠腦組織用冰凍切片機(jī)切成20 μm厚的腦片，加上20 μl預(yù)冷的清理液(ReagentA)，鋪滿整個切片表面。小心移去切片上的清理液(ReagentA)，加上20 μl室溫預(yù)熱的染色工作液，鋪滿整個切片表面，置于37 ℃培養(yǎng)箱里孵育20 min。小心移去切片上的染色液，加上20 μl清理液(ReagentA)，小心移去切片上的清理液(ReagentA)，封片。激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察和攝片。

1.11腦組織SOD、GSH-Px及MDA的測定小鼠腦缺血再灌注24 h后，將各組小鼠斷頭處死，快速于冰浴上取出全腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，將小鼠缺血側(cè)腦組織以冰水預(yù)冷的生理鹽水制成10%腦組織勻漿。按照試劑盒說明書方法，分別測定SOD活力、GSH-Px活性及MDA含量。

2　結(jié)　果

2.1LBP對腦缺血再灌注小鼠腦梗死范圍的影響缺血再灌24 h后，假手術(shù)組小鼠腦組織沒有梗死灶，與假手術(shù)組比較MCAO組腦組織梗死百分比顯著升高；與MCAO組相比，給藥組LBP(100 mg/kg、50 mg/kg)組及尼莫地平組腦梗死范圍明顯減小(P<0.01，P<0.05，P<0.05)，提示LBP對小鼠缺血再灌注腦損傷有保護(hù)作用(見圖1)。

2.2LBP對腦缺血再灌注小鼠神經(jīng)功能缺損的影響缺血再灌24 h后，假手術(shù)組小鼠行為正常，無神經(jīng)功能缺損癥狀。MCAO組小鼠均出現(xiàn)明顯的神經(jīng)行為缺陷癥狀，給藥組LBP(100 mg/kg、50 mg/kg)及尼莫地平組能明顯減輕小鼠神經(jīng)癥狀(P<0.05，P<0.05，P<0.05)，提示LBP對缺血再灌注小鼠神經(jīng)損傷有明顯改善作用(見表1)。

2.3LBP對腦缺血再灌注小鼠腦含水量的影響缺血再灌24 h后，與假手術(shù)組比較MCAO組小鼠腦含水量明顯升高(P<0.01)，給藥組LBP(100 mg/kg、50 mg/kg)及尼莫地平組與MCAO組比較腦含水量明顯降低(P<0.05，P<0.05，P<0.05)，提示LBP能夠抑制缺血再灌注損傷引起的腦水腫(見表1)。

2.4LBP對腦缺血再灌注小鼠大腦皮質(zhì)NOX4蛋白表達(dá)的影響小鼠腦缺血再灌注24 h后，與假手術(shù)組相比，MCAO組小鼠大腦皮質(zhì)缺血區(qū)NOX4蛋白表達(dá)明顯增高。LBP(100 mg/kg、50 mg/kg、25 mg/kg)劑量組NOX4水平較MCAO組顯著降低(P<0.01)。提示LBP能夠抑制缺血損傷小鼠大腦皮質(zhì)NOX4表達(dá)的增高(見圖2)。

2.5LBP對小鼠缺血側(cè)腦組織ROS含量的影響DHE染色結(jié)果顯示，小鼠腦缺血再灌注24 h后，與假手術(shù)組相比，MCAO組小鼠大腦皮質(zhì)缺血區(qū)ROS含量明顯增高，LBP(100 mg/kg、50 mg/kg、25 mg/kg)劑量組ROS水平較MCAO組顯著降低(P<0.01)。提示LBP能夠抑制缺血損傷小鼠大腦皮質(zhì)ROS的生成。(見圖3)。

2.6LBP對小鼠缺血側(cè)腦組織勻漿SOD活性的影響與假手術(shù)組相比，MCAO組小鼠腦組織勻漿SOD活力明顯降低(P<0.01)，LBP(100 mg/kg、50 mg/kg、25 mg/kg)劑量組及尼莫地平組與MCAO組相比SOD活力明顯增高(P<0.01，P<0.01，P<0.05，P<0.01)，提示LBP能提高缺血再灌小鼠腦組織SOD活力(見表2)。

2.7LBP對小鼠缺血側(cè)腦組織勻漿GSH-Px活力的影響與假手術(shù)組相比，MCAO組小鼠腦組織勻漿GSH-Px活力明顯降低(P<0.01)，LBP(100 mg/kg、50 mg/kg、25 mg/kg)劑量組和尼莫地平組與MCAO組相比GSH-Px活力明顯增高(P<0.01，P<0.01，P<0.05，P<0.01)，提示LBP能提高缺血再灌小鼠腦組織GSH-Px活力(見表2)。

2.8LBP對小鼠缺血側(cè)腦組織勻漿MDA含量的影響與假手術(shù)組相比，MCAO組小鼠腦組織勻漿MDA含量明顯升高(P<0.01)，LBP(100 mg/kg、50 mg/kg)劑量組及尼莫地平組與MCAO組相比MDA含量明顯降低(P<0.01，P<0.05，P<0.05)，提示LBP能降低缺血再灌小鼠腦組織MDA含量(見表2)。

表1　LBP對腦缺血再灌注小鼠神經(jīng)功能缺損和腦含水量的影響±s)

*P<0.05，**P<0.01 vs vehicle

表2　LBP對小鼠缺血再灌注后SOD、GSH-PX、MDA的影響

*P<0.05，**P<0.01 vs vehicle

圖1LBP(100 mg/kg、50 mg/kg)組及尼莫地平組腦梗死范圍較模型組減小(P<0.01)

圖2LBP降低小鼠腦缺血再灌注24 h大腦皮質(zhì)NOX4水平，與假手術(shù)組比較##P<0.01，與模型組比較**P<0.01

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：LBP 100 mg/kg組；D：LBP 50 mg/kg組；E：LBP25 mg/kg組

3　討　論

在缺血性腦血管病的治療中，恢復(fù)缺血區(qū)的血流或加強(qiáng)對缺血區(qū)的血流供應(yīng)是減輕缺血對中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能損傷的必要條件。但是，大量研究表明，如果腦血流的疏通和恢復(fù)超過一定的時間點，不僅不能改善缺血引起的組織損傷和功能障礙，反而會造成神經(jīng)損傷進(jìn)一步加重，這種現(xiàn)象即缺血再灌注損傷。抑制再灌注損傷是治療缺血性腦血管病的重要環(huán)節(jié)[6，7]。本研究采用小鼠短暫性局灶性大腦中動脈阻塞模型觀察LBP對腦缺血再灌注損傷的作用，結(jié)果顯示LBP不但能夠改善缺血再灌注損傷小鼠的神經(jīng)功能障礙，而且能減小腦梗死體積，降低腦水腫的程度，說明LBP干預(yù)對小鼠腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。

腦缺血后，炎癥、凋亡、氧化應(yīng)激、興奮性毒性等多種因素相互作用，相互影響，從而加劇神經(jīng)損傷的發(fā)生、發(fā)展[8]。近年來的研究表明，氧化應(yīng)激反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷中起核心作用，腦缺血時，氧化應(yīng)激及其產(chǎn)生的超氧陰離子、羥自由基等活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)損害是急性腦缺血損傷的重要機(jī)制[9，10]。NADPH氧化酶是超氧陰離子專有催化酶，在氧自由基的產(chǎn)生過程中起著重要作用。NADPH氧化酶類有多種形式的亞單位復(fù)合體，腦組織中主要的NADPH氧化酶為其亞型NOX2，NOX4，NOX5等。在腦組織中，NOX4在內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)。研究表明，當(dāng)局灶性腦缺血發(fā)生時，NOX4的表達(dá)明顯上升，導(dǎo)致ROS的生成增多[11]。本實驗結(jié)果顯示，LBP能夠顯著下調(diào)缺血再灌引起的小鼠大腦皮質(zhì)NOX4表達(dá)的增高，從而抑制腦組織中ROS的生成，對小鼠腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。

腦缺血時產(chǎn)生的大量ROS過度消耗了機(jī)體內(nèi)源性抗氧化酶，導(dǎo)致多種酶的表達(dá)和活性發(fā)生改變，如SOD、GSH-Px、CAT等?？寡趸富钚缘慕档停鼓X組織清除ROS的能力下降，過量蓄積的ROS可引起脂肪氧化，蛋白質(zhì)氧化和DNA損傷，能量代謝衰竭，甚至細(xì)胞死亡[12]。MDA是ROS攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，其含量的變化間接地反映了氧自由基含量的變化及其對組織的損傷程度。本實驗結(jié)果顯示，LBP能明顯抑制缺血再灌損傷小鼠腦組織中ROS的生成，升高SOD活力和GSH-Px活力，減少M(fèi)DA含量，提示LBP可能通過減少自由基的生成，增強(qiáng)機(jī)體清除自由基能力，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，而減輕腦組織的損傷。

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Neuroprotection of LBP on a mouse model of transient focal cerebral ischemia and its protective mechanisms of inhibiting oxidative stress

GEJianbin，LUHongjian，SONGXinjian，etal.

(TheSecondPeople’sHospitalofNantong，Nantong226002，China)

ObjectiveTo observe the protective effects of lycium barbarum polysaccharides (LBP) on cerebral ischemia-reperfusion injury in mice and explore its mechanism. MethodsCerebral ischemia-reperfusion injury in mice was induced by middle cerebral artery occlusion. The neurological outcome，infarct size and water contents were evaluated. Western blotting was used to evaluate the protein levels of NOX4.DHE staining was used to evaluate levels of ROS. SOD and GSH-Px activity，MDA levels of ischemia cerebral tissue were determined by spectrophotometry using commercial kits. ResultsLBP markedly improved neurologic deficits，and decreased infarct size and edema at 24 h after reperfusion in mice. Western blot analysis indicated that LBP markedly down-regulated the protein level of NOX4. DHE staining indicated that LBP decreased the levels of ROS in ischemic cortex 24 h after reperfusion. SOD activity and GSH-Px activity in LBP groups was higher，and MDA level in LBP groups were significantly lower than those in vehicle group．ConclusionLBP has protective effects on cerebral ischemia-reperfusion injury in mice，and this effect may be associated with inhibiting oxidative stress induced by cerebral ischemia-reperfusion.

LBP；Cerebral ischemia；Oxidative stress；NOX4；ROS

1003-2754(2016)09-790-05

2016-03-15；

2016-09-03

國家自然科學(xué)基金青年項目(No．31500822)；南通市社會事業(yè)科技創(chuàng)新與示范計劃項目(No．HS2013020)

(1.南通市第二人民醫(yī)院，江蘇 南通 226002；2.蘇州大學(xué)藥理教研室，江蘇 蘇州 215123；3.南通大學(xué)藥理教研室，江蘇 南通 226001)

吳鋒，Email：cuileish@163.com

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