一例豬流行性腹瀉的診斷

韋國成

（靖遠(yuǎn)縣畜牧獸醫(yī)局，甘肅靖遠(yuǎn)　730600）

一例豬流行性腹瀉的診斷

韋國成

（靖遠(yuǎn)縣畜牧獸醫(yī)局，甘肅靖遠(yuǎn)730600）

2015年5月靖遠(yuǎn)縣東灣鎮(zhèn)某規(guī)模養(yǎng)豬場飼養(yǎng)的保育仔豬與育肥豬群陸續(xù)發(fā)病，臨床癥狀以嘔吐、腹瀉及嚴(yán)重脫水為主。根據(jù)臨床癥狀，初步診斷為豬流行性腹瀉。為了進(jìn)一步準(zhǔn)確快速作出確診，無菌采集發(fā)病病死豬體腸斷及內(nèi)容物，通過直接熒光抗體染色法與RT-PCR進(jìn)行診斷。結(jié)果證實(shí)該規(guī)模養(yǎng)豬場感染了豬流行性腹瀉病毒。

PEDV；熒光抗體染色法；Vero細(xì)胞；RT-PCR

豬流行性腹瀉（porcineepidemicdiarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起豬的一種急性接觸性腸道傳染病，其臨床癥狀以嘔吐、腹瀉、食欲下降和脫水為基本特征，病理變化以腸道黏膜上皮與固有層淋巴細(xì)胞浸潤、腸上皮細(xì)胞顆粒變性為主，呈現(xiàn)各個(gè)年齡的豬都可感染發(fā)病［1］。該病臨床癥狀與病理變化的明顯程度因病原株的不同及病豬月齡的大小而有差異，年齡越小，臨診癥狀越明顯；且該病與豬傳染性胃腸炎、仔豬副傷寒及豬輪狀病毒性腹瀉的臨床表現(xiàn)極為相似，表現(xiàn)出一種混合感染的態(tài)勢；在養(yǎng)豬場的流行性越來越嚴(yán)重，對(duì)于規(guī)模養(yǎng)殖場早做出診斷，可減少一定的經(jīng)濟(jì)損失，因此必須依靠實(shí)驗(yàn)室診斷才能做出確診［2］。2015年4月，東灣鎮(zhèn)某規(guī)模養(yǎng)殖場畜主送檢一病死仔豬，視診消瘦、皮下干燥、有脫水癥狀，且豬場多數(shù)保育仔豬與2.5月齡育肥豬群體發(fā)病，剖檢疑似為豬流性腹瀉。本次實(shí)驗(yàn)室診斷以特異性高、簡便及快捷的直接熒光抗體染色法（FAT）與反轉(zhuǎn)錄PCR試驗(yàn)做出確診。

1　材料與方法

1.1主要材料

東灣鎮(zhèn)該養(yǎng)豬場在無菌條件下采取的病死豬一段長10 cm新鮮空腸及腸內(nèi)容物。

1.1.1主要試劑與儀器倒置熒光顯微鏡（Leica公司）；豬流行性腹瀉病熒光抗體（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）；載玻片與蓋玻片（帆船牌）；1×PBS緩沖液、甘油（索萊寶公司）；伊文思藍(lán)（百靈威公司）；Vero細(xì)胞（上海中科院細(xì)胞庫）；Trizol Reagent cell試劑（Invitrogen）；核酸蛋白測定儀ND-1000（Nanodrop公司）；PrimeScriptTM RTreagentKitRR037A（TaKaRa公司）；PCR儀（Bio-RAD公司）；Marker I DNALadder、2×Taq PCR Master Mix（中科瑞泰）；紫外凝膠成像系統(tǒng)（捷達(dá)，江蘇）。

1.1.2主要試劑配制甘油緩沖鹽水：純甘油：PBS液按9∶1（v：v）；0.2%伊文思藍(lán)溶液：20 mg伊文思藍(lán)溶解于1×PBS液定容至100 ml。

1.2直接熒光抗體染色法

參照《中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》操作規(guī)程［3，4］。

1.2.1病料處理用手術(shù)剪將新鮮空腸剪開并置于結(jié)晶平皿中，加適量的PBS液用眼科鑷子輕輕漂洗，以此洗去腸內(nèi)容物，直至液清，作為樣本。

1.2.2腸上皮細(xì)胞洗脫物涂片本試驗(yàn)設(shè)陽性對(duì)照組、自發(fā)熒光對(duì)照組、抑制試驗(yàn)對(duì)照組及病料組。

將潔凈樣本置于50 ml離心管中，加適量PBS液后用玻璃棒攪拌，待PBS液渾濁后棄去空腸樣本，于4℃、1 000 r/min離心5 min，洗去上清液。用接種環(huán)挑取腸上皮細(xì)胞洗脫物涂布于載玻片上，每個(gè)樣本涂布3張載玻片。自然分干后，置丙酮中固定15 min，取出再自然風(fēng)干。

1.2.3染色用0.2%伊文思藍(lán)溶液稀釋豬流行性腹瀉病熒光抗體至染色效價(jià)為1∶16，將稀釋液直接滴在腸上皮細(xì)胞洗脫物載玻片上，置濕盒37℃靜置30 min。自發(fā)熒光對(duì)照組用PBS液代替熒光抗體染液，抑制試驗(yàn)對(duì)照組為染液是未加標(biāo)記的抗體稀釋液。

1.2.4洗滌傾去存留的熒光抗體，將載玻片用pH7.4的PBS液洗5次，3min/次，之后自然風(fēng)干。

1.2.5封載滴加甘油緩沖鹽水，加蓋玻片封固后鏡檢。

1.2.6結(jié)果判定依據(jù)細(xì)胞漿內(nèi)黃綠色熒光強(qiáng)弱判定結(jié)果，即亮綠色熒光：++++，黃綠色熒光：+++，較弱黃綠色熒光：++，僅有暗淡的熒光：+，無熒光：—。

1.3反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）

1.3.1引物設(shè)計(jì)根據(jù)PEDV單股正鏈RNA（28033nt）基因的結(jié)構(gòu)（圖1），在NCBI中查找較保守的可編碼纖突蛋白的S基因序列，利用Primer3.0在線設(shè)計(jì)一對(duì)引物，并應(yīng)用BLAST檢測該引物的特異性。引物序列為PEDV（S）-F：5′-GGTGGTCATAGTGGTGCCAA-3′，PEDV（S）-R：5′-TCCGTGACACC TTCAAGTGG-3′，擴(kuò)增片段大小為256bp。引物由北京六合華大基因合成。dom 6 mers（100μM）1μl、Total RNA 2μl、RNase Free Water 11μl，混勻后于PCR儀中，反應(yīng)條件為：37℃15 min、85℃5 s、4℃，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA待測濃度后可直接用于PCR。

圖1　 PEDV單股正鏈RNA基因的線性結(jié)構(gòu)

PCR反應(yīng)體系為10 μl：2×Es Taq Master Mix 5μl、PEDV（S）-F與PEDV（S）-R（10μM）各0.4μl、模板cDNA 1μl、RNase Free Water 3.2 μl，PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸20 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。同時(shí)以RNase Free Water代替模板的反應(yīng)液為空白對(duì)照，已檢測是否有污染存在。

1.3.6電泳PCR產(chǎn)物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，220V電泳20 min，紫外燈下觀察，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

2　結(jié)果

2.1豬流行性腹瀉病料直接熒光抗體染色

用疑似豬流行性腹瀉病病死豬體空?qǐng)錾掀ぜ?xì)胞涂片，經(jīng)豬流行性腹瀉病熒光抗體稀釋液染色后，在倒置熒光顯微鏡下觀察到黃綠色的熒光亮點(diǎn)，結(jié)果如下圖2所示。

1.3.2病料處理將腸內(nèi)容物用PBS做10倍稀釋，室溫靜置1 h，4℃、2 500 r/min離心8min，取上清后再于4℃、12 000 r/min離心5min，取上清后，用0.22μm孔徑的細(xì)菌濾器進(jìn)行過濾，收集上清于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3病毒增殖根據(jù)付夢(mèng)瑾等的方法［5，6］，在無菌條件下將過濾的上清液轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，盲傳4代，當(dāng)有80%的細(xì)胞發(fā)生CPE時(shí)收集所有細(xì)胞毒液于-20℃保存。

1.3.4病毒總RNA提取在300μl的病毒培養(yǎng)液中加入1ml的Trizol試劑，冰上靜置5 min，再加入0.2 ml的氯仿，顛倒混勻渦旋10 s，于4℃、12 000 r/min離心15 min，取上層無色液體，再加入0.5 ml的異丙醇，顛倒混勻室溫放置10 min，于4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清保留沉淀，再加入1ml的75%冰乙醇，渦旋2～3 s后，于4℃、7 500 r/min離心4 min，棄上清保留總RNA沉淀，室溫下風(fēng)干，加入30μL 0.05%的DEPC水溶解總RNA，于4℃條件下靜置30 min，用核酸蛋白測定儀測定總RNA的A260/A280、A260/A230及濃度值后，于-80℃保存。

1.3.5反轉(zhuǎn)錄RT-PCR總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，20μl反應(yīng)體系：5×Prime Script Buffer 4μl、Prime Script RT Enzyme MixI 1μl、Oligo dT Primer（50μM）1μl、Ran-

圖2　疑似豬流行性腹瀉病細(xì)胞涂片熒光

2.2豬流行性腹瀉病料RT-PCR

將疑似豬流行性腹瀉病病死豬的腸內(nèi)容物經(jīng)處理后，取上清液接種Vero細(xì)胞培養(yǎng)基中，進(jìn)行細(xì)胞病原克隆，提取總RNA，測得其A260/A280＞2.0、A260/A230＞2.5，說明總RNA純度高。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，結(jié)果見圖3，可見電泳條帶與理論值大小256bp相一致，空白對(duì)照孔未見有擴(kuò)增亮帶，結(jié)果說明該擴(kuò)增產(chǎn)物為目的PEDV-S基因DNA。

圖3　 RT-PCR結(jié)果

3　小結(jié)與討論

豬流行性腹瀉于20世紀(jì)70年代首先在歐洲被分離到，目前全球各地該病原均有發(fā)現(xiàn)，尤其是在中國與東南亞由該病引起的仔豬發(fā)病率與死亡率明顯高于歐洲［7］。近年來，根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室診斷統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，PEDV的陽性檢出率顯著地高于豬傳染性胃腸炎病毒的［8］。自本世紀(jì)我國對(duì)本國規(guī)定的一類動(dòng)物疫病全面實(shí)施國家動(dòng)物疫病強(qiáng)制免疫計(jì)劃以來，要求對(duì)高致病性禽流感、口蹄疫、高致病性豬藍(lán)耳病、豬瘟等4種動(dòng)物疫病實(shí)行強(qiáng)制免疫，其群體免疫密度常年維持在90%，但是對(duì)于規(guī)定的二三類動(dòng)物疫病疫苗免疫預(yù)防工作因各地區(qū)各養(yǎng)殖場重視程度差異性，造成PED在各養(yǎng)豬場流行性愈演愈烈，呈現(xiàn)為一種四季常發(fā)??；而且因近來幾個(gè)月生豬肉價(jià)普遍較低，各養(yǎng)殖場在管理消毒等方面有所懈怠，常常伴隨其他豬病的流行呈現(xiàn)混合感染的趨勢，給養(yǎng)殖戶造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。因此對(duì)于豬流行性腹瀉的診斷僅僅依靠流行病學(xué)、臨床癥狀及病理解剖很難做出確診，必須依靠實(shí)驗(yàn)室診斷。目前，作為實(shí)驗(yàn)室檢測方法有病原分離鑒定、微量血清中和試驗(yàn)、免疫電鏡（IEM）、ELISA、直接免疫熒光法（FAT）及RT-PCR。病原分離因其需要一套成熟的細(xì)胞培養(yǎng)體系，且需傳袋鼠次才可見明顯的CPE，該方法目前尚不能推廣應(yīng)用；微量血清中和試驗(yàn)需要標(biāo)準(zhǔn)的毒株作為參照及細(xì)胞培養(yǎng)；一般實(shí)驗(yàn)室不具備有價(jià)格高昂的電鏡設(shè)備；ELISA可用于PEDV與TGEV的鑒別診斷，但該方法對(duì)病料的前期處理比較繁瑣；FAT具有較高的準(zhǔn)確性與特異性，可在1～2 h即可得出診斷結(jié)果，崔現(xiàn)蘭等對(duì)FAT用于豬流行性腹瀉診斷做了大量研究，結(jié)果表明直接免疫熒光法得檢出率為91.4%，比電鏡法更可靠更靈敏［9］；RT-PCR用發(fā)病豬的糞便在4～6h內(nèi)即可做出早期診斷，而且可重復(fù)性相對(duì)最好［10］。綜上所述，直接免疫熒光法和RT-PCR準(zhǔn)確性與特異性比較高，相對(duì)比較快捷方便，可廣泛應(yīng)用于豬流行性腹瀉的實(shí)驗(yàn)室診斷。

本次對(duì)一豬流行性腹瀉病例進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室的診斷，基于PEDV與標(biāo)記熒光抗體反應(yīng)的FAT法與編碼纖突蛋白S基因的PEDV自然感染毒株的診斷RT-PCR方法，診斷試驗(yàn)結(jié)果的特異性、準(zhǔn)確性及可靠性較高，可為實(shí)驗(yàn)室對(duì)豬流行性腹瀉疫情的鑒別診斷提供了新的技術(shù)手段與依據(jù)。

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［本文獲甘肅省首屆獸醫(yī)系統(tǒng)征文比賽一等獎(jiǎng)］

（編輯：趙鵬飛）

S858.28

A

1006-799X（2016）15-0011-03

韋國成（1986-），男，甘肅靖遠(yuǎn)人，助理獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物防疫工作。