高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法測定健兒寶顆粒中黃芪甲苷含量

謝紫薇，譚天林，王璦萍，陳玉瓊，傅昌吉，廖　芳

(四川省成都市新都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，四川成都610500)

高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法測定健兒寶顆粒中黃芪甲苷含量

謝紫薇，譚天林，王璦萍，陳玉瓊，傅昌吉，廖芳

(四川省成都市新都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，四川成都610500)

目的建立測定健兒寶顆粒中黃芪甲苷含量的高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器（HPLC-ELSD）法。方法色譜柱為Inertsil ODS-2柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-水（32∶68），柱溫35℃，流速1.0 mL/min;ELSD參數(shù)，載氣流速2.5 L/min，漂移管溫度95℃。結(jié)果黃芪甲苷進樣量在1.004 8～12.057 6 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關系（r=0.999 8），平均回收率為101.67%，RSD為1.49%(n=6)。結(jié)論該方法操作簡便、快速、準確，可作為健兒寶顆粒的含量測定方法。

高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法;健兒寶顆粒;黃芪甲苷;含量測定

健兒寶顆粒由黃芪、桂枝、白芍、白術、大棗、山藥、山楂(焦)等15味中藥組方，是成都市新都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院在傳統(tǒng)經(jīng)驗方基礎上研制開發(fā)的中藥制劑，具有益氣合營、健脾開胃等功效，臨床使用多年，療效較好。該制劑質(zhì)量標準中僅對黃芪甲苷進行定性鑒別，無含量測定項。黃芪功能甘溫益氣、扶正固表，用量是處方中其他藥味的2～4倍，為方中君藥，故控制黃芪的含量非常重要。黃芪甲苷是黃芪的主要活性成分［1-2］，具有良好的免疫調(diào)節(jié)［3］、抗炎［4-5］、抗病毒［6］、臟器保護［7-8］、神經(jīng)細胞保護作用［9-10］，并具有一定的氧自由基清除作用［11］。目前，蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)較多應用于皂苷類成分分析［12］，多采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測（HPLC-ELSD）法檢測制劑中黃芪甲苷的含量［13-16］。為更好地控制該制劑的質(zhì)量提供參考，筆者對此進行了研究，現(xiàn)報道如下。

1　儀器和試藥

1.1儀器

Agilent-1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司);Alltech ELSD 2000ES型蒸發(fā)光檢測器(美國奧泰科技有限公司);TGL-16G型離心機(上海安亭科學儀器廠);SY7200-D型超聲波清洗儀(上海聲源超聲儀器設備有限公司);BT125D型電子天平(賽多利斯科學儀器＜北京＞有限公司);AE 260-S型電子天平(瑞士梅特勒科學儀器有限公司)。

1.2試藥

健兒寶顆粒(批號為140901，150501，151101)，陰性樣品均為我院醫(yī)院制劑;黃芪甲苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為200613);乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司，批號為111760)，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱:Inertsil ODS-2柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);柱溫:35℃;流動相:乙腈-水(32∶68);流速: 1.0 mL/min;漂移管溫度:95℃;載氣流速:2.5 L/min。理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計算不得低于4 000。

2.2溶液制備

稱取黃芪甲苷對照品25.12 mg，精密稱定，加甲醇溶解并定容至25 mL，即得對照品溶液(質(zhì)量濃度為1.004 8 g/L)。取供試品(批號151101)約2 g，磨成細粉，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，回流提取40 min，放冷，用甲醇補足質(zhì)量，搖勻過濾，精密量取續(xù)濾液25 mL，水浴蒸干;殘渣加水10 mL微熱使溶解，用飽和的正丁醇振搖提取3次，每次30 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次30 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。按處方取除黃芪外的其他藥材，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3方法學考察

專屬性試驗:分別吸取2.2項下3種溶液，按擬訂色譜條件進行測定。結(jié)果表明，主峰分離度符合要求，且陰性對照品溶液色譜在黃芪甲苷出峰處無干擾。色譜圖見圖1。

圖1　高效液相色譜圖

線性關系考察:分別精密量取對照品溶液適量，加甲醇稀釋成系列標準溶液(質(zhì)量濃度分別為0.050 24，0.100 48，0.200 96，0.301 44，0.401 92，0.502 40，0.602 88 g/L)，按擬訂色譜條件，分別進樣20 μL。以黃芪甲苷進樣量對數(shù)值為橫坐標(X)、其峰面積對數(shù)值為縱坐標(Y)進行線性回歸，得回歸方程Y=1.618 9X+ 2.769 6，r=0.999 8(n=7)。結(jié)果表明，黃芪甲苷進樣量在1.004 8～12.057 6 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系。

精密度試驗:精密吸取同一對照品溶液20 μL，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，結(jié)果見表1。結(jié)果的RSD為1.00%(n=6)，表明該儀器精密度良好。

重復性試驗:取同一批樣品，精密稱取6份，按2.2項下方法制備供試品溶液6份，按擬訂色譜條件依次測定。結(jié)果見表1，平均含量為1.221 4 mg/g，RSD為1.66%(n=6)，表明方法重復性良好。

穩(wěn)定性試驗:精密吸取同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12 h時分別進樣20 μL，測定峰面積。結(jié)果見表2，黃芪甲苷含量的RSD為1.02%(n=7)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

表1　精密度及重復性試驗結(jié)果

表2　穩(wěn)定性試驗結(jié)果

加樣回收試驗:精密稱取已知含量的供試品(批號為150501，含量為1.091 4 mg/g)細粉6份，每份2 g，分別精密加入質(zhì)量濃度為1.008 g/L的黃芪甲苷對照品溶液2 mL，再分別精密加入甲醇50 mL，按2.2項下方法制備供試品溶液，依法測定，計算回收率。結(jié)果見表3。

表3　黃芪甲苷加樣回收試驗結(jié)果（n=6）

2.4樣品含量測定

取供試品(批號為140901，150501，151101)3批，按2.2項下方法制備成供試品溶液，測定并計算黃芪甲苷的含量。結(jié)果見表4。

表4　樣品含量測定結(jié)果

3　討論

3.1指標成分選擇

處方中黃芪屬君藥，用量大，測定黃芪甲苷的含量對于控制制劑質(zhì)量有較大意義，故選用黃芪甲苷作指標成分進行含量測定。

3.2檢測方法確定

黃芪甲苷為皂苷類成分，在紫外末端有吸收，干擾大，基線不穩(wěn)定。ELSD為質(zhì)量通用型檢測器，重復性和穩(wěn)定性均較好，且方法簡便，易測定。

提取方式選擇:對供試品的提取方式(超聲和回流)和提取時間(30，40，60 min)進行考察，采用回流提取比超聲提取的黃芪甲苷含量更高，從時間和成本的角度考慮，選擇回流提取40 min。

［1］張氵昊.淺談中藥黃芪的化學成分及藥理作用［J］.當代醫(yī)藥論叢，2015，13（12）:45-46.

［2］孫政華，邵晶，郭玫.黃芪化學成分及藥理作用研究進展［J］.中醫(yī)臨床研究，2015，7（25）:22-25.

［3］林琳，沈洪，王立新，等.黃芪甲苷、β-欖香烯對小鼠樹突狀細胞免疫功能的影響［J］.東南大學學報，2011，30（2）: 294.

［4］Wang S，Li J，Huang H，et al.Antihipatitis B virusacti vities of astragalosideⅣisolated from radix A stragali［J］.Biol-Pharm Bull，2009，32（1）:132-135.

［5］Zhang WJ，Hufnaql P，Binder BR，et al.Antiinflammatory activity of astragalosideⅣis mediated by inhibition of NF-kappa B activation and adhesion molecule expression［J］.Thromb Haemost，2003，90(5):904-914.

［6］Zhang YY，Zhu HY，Huang CG，et al.AstragalosideⅣexerts antiviral effects against coxsackievirus B3 by upregulating interferon gamma［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2006，47(2):190.

［7］Liu H，Wei W，Sun WY，et al.Protective effects of astragalosideⅣon porcineserum-induced hepatic fibrosis in rats and in vitro effects on hepatic stellate cells［J］.JE thnopharmacol，2009，122（3）:502-508.

［8］Qi H，Wei L，Han Y，et al.Proteomic characterization of the cellular response to chemopreventive triterpenoid astragalosideⅣin human hepatocellular carcinoma cell line HepG2［J］.Int J Oncol，2010，36(3):725.

［9］Chan WS，Duraira JS，Lu JH，et al.Neuroprotective effects of astragalosideⅣin 6-hydroxydopam intreated primarynigral cell culture［J］.Neurochem Int，2009，55（6）:414-422.

［10］Zhu SQ，Qi L，Rui YF，et al.AstragalosideⅣinhibits spontaneous synaptic transmission and synchronized Ca2+o scillations on hippocampal neurons［J］.Acta Pharmacol Sin，2008，29（1）: 57-64.

［11］Qiu LH，Xie XJ，Zhang BQ.AstragalosideⅣimproves homocysteine-induced acute phase endothelial dysfunction via antioxidation［J］.Biol Pharm Bull，2010，33(4):641-646.

［12］趙宇新，李曼玲.蒸發(fā)光散射檢測器在中藥成分分析中的應用［J］.中國中藥雜志，2003，28（10）:913-917.

［13］王紅，楊慈海，宋軍，等.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法測定抗栓通絡丸中黃芪甲苷含量［J］.中國藥業(yè)，2016，25（4）:75-77.

［14］吳高芬.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射器法測定芪芳氣血顆粒中黃芪甲苷含量［J］.中國藥業(yè)，2015，24（12）:60-62.

［15］葛德洲，鄧祖磊.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測定甜夢膠囊中黃芪甲苷含量［J］.中國藥業(yè)，2015，24（5）:31-32.

［16］莊妍，朱紅，范其坤，等.HPLC-ELSD法測定九味腎清顆粒中黃芪甲苷的含量［J］.南昌大學學報（醫(yī)學版），2015，55（4）:18-21.

Content Determination of Astragaloside Ⅳin Jianerbao Granules by HPLC-ELSD

Xie Ziwei，Tan Tianlin，Wang Aiping，Chen Yuqiong，F(xiàn)u Changji，Liao Fang
（Xindu Hospital of Traditional Chinese Medicine，Chengdu，Sichuan，China610500）

ObjectiveTo establish the content determination method of astragalosideⅣin Jianerbao Granules by HPLC-ELSD. MethodsThe Inertsil ODS-2 column（150 mm×4.6 mm，5 μm）was adopted，the mobile phase was acetonitrile-water（32∶68），the column temperature was 35℃，the flow rate was 1.0 mL/min，the gas flow rate was 2.5 L/min，the drift tube temperature was 95℃. ResultsThe injection volume of astragalosideⅣshowed good linear relationship with the peak area in the range of 1.004 8-12.057 6 μg（r=0.999 8），the average recovery rate was 101.67%，RSD=1.49%（n=6）.ConclusionThis method is simple to operate，it is rapid and accurate，and can be used as the quality control method of Jianerbao Granules.

HPLC-ELSD；Jianerbao Granules；astragalosideⅣ；content determination

R284.1;R286.0

A

1006-4931（2016）13-0077-03

謝紫薇(1981-)，女，漢族，碩士研究生，高級工程師，主要從事中藥制劑質(zhì)量評價工作，(電子信箱)657064681@qq.com。

2016-02-06;

2016-03-20）