綠色熒光蛋白的原核表達純化用于基因工程大實驗的設(shè)計

張會勇 蔡亞麗 張青苗 張孟丹 胡嘯 井長勤

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 河南新鄉(xiāng) 453003）

綠色熒光蛋白的原核表達純化用于基因工程大實驗的設(shè)計

張會勇 蔡亞麗 張青苗 張孟丹 胡嘯 井長勤

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 河南新鄉(xiāng) 453003）

目的 通過設(shè)計基因工程實驗為一綜合性探究實驗，使學(xué)生全面掌握并提升基因工程相關(guān)實驗技能。方法 借助于綠色熒光蛋白的原核表達及純化實驗，使學(xué)生掌握了基因的克隆與表達、以及蛋白純化等綜合實驗性技術(shù)方法。結(jié)果 將以前支離破碎的一個個單個實驗環(huán)環(huán)相扣成為一個整體，最終學(xué)生可獲得一個肉眼可見的基因工程產(chǎn)物即綠色熒光蛋白。結(jié)論 通過基因工程實驗的改革提高了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，得到了良好的學(xué)習(xí)效果。

基因工程實驗 綠色熒光蛋白 原核表達

如今分子生物學(xué)已成為生命科學(xué)的通用語言,因此誕生于分子生物學(xué)的基因工程實驗技術(shù)也被列為生命科學(xué)相關(guān)專業(yè)的主干課程［1-2］,所以掌握基因工程相關(guān)技術(shù)已成為生命科學(xué)相關(guān)專業(yè)人才的必備技能［3］。新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院為生物技術(shù)及生物工程專業(yè)已開設(shè)基因工程實驗10年左右,基本內(nèi)容包括電泳技術(shù)［瓊脂糖凝膠與聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）］,聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）技術(shù)、質(zhì)粒提取、感受態(tài)制備、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及蛋白印跡（western blotting）等技術(shù)。雖然開設(shè)內(nèi)容也達到了培養(yǎng)生物技術(shù)及工程相關(guān)人才的基本要求,但相關(guān)實驗內(nèi)容連貫不強,加上分子水平操作的枯燥及目標產(chǎn)物不可見性,導(dǎo)致學(xué)生雖然實驗之初興趣頗高,實驗最后卻不能有效將相關(guān)實驗銜接,最終導(dǎo)致最終興趣缺乏,達不到設(shè)想的教學(xué)效果。所以有必要對相關(guān)課程實驗進行改革、重置為綜合性實驗,用一個實驗內(nèi)容將上述技術(shù)串聯(lián)起來。

綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）首先在1962年由Shimomura等首先從多管水母中分離［4］,已證實可在大腸桿菌中表達出活性的GFP［5-6］,日光下菌體呈綠色［5］,且其表達純化步驟較為簡單［6］。所以作者設(shè)計GFP的原核表達及純化為一個綜合性實驗,通過將GFP基因克隆、酶切、連接、轉(zhuǎn)化以及篩選、表達及純化等,使學(xué)生通過綜合性實驗獲得了一個基因工程的可見產(chǎn)物,極大提高了學(xué)生的實驗興趣及成就感?，F(xiàn)將實驗的詳細方案報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

Pfu酶、PCR產(chǎn)物液體回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；限制性內(nèi)切酶Nco I、BamH I與DNA連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司；BspH I酶購自美國NEB公司；引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；BL-21,pcDNA3.1-GFP由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 GFP原核表達重組子的構(gòu)建 引物設(shè)計：因為GFP序列（GenBank： AB594822.1）中含有Nco I序列,在設(shè)計上游引物時用了Nco I的同尾酶BspH I,然后用Oligo6軟件設(shè)計了它的表達引物并預(yù)測了其退火溫度。引物序列如下：GFP上游引物：5-GCGTCATGA（BspHI）CTAGCAAAGGAGAAGA-3；GFP 下游引物：5-GCGCGGATCC（BamHI）TCAGTTGTACAGTTCATCCATGCCA-3。首先以引物GFP 上游引物與GFP 下游引物組合,以真核生物表達載體pcDNA3.1-GFP為模板, PCR擴增GFP的開放閱讀框即 （open reading frame,ORF）,擴增條件如下：94℃預(yù)變性5 min后,94℃1 min,51℃1 min,72℃1 min, 30個循環(huán),72℃終延伸10 min,反應(yīng)體系為100 μL,液體回收純化PCR產(chǎn)物洗脫至50μL,并進行定量,濃度約0.15 g·L-1。然后分別用20U的BamHI和BspHI限制性內(nèi)切酶對2μg回收PCR產(chǎn)物進行酶切、純化,對PET28a（1.5mL菌液經(jīng)質(zhì)粒提取試劑盒（小量）進行提取,最后用50μL洗脫液洗脫可獲得約1μg質(zhì)粒）用BamH I與Nco I進行雙酶切、然后液體回收酶切產(chǎn)物；計算酶切載體與回收片段的摩爾比。按照載體片段1：10（0.3：0.03pmol）的比例進行T4 DNA連接酶16℃連接1 h,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細菌,涂布于表面涂有為20%（W/V）的乳糖（Luria-Bertani,LB）固體培養(yǎng)基（50 mg·L-1卡那霉素）37℃培養(yǎng)過夜；挑取變綠的陽性克隆, 擴大培養(yǎng)。

圖1 GFP PCR產(chǎn)物的擴增

圖2 陽性克隆的篩選

1.2.2 GFP蛋白的表達與純化 將篩選平板上變綠的陽性克隆接種于5mL試管中（含50 mg·L-1卡那霉素）,培養(yǎng)過夜,然后轉(zhuǎn)接于250mL LB培養(yǎng)基1L搖瓶中,200 r·min-1培養(yǎng)5 h后,加入濃度為20%的乳糖至終濃度為2%,繼續(xù)培養(yǎng)6～8 h,至肉眼可見菌體變綠,6 000r·min-1×5 min收集菌體。GFP的純化參閱文獻［6］；提純GFP蛋白用SDS-PAGE鑒定蛋白純度。

圖3 GFP蛋白SDS-PAGE電泳圖

2 結(jié)果

2.1 PCR結(jié)果結(jié)果見圖1。由圖1可以看出,PCR擴增產(chǎn)物分子量為750 bp附近,與預(yù)期相符,條帶單一可以進行下一步酶切實驗。

1：marker；2：GFPPCR擴增產(chǎn)物。

2.2 陽性克隆的篩選 結(jié)果見圖2。由圖2可見,LB平板上綠色克隆均為陽性克隆,因乳糖誘導(dǎo)GFP表達而使陽性克隆在平板上變?yōu)榫G色。

2.3 GFP蛋白的純化結(jié)果 結(jié)果見圖3。由圖3可以看出,誘導(dǎo)菌體蛋白（泳道2）相對于未誘導(dǎo)對照菌體蛋白（泳道1）,已成功誘導(dǎo)出目的蛋白,且誘導(dǎo)菌體蛋白經(jīng)硫酸銨沉淀及萃取等步驟后,可獲得電泳級的純化GFP（泳道4）。

1：蛋白分子量標準；；2：BL21-pET28a菌株表達的蛋白； 3：BL21-pET28a-GFP 菌株誘導(dǎo)表達蛋白； 4：GFP純化蛋白。

3 討論

本文首先規(guī)范化了GFP的原核表達實驗及純化步驟,使之成為一個學(xué)生可操作的實驗。

由GFP原核表達的綜合性實驗步驟我們可以看出,通過實驗操作使學(xué)生掌握了載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、篩選、表達與蛋白純化等技術(shù),不但使學(xué)生掌握了基因工程核心要素“目的基因克隆、酶切、連接、轉(zhuǎn)化及篩選”等上游過程,同時也使學(xué)生熟悉了蛋白純化部分基因工程下游技術(shù)。在此過程中同學(xué)們也學(xué)會了質(zhì)粒提取、DNA瓊脂糖凝膠電泳與SDS-PAGE蛋白電泳技術(shù)以及蛋白表達和純化等實驗技術(shù)。將以前支離破碎的一個個單個實驗環(huán)環(huán)相扣成為一個整體。

另外,GFP是從水母中首先克隆出來的基因,能夠通過原核表達獲得其活性產(chǎn)物,使學(xué)生更直觀的認識到了基因工程可以跨越物種障礙,感受到基因工程的魅力。

GFP表達產(chǎn)物在日光下為肉眼可見的綠色,我們在篩選的卡那霉素抗性LB平板上涂了20%的半乳糖溶液,可直接通過綠色熒光蛋白的表達使陽性克隆變成綠色（圖2）,陽性與非陽性克隆一眼就能識別,并且肉眼可見的陽性克隆不存在假陽性問題,無需再用PCR及測序進行再次驗證。

第三,GFP蛋白的純化步驟相對簡單,僅需用硫酸銨及乙醇沉淀與萃取步驟即可得到電泳級的蛋白（圖3）,可使學(xué)生了解蛋白的純化一些基本技術(shù)。

本文通過設(shè)計GFP蛋白的原核表達及純化實驗為基因工程綜合實驗,改革了以前通過一個個單一實驗使學(xué)生逐項掌握單個技術(shù)為目的,變?yōu)槭箤W(xué)生通過一個綜合大實驗,將逐個單一技術(shù)通過一個綜合實驗串聯(lián)起來,成為一個有機整體。通過此次實驗,學(xué)生可獲得一個肉眼可見的基因工程產(chǎn)物即綠色熒光蛋白,所以此次基因工程實驗的改革提高了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣,得到了良好的學(xué)習(xí)效果。

［1］邢萬金，扈延茂.本科基因工程大實驗教學(xué)改革的實踐和體會［J］.生物學(xué)通報，2007，42（2）：48-50.

［2］陳魯勇，孟和，許文平，等.分子生物學(xué)實驗教學(xué)改革與實踐［J］. 實驗室研究與探索，2008，27（12）：121-122.

［3］王文鋒，范雪暉，穆靈敏，等.生物技術(shù)專業(yè)基因工程實驗教學(xué)的改進與實踐［J］.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，01：99-100.

［4］Shimomura，O.，F(xiàn).H.Johnson，and Y.Saiga.Extraction， purification and properties of aequorin，a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan，Aequorea［J］.J Cell Comp Physiol，1962，59：223～239.

［5］張會勇，魯勇，孟雨菡，等.VEGF183（132-158）肽段作為蛋白緩釋藥物載體的細胞外基質(zhì)結(jié)合研究［J］.藥物生物技術(shù)，2010，03：198-202.

［6］Yakh nin AV，Vin ok urov LM， Su rin AK，et al . Green fluorescent protein purification by organic extraction ［J］.Protein Expr Purif，1998，14：382-386.

Q-4

A

1674-2060（2016）03-0001-02

2014年度河南省高等教育教學(xué)改革省級重點研究項目（編號：2014SJGLX050）

張會勇（1976—），男，漢族，博士，副教授，主要從事肽類藥物及腫瘤疫苗研究。