蠶豆根尖微核技術(shù)的方法學(xué)新論

王五香，高丹，廖芬，周芙蓉，封少龍,*

1.南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，衡陽421001

2.南華大學(xué)圖書館，衡陽421001

蠶豆根尖微核技術(shù)的方法學(xué)新論

王五香1,2，高丹1，廖芬1，周芙蓉1，封少龍1,*

1.南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，衡陽421001

2.南華大學(xué)圖書館，衡陽421001

雖然蠶豆根尖微核技術(shù)已是一個成熟規(guī)范的檢測污染物遺傳毒性的方法，但其中仍涉及一些重要的方法學(xué)問題值得深入探討和研究。本文在圖示正確觀測蠶豆根尖細(xì)胞內(nèi)微核和染色體畸變，如染色體斷裂、丟失及染色體橋等的基礎(chǔ)上，提出應(yīng)該對蠶豆根尖分裂相細(xì)胞及其染色體畸變進(jìn)行觀測，以便更加準(zhǔn)確、細(xì)致地反映污染物作用的劑量-效應(yīng)關(guān)系和分子機(jī)制。同時還就該方法的其他重要問題提出了自己的觀點，供同行們深入探討和研究，使之不斷完善，更好地服務(wù)于環(huán)境監(jiān)測和風(fēng)險評價等領(lǐng)域。

蠶豆；微核；染色體畸變；形態(tài)學(xué)；方法學(xué)

王五香,高丹,廖芬,等.蠶豆根尖微核技術(shù)的方法學(xué)新論[J].生態(tài)毒理學(xué)報，2016,11(3):86-91

Wang W X,Gao D,Liao F,et al.New views on the methodology of micronucleus assay withVicia fabaroot tip cells[J].Asian Journal of Ecotoxicology, 2016,11(3):86-91(in Chinese)

環(huán)境污染物的遺傳毒性一直是人們最關(guān)心的問題[1-2]。微核是環(huán)境污染物誘導(dǎo)細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目變異的結(jié)果，被廣泛用作指示污染物遺傳毒性的細(xì)胞生物標(biāo)志物[3-6]。

蠶豆根尖微核技術(shù)由于準(zhǔn)確、快速、有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系等特點，操作簡便、適于大批量樣品的檢測等優(yōu)點，特別是可以直接檢測或監(jiān)測實際環(huán)境樣品的遺傳毒性，樣品不需要復(fù)雜的前處理，沒有濃縮，直接反映了實際環(huán)境的本來情況，被廣泛應(yīng)用于輻射損傷、化學(xué)誘變、環(huán)境監(jiān)測及風(fēng)險評價等領(lǐng)域[6-9]。許多國家和世界組織，如中國、美國、日本、歐盟成員國、聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署及世界衛(wèi)生組織等，都把它作為一種常規(guī)的環(huán)境污染檢測指標(biāo)[9-11]。

雖然發(fā)展到現(xiàn)在，蠶豆根尖微核技術(shù)已是一個成熟規(guī)范的方法，但筆者根據(jù)10多年從事該技術(shù)的經(jīng)驗，覺得其中仍涉及一些問題值得深入探討和研究。

1 染色體畸變與微核（Chromosome aberration and micronucleus）

染色體畸變是指生物細(xì)胞染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的變異。由于環(huán)境遺傳毒物作用所引起的細(xì)胞DNA或染色體損傷，如得到不及時正確的修復(fù)，在有絲或減數(shù)分裂過程中將形成染色體斷裂片或雙著絲點染色體。這些染色體斷片由于缺少著絲點，在分裂過程中，得不到紡錘絲的牽引，不能運動到達(dá)兩極的子核中去，留在細(xì)胞質(zhì)中形成微核[3]。通過這種方式形成的微核通常體積小(圖1A)。而雙著絲點的染色體則在細(xì)胞分裂的后期和末期形成染色體橋，最終形成染色質(zhì)橋連接兩子細(xì)胞(圖1D-G)。Fenech等[12]認(rèn)為染色體(質(zhì))橋是檢測染色體重排的敏感指標(biāo)。此外，環(huán)境污染物也可能干擾有絲分裂器的正常生理功能，影響部分染色體的正常分離到子細(xì)胞中去，使一個或幾個染色體滯后(或稱染色體丟失)，不能進(jìn)入兩極的子細(xì)胞核，留在細(xì)胞質(zhì)中，形成微核。通過這種方式形成的微核通常較大或形成幾個微核(圖1B、C)。

為使初學(xué)者建立染色體畸變與微核的直觀認(rèn)識，本文首先圖示了中期、后期和末期染色體斷裂和丟失，并聯(lián)系了微核的形成(圖2)。如圖2，A、D和G分別示出了中期、后期和末期染色體斷裂，其中的染色體斷裂片經(jīng)有絲分裂后，可形成如圖1A所示的微核；B為兩極各有一染色體丟失的中期相細(xì)胞，經(jīng)有絲分裂后，可在兩個子細(xì)胞中都形成微核(圖2C)；E和H分別為后期和末期染色體丟失，經(jīng)有絲分裂后，可形成圖1B、C或圖2C、F樣的微核。

雖然微核的形成是染色體畸變的結(jié)果，但現(xiàn)有蠶豆根尖微核試驗的規(guī)范中，只要求觀察計錄處于細(xì)胞分裂間期的微核細(xì)胞，而忽視了分裂期細(xì)胞的遺傳損傷，沒有要求計錄和統(tǒng)計上述的染色體畸變(圖2)，現(xiàn)有文獻(xiàn)也未見報道。從劑量-效應(yīng)關(guān)系上來看，現(xiàn)有的蠶豆根尖微核試驗可能“減輕”了環(huán)境污染物的遺傳毒性。因此，在蠶豆根尖微核試驗中，是否計錄和統(tǒng)計分析染色體畸變(如染色體斷裂、染色體丟失和染色體橋等)，以及這些數(shù)據(jù)所能反映出的污染物作用機(jī)理及劑量關(guān)系等，值得討論和深入研究。

圖1 蠶豆根尖微核與染色體橋

圖2 染色體斷裂、丟失與微核形成

圖3 蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂特征

2 細(xì)胞分裂與微核（Cell dividion and micronucleus）

細(xì)胞周期是指細(xì)胞一次分裂結(jié)束開始生長，到下一次分裂終了所經(jīng)歷的過程。細(xì)胞周期是生長與繁殖的周期，一個生物體通過細(xì)胞分裂，才能達(dá)到生長與繁殖的目的。因此，細(xì)胞分裂對生物的個體維持與種族綿延都有著十分重要的意義[13]。生物對其細(xì)胞周期的調(diào)控是非常嚴(yán)密的，受多種效應(yīng)-抑制因子的平衡調(diào)節(jié)，如：cyclins,cyclin-dependent kinase及cdk inhibitors:p27Kip1,p21Waf1/Cip1,p15INK4B,p16INK4A等[14-16]。有多少個細(xì)胞進(jìn)入下一次有絲分裂及細(xì)胞分裂所經(jīng)歷的時間等都是相對穩(wěn)定的，不同種類和功能的細(xì)胞不同。在環(huán)境條件穩(wěn)定的情況下，蠶豆根尖分生組織在各生理時期，分裂相細(xì)胞數(shù)及其各分裂期(前、中、后和末期，圖3)細(xì)胞數(shù)的比率是在一個相對恒定的范圍內(nèi)。但在污染的協(xié)迫下，細(xì)胞周期會發(fā)生改變[7-9,17]。分裂相細(xì)胞數(shù)或各時期細(xì)胞頻率的變化，從一定的側(cè)面反映了污染物對細(xì)胞周期的影響。而且蠶豆根尖細(xì)胞的染色體或DNA受損傷之后，只有經(jīng)過至少一次的有絲分裂才能形成微核，因此，進(jìn)入有絲分裂的細(xì)胞數(shù)直接影響著微核率的高低。我們的研究表明，當(dāng)污染物的濃度高，影響蠶豆根尖細(xì)胞分裂時，其微核率反而降低[7-9]。而現(xiàn)有的蠶豆根尖微核技術(shù)的規(guī)范中沒有要求記錄有絲分裂相的細(xì)胞數(shù)，在現(xiàn)有的應(yīng)用蠶豆根尖微核技術(shù)進(jìn)行研究的文獻(xiàn)中，也沒有記錄其試驗中分裂相細(xì)胞數(shù)，或者只是定性描述。因此，在蠶豆根尖微核試驗中，是否應(yīng)該定量記錄并統(tǒng)計分析分裂相各個時期細(xì)胞數(shù)，值得我們深入研究和探討。

3 其他方法學(xué)問題（Other methodological issues）

3.1 微核的識別

特別重要的是微核的識別，這直接關(guān)系到數(shù)據(jù)的可靠性。微核是一種在細(xì)胞核(主核)以外，游離于細(xì)胞質(zhì)中的小核，其中含有小塊染色質(zhì)斷片或完整的染色體。在形態(tài)上：比主核?。蝗旧|(zhì)的密度、著色方式和折光等與主核相似；周圍形態(tài)清晰可辨，表示核膜的存在；近圓形，與主核完全分離；與主核在同一個光學(xué)平面；與主核共處一個細(xì)胞質(zhì)中[9](如圖1，2)。因此，微核的識別應(yīng)從大小、著色深淺、有無染色質(zhì)顆粒和折光率等幾方面進(jìn)行判斷，但初學(xué)者憑文字的描述是難于進(jìn)行判斷的，要在熟練技術(shù)人員的指導(dǎo)下學(xué)習(xí)一段時間才能掌握。如圖4，A是微核細(xì)胞，而B不是微核細(xì)胞。

圖4 微核的識別

3.2 染毒劑量

染毒劑量要根據(jù)預(yù)試驗的結(jié)果來定，預(yù)試驗的目的不僅在于保證染毒的最高劑量不會使根尖細(xì)胞產(chǎn)生致死效應(yīng)，也在于確定劑量-效應(yīng)關(guān)系最敏感的受試物濃度范圍。有試驗證明，不同誘變機(jī)理的誘變劑在蠶豆根尖微核試驗中誘發(fā)的微核率與濃度、時間等參數(shù)的曲線關(guān)系也不一樣，既有S-型曲線，又有非S-型曲線[2]。因此，預(yù)試驗是相當(dāng)必要的。

3.3 蠶豆品種、本底微核率與統(tǒng)計分析

選用對污染物敏感的蠶豆品種，是檢出污染物遺傳毒性的重要條件。華中師大生物系金波等[17]從14個蠶豆品種中篩選出了敏感品種松滋青皮豆；農(nóng)業(yè)部環(huán)保所從30個蠶豆品種篩選出了敏感品種上于田雞青等。松滋青皮豆和上于田雞青都是試驗中值得選用的蠶豆品種。

本底微核率是試驗成功的關(guān)鍵之一。有人提出在正常情況下，本底微核率不應(yīng)高于千分之十[18]?？字久鹘淌诤凸P者[7-9]采用松滋青皮豆為材料(華中師大生命科學(xué)院金波提供)，通過多年的研究發(fā)現(xiàn)，所有試驗的微核本底都小于千分之五。本底以千分之十為上限是否合適，還有待于進(jìn)一步的研究。本底太高，可能反映出試驗條件、方法或試劑等需要重新檢查，而微核判斷的標(biāo)準(zhǔn)也應(yīng)在考慮之列。

陳光榮等[19]在利用蠶豆根尖微核技術(shù)監(jiān)測水質(zhì)污染時，引入化學(xué)監(jiān)測中“污染指數(shù)”(Pollution Index,PI)的概念，用水質(zhì)污染指數(shù)=樣品實測MN‰平均值/對照組MN‰平均值的大小來劃分水質(zhì)污染的程度，并在實地監(jiān)測中得出：PI在0～1.5為基本沒有污染；1.5～2.0為輕度污染；2.0～3.5為中度污染；3.5以上為嚴(yán)重污染。用“污染指數(shù)”來表示水質(zhì)污染程度，大大簡化數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理，又可防止本底微核率的波動性帶來的影響。

通過微核率的多少來反映環(huán)境中污染物的量，對于指示環(huán)境質(zhì)量具有重要意義。但微核率的計算是：(含微核的細(xì)胞數(shù)÷觀察細(xì)胞總數(shù))×1 000，不論細(xì)胞中微核大小和個數(shù)的多少都作一個細(xì)胞計。一個細(xì)胞中含有多個微核或含有一個大微核(如圖1)所反映的作用于該細(xì)胞的污染物量與只引起細(xì)胞產(chǎn)生一個小微核的污染物量是否相同？有待進(jìn)一步的研究。如前所述，引起細(xì)胞產(chǎn)生多個微核或大微核與只引起產(chǎn)生一個小微核的作用機(jī)理可能存在差異[2]。有關(guān)細(xì)胞中含有多個微核或大微核是否應(yīng)該與一個細(xì)胞中只含一個小微核分別統(tǒng)計和處理，在當(dāng)前蠶豆根尖微核技術(shù)的規(guī)范中并沒有對其加以說明或解釋，有待進(jìn)一步的討論和研究。

4 結(jié)論與展望（Conclusion and perspective）

蠶豆根尖微核技術(shù)自建立，經(jīng)過學(xué)者們的共同努力和國際社會的多方合作，到現(xiàn)在已經(jīng)是一個成熟規(guī)范的檢測污染物遺傳毒性的方法。如前所述，筆者認(rèn)為蠶豆根尖微核技術(shù)能告訴我們的不僅僅是微核細(xì)胞率，還應(yīng)該包括染色體畸變數(shù)、細(xì)胞分裂周期變化等反映污染物不同作用機(jī)制方面的信息，是一個綜合性的試驗方法。因此，在方法學(xué)上還有許多問題值得人們深入思考和研究。特別是，如能與現(xiàn)代生命科學(xué)新理論與技術(shù)(如基因組學(xué)、功能基因組學(xué)及代謝組學(xué)等)相結(jié)合，它將在環(huán)境監(jiān)測、風(fēng)險評價和污染物的作用機(jī)制等方面發(fā)揮更大的作用。當(dāng)然，這其中還需要青年工作者的投入和不懈努力。

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New Views on the Methodology of Micronucleus Assay with Vicia faba Root Tip Cells

Wang Wuxiang1,2,Gao Dan1,Liao Fen1,Zhou Furong1,Feng Shaolong1,*

1.The School of Public Health,University of South China,Hengyang 421001,China
2.The Library,University of South China,Hengyang 421001,China

26 November 2015 accepted 8 January 2016

Although the micronucleus assay withVicia fabaroot tip cells is a canonical way to detect the genotoxicity of environmental pollutants,there are still some important issues that are worth in-depth discussion and investigation in its methodology.After illustrating how to correctly observe the micronucleus and chromosome aberrations,including chromosome fragment,chromosome loss and chromosome bridge,in theVicia fabaroot tip cells we suggested that the dividing-phase cells and their chromosome aberrations should been taken account of in this assay, in order to more precisely and delicately determine the dose-effect relationship and potential molecular mechanisms than before.Other important issues about its methodology were also presented for our colleagues to discuss and explore deeply.The aim is to improve this assay to better serve the environmental monitoring and risk assessment.

Vicia faba;micronucleus;chromosome aberration;morphology;methodology

2015-11-26 錄用日期：2016-01-08

1673-5897（2016）3-086-06

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20151126003

簡介：封少龍(1971—)，男，環(huán)境科學(xué)博士，教授，主要研究方向環(huán)境毒理學(xué)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文30多篇。

湖南省教育廳重點項目(12A118)；南華大學(xué)歸國學(xué)者啟動基金(2012XQD44)；南華大學(xué)研究生教育教改項目(2014JG015)

王五香(1970-)，女，中級職稱，研究方向為環(huán)境污染物的生態(tài)與健康影響機(jī)制，E-mail:wxwang_feng@126.com;

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:slfeng71@usc.edu.cn