NMR代謝組學(xué)在水生軟體動(dòng)物生態(tài)毒理研究中的應(yīng)用

毛小華，陸開宏，楊文，朱津永

寧波大學(xué)海洋學(xué)院教育部應(yīng)用海洋生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧波315211

NMR代謝組學(xué)在水生軟體動(dòng)物生態(tài)毒理研究中的應(yīng)用

毛小華，陸開宏，楊文，朱津永*

寧波大學(xué)海洋學(xué)院教育部應(yīng)用海洋生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧波315211

隨著核磁共振(NMR)技術(shù)的不斷發(fā)展，基于NMR的代謝組學(xué)方法已經(jīng)逐漸成為研究水生動(dòng)物在代謝水平響應(yīng)環(huán)境變化的一種有效方法。水生軟體動(dòng)物作為重要的環(huán)境監(jiān)測生物，近年來人們在其相關(guān)研究中取得了不小的成果。文章總結(jié)了利用NMR的代謝組學(xué)方法研究各類環(huán)境脅迫因子對水生軟體動(dòng)物代謝影響的成果，主要綜述了水生軟體動(dòng)物不同組織內(nèi)代謝物組成和含量對環(huán)境脅迫的響應(yīng)，同時(shí)對水生軟體動(dòng)物生態(tài)毒理代謝組學(xué)研究中存在的問題和今后的發(fā)展方向進(jìn)行了討論和展望。

核磁共振；水生軟體動(dòng)物；生態(tài)毒理；代謝組學(xué)

毛小華,陸開宏,楊文,等.NMR代謝組學(xué)在水生軟體動(dòng)物生態(tài)毒理研究中的應(yīng)用[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào),2016,11(3):36-46

Mao X H,Lu K H,Yang W,et al.Application of NMR-based metabolomics in the study of ecotoxicology of molluscs:A review[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(3):36-46(in Chinese)

隨著人類活動(dòng)的加劇，全球的大部分水體均受到不同程度的各類污染(如重金屬、農(nóng)藥和工業(yè)化學(xué)物質(zhì)污染等)，這些環(huán)境污染物直接或間接的導(dǎo)致了水生生物各類不良反應(yīng)，甚至死亡[1]。生活于水環(huán)境中的各類水生軟體動(dòng)物由于其較弱的活動(dòng)能力(運(yùn)動(dòng)緩慢或是營固著生活)更是直接暴露于污染物中，然而由于這些物種具有分布廣泛，個(gè)體大小適中，收集方便，種群數(shù)量大，并且對污染物具有極強(qiáng)的耐受性等特點(diǎn)，逐漸受到生態(tài)學(xué)家們的重視[2]，并作為生物監(jiān)測物種用于評估環(huán)境污染[3]。然而軟體動(dòng)物是如何抵御這些有毒物質(zhì)的不良影響的？其背后的作用機(jī)制是怎樣的？對于這些問題，現(xiàn)有的研究結(jié)果仍無法給出令人信服的解釋。雖然利用酶學(xué)和蛋白組學(xué)等手段使人們了解了一部分軟體動(dòng)物強(qiáng)大解毒能力的背后機(jī)制[4]，但是隨著研究的深入和發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)除了大分子蛋白質(zhì)在軟體動(dòng)物應(yīng)對環(huán)境脅迫時(shí)發(fā)揮著重要功能外，內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物也在響應(yīng)環(huán)境變化過程中起著重要作用[5]。由于這些小分子代謝產(chǎn)物的變化常常不反映在基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平，而是反映在物質(zhì)的代謝改變上,且因其種類繁多，對單一成分的分析測定難以窺探對全局代謝的影響，這就需要借助代謝組學(xué)方法來系統(tǒng)研究這些物質(zhì)的整體變化規(guī)律。

1 基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)簡介

代謝組學(xué)(metabolomics)最早起源于20世紀(jì)70年代的代謝輪廓分析，隨著基因組學(xué)的提出和迅速發(fā)展，Nicholson等[6]在1985年利用核磁共振技術(shù)(NMR)分析大鼠的尿液，并于1999年提出了代謝組學(xué)的概念。目前最常用的代謝組學(xué)分析手段包括液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS,liquid chromatography-mass spectrometry)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS,gas chromatography-mass spectrometry)、高效液相色譜(HPLC,liquid chromatography)以及核磁共振(NMR,nuclear magnetic resonance)，而基于NMR的代謝組學(xué)方法是新發(fā)展起來的一門新技術(shù)，其重復(fù)性好，可無偏向性的檢測到代謝物，能夠快速地確定代謝物的結(jié)構(gòu)和定量信息[7-8]。此外還具有樣品前處理簡便，僅需少量樣品即可完成測定，且不會(huì)破壞樣品的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的特點(diǎn)[9]。而傳統(tǒng)的研究只能同時(shí)監(jiān)測最多數(shù)種代謝物的動(dòng)態(tài)[10]?；贜MR的代謝組學(xué)研究可以同時(shí)分析從生物樣品中成百上千的內(nèi)源性代謝物[11]，對樣品進(jìn)行系統(tǒng)的代謝輪廓描述。目前，NMR代謝組學(xué)分析技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，包括藥物毒性檢測[12]、先天性疾病診斷[8]、功能基因組學(xué)[13]和環(huán)境毒理學(xué)[14]等。

2 基于NMR代謝組學(xué)方法研究水生軟體動(dòng)物對各類環(huán)境脅迫的代謝響應(yīng)

自2001年Nicholson發(fā)表了第一篇論文以來，應(yīng)用NMR代謝組學(xué)方法研究動(dòng)物生態(tài)毒理的論文數(shù)量呈逐年增加的趨勢(圖1)，尤其是進(jìn)入2005年后，其增長速度更加明顯，不僅反映出國內(nèi)外對基于NMR的代謝組學(xué)方法研究投入的不斷增加，也反映出對水生生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)注，然而對于軟體動(dòng)物的相關(guān)研究相對缺乏且主要集中在海水種類上。已有研究中，軟體動(dòng)物體內(nèi)作為代謝解毒中心的肝胰臟和作為人類主要食用部分的肌肉組織成為關(guān)注的重點(diǎn)，此外鰓、性腺及外套膜等也常常作為研究對象。研究中涉及到的主要環(huán)境脅迫因子包括：生物脅迫(如病原感染)、重金屬脅迫、化學(xué)物脅迫(如殺蟲劑和激素類物質(zhì))和物理脅迫(溫度、溶氧和鹽度變化)以及石油污染物脅迫等。軟體動(dòng)物組織內(nèi)代謝物組成和含量變化主要表現(xiàn)在氨基酸、能量物質(zhì)(如葡萄糖)和滲透壓調(diào)節(jié)物(如龍蝦肌堿和甜菜堿)等代謝物上(表1)。

圖1 應(yīng)用NMR代謝組學(xué)方法研究動(dòng)物生態(tài)毒理的論文數(shù)統(tǒng)計(jì)

續(xù)表

續(xù)表1

2.1 溫度

軟體動(dòng)物作為變溫動(dòng)物，溫度是影響其代謝水平的的主要因素之一[15]。雖然水生軟體動(dòng)物能夠適應(yīng)較廣的溫度范圍，但超出其最適溫度范圍必然導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)代謝的一系列變化[16-17]。研究顯示，溫度的升高和下降都會(huì)影響水生軟體動(dòng)物的代謝，但是溫度的升高相對于溫度的下降對水生軟體動(dòng)物的影響更為顯著[5]。因此，現(xiàn)有研究主要集中于對水生軟體動(dòng)物的熱應(yīng)激的反應(yīng)上，而對冷應(yīng)激的相關(guān)報(bào)道較少。

由于病原微生物的感染，水生軟體動(dòng)物容易患上干枯綜合癥(Withering syndrome)[18]。Rosenblum等[5]利用NMR代謝組學(xué)方法觀察不同溫度(13.4℃和17.3℃)對紅鮑螺(Haliotis rufescens)的代謝影響后，證實(shí)了溫度的升高使紅鮑螺更易感染這種疾病，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)溫度的升高與2種熱休克蛋白(hsp72和hsp89)的含量水平呈正相關(guān)，而與能量代謝產(chǎn)物(如磷酸肌酸、ATP和糖原)的含量水平呈負(fù)相關(guān)。

2.2 鹽度

低鹽度可以誘導(dǎo)海洋軟體動(dòng)物體內(nèi)的滲透壓降低，但是一些海洋軟體動(dòng)物可以通過保持細(xì)胞內(nèi)高濃度的游離氨基酸來維持細(xì)胞內(nèi)外滲透平衡[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)，在鹽度下降時(shí)，菲律賓蛤(Ruditapes philippinarum)鰓組織的氨基酸含量變化表現(xiàn)為除丙氨酸和組氨酸外，多種氨基酸(纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蘇氨酸等)含量顯著增加。此外，在鹽度下降的脅迫下，菲律賓蛤消化腺的氨基酸含量變化與鰓組織中所觀察到的現(xiàn)象類似，主要差異在于其甘氨酸含量的增加表現(xiàn)的更為明顯[20]。研究人員還發(fā)現(xiàn)在鹽度變化的脅迫下，菲律賓蛤消化腺的3種滲透壓調(diào)節(jié)物(?；撬?、甜菜堿和龍蝦肌堿)含量顯著降低，磷酸膽堿含量顯著上升。這似乎說明，鹽度的下降會(huì)干擾菲律賓蛤消化腺的滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)，而磷酸膽堿含量的上升是由于膽堿和ATP通過膽堿激酶的催化形成磷酸膽堿和ADP，并釋放能量，因此磷酸膽堿含量的上升也暗示了鹽度的脅迫會(huì)干擾菲律賓蛤的能量代謝過程。

2.3 重金屬

一系列關(guān)于重金屬對水生軟體動(dòng)物的代謝影響研究發(fā)現(xiàn)，雖然不同的水生軟體動(dòng)物對不同重金屬的代謝響應(yīng)存在差異，但由重金屬誘導(dǎo)的代謝都表現(xiàn)出相似的變化[21-28]。Liu等[23]用基于NMR的代謝組學(xué)方法來研究3種不同家系的菲律賓蛤(白色蛤仔、紅色蛤仔和斑紋蛤仔)在汞的脅迫下其肌肉代謝物的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與其他2種蛤仔相比，白色蛤仔的代謝物富含高水平的支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)、甜菜堿、葡萄糖和糖原。這似乎說明，在汞的干擾下，白色蛤仔在滲透調(diào)節(jié)和能量代謝方面表現(xiàn)得更敏感。Wu等[29]通過NMR代謝組學(xué)方法研究銅和鎘暴露對翡翠貽貝(Perna viridis)產(chǎn)生的代謝影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)銅和鎘同時(shí)暴露與單獨(dú)銅暴露有著相似的代謝指紋譜，都會(huì)引起氨基酸、能量代謝物和滲透壓調(diào)節(jié)物含量的改變，同時(shí)還會(huì)引起谷氨酸鹽含量的過度積累，毒害翡翠貽貝的神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致其神經(jīng)細(xì)胞的死亡。Liu等[21-22]也利用基于NMR的代謝組學(xué)方法觀察了菲律賓蛤不同組織(消化腺和鰓)對汞脅迫的響應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與鰓組織相比，其消化腺的代謝物含量變化更為顯著，主要包括氨基酸代謝的變化，如支鏈氨基酸的增加、能量代謝的變化、神經(jīng)毒素的產(chǎn)生和滲透壓調(diào)節(jié)的改變。這一系列的研究結(jié)果均說明基于NMR的代謝組學(xué)方法可以有效地分析重金屬對水生軟體動(dòng)物的代謝影響情況。

2.4 食物變化

許多水生軟體動(dòng)物可以通過調(diào)節(jié)自身的代謝水平來適應(yīng)食物的缺乏[30]。Rosenblum等[5]通過NMR代謝組學(xué)方法研究食物缺乏對紅鮑螺足部肌肉的代謝影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肉堿、甘氨酸和龍蝦肌堿的含量大幅度下降。由于肉堿參與脂質(zhì)的氧化代謝[31]，因此其含量的減少反映出紅鮑螺正在通過脂質(zhì)氧化產(chǎn)生能量以抵御食物的缺乏，而甘氨酸和龍蝦肌堿含量的減少也證實(shí)了食物的缺乏會(huì)干擾紅鮑螺的滲透壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)。Tuffnail等[32]利用NMR代謝組學(xué)方法觀察食物缺少對紫貽貝(Mytilus edulis)足部肌肉組織的代謝變化影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了食物的缺少對紫貽貝代謝的影響主要包括滲透調(diào)節(jié)的改變、氨基酸代謝的變化和能量代謝物的改變。尤其是與能量代謝相關(guān)的葡萄糖、延胡索酸鹽和ATP的含量大幅度升高，這可能表明在紫貽貝的肌肉組織中與能量代謝相關(guān)的代謝產(chǎn)物被大量消耗掉，因此需要合成更多的葡萄糖、延胡索酸酯和ATP以維持紫貽貝的能量代謝。

2.5 病原感染

Liu等[33]利用基于NMR的代謝組學(xué)方法比較了鰻弧菌(Vibrio anguillarum)和燦爛弧菌(Vibrio splendidus)對菲律賓蛤的代謝影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這2種病原體都會(huì)干擾菲律賓蛤的能量代謝、氨基酸代謝和滲透調(diào)節(jié)過程，但是在鰻弧菌的干擾下，菲律賓蛤的代謝產(chǎn)物變化更敏感。尤其是支鏈氨基酸、葡萄糖、甜菜堿和牛磺酸的含量顯著上升。由于支鏈氨基酸是一類參與特殊供能的氨基酸，能以相當(dāng)快的速度轉(zhuǎn)氨和完全氧化，其氧化產(chǎn)生ATP的效率高于其他氨基酸，因此葡萄糖含量的上升，證實(shí)了支鏈氨基酸具有促進(jìn)糖異生的作用。而甜菜堿和?；撬岷康纳?，說明與燦爛弧菌相比，鰻弧菌對菲律賓蛤的滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)干擾更顯著。同時(shí)，Ji等[34]利用NMR代謝組學(xué)方法觀察鰻弧菌對紫貽貝鰓組織的代謝影響，結(jié)果在檢測到的代謝產(chǎn)物中，支鏈氨基酸、儲(chǔ)能化合物葡萄糖、三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物琥珀酸的含量顯著上升，天冬氨酸、甜菜堿的含量顯著降低。并且這些代謝產(chǎn)物含量的變化類似于感染了藤黃微球菌(Micrococcus luteus)的貽貝，尤其是支鏈氨基酸的變化，表明不同病菌可以在貽貝鰓組織中誘發(fā)類似的生物效應(yīng)。葡萄糖含量的上升表明紫貽貝需要消耗更多的能量來解決紫貽貝強(qiáng)烈的能量代謝變化。另外，由于在軟體動(dòng)物的一些代謝途徑中，在無氧條件下其細(xì)胞內(nèi)的天冬氨酸可以轉(zhuǎn)換成琥珀酸，因此天冬氨酸的減少和琥珀酸的增加意味著被鰻弧菌感染的紫貽貝逐漸從有氧呼吸走向了厭氧呼吸[35]。

2.6 化學(xué)物污染

Hines等[36-37]利用NMR代謝組學(xué)方法探究有毒化學(xué)物林丹(lindane)和阿特拉茲(atrazine)對紫貽貝代謝的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然紫貽貝對這2種化學(xué)污染物的代謝響應(yīng)存在差異，但也表現(xiàn)出了一些共性，如出現(xiàn)了氨基酸、龍蝦肌堿、氧化三甲胺(TMAO)含量的上升。氧化三甲胺和龍蝦肌堿是水生軟體動(dòng)物體內(nèi)維持滲透壓平衡的重要物質(zhì)[38]，并且當(dāng)氧化三甲胺和龍蝦肌堿不足以維持水生軟體動(dòng)物滲透平衡時(shí)，海洋軟體動(dòng)物會(huì)依靠自由氨基酸的濃度來維持細(xì)胞內(nèi)的滲透平衡，而淡水軟體動(dòng)物主要依靠脂肪酸和酮體來維持細(xì)胞內(nèi)的滲透平衡[18]。此外，Tikunov等[39]通過NMR代謝組學(xué)方法觀察牡蠣(Ostrea gigasThunberg)在高氯酸脅迫下其代謝產(chǎn)物的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甜菜堿的濃度改變程度最高，而甜菜堿與維持細(xì)胞滲透平衡有關(guān)，說明高氯酸可能最先破壞牡蠣的滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)。研究人員還發(fā)現(xiàn)，牡蠣消化腺中的糖原含量上升，暗示了消化腺才是牡蠣最有可能儲(chǔ)藏葡萄糖的場所。

近年來，國內(nèi)外許多研究者開始關(guān)注農(nóng)藥污染對水生軟體動(dòng)物的代謝影響[40-42]。目前的研究顯示，基于NMR的代謝組學(xué)方法為研究化學(xué)污染物對水生軟體動(dòng)物機(jī)體代謝活動(dòng)的影響提供了一個(gè)強(qiáng)大的方法。但值得注意的是，水生軟體動(dòng)物暴露于不同化學(xué)污染物時(shí)其代謝特征是不同的[43]。并且現(xiàn)階段的研究多注重室內(nèi)暴露與效應(yīng)的關(guān)系，尚未很好地同野外實(shí)際相結(jié)合，因此，應(yīng)用代謝組學(xué)方法對化學(xué)物污染的毒理機(jī)制探究有待于進(jìn)一步加深。

3 應(yīng)用NMR代謝組學(xué)方法研究水生軟體動(dòng)物的發(fā)展趨勢

目前，代謝組學(xué)正處于快速發(fā)展階段，日益成為研究的熱點(diǎn)。隨著研究的不斷深入，代謝組學(xué)必將在水域生態(tài)領(lǐng)域中發(fā)揮更大的作用，并與多維核磁共振技術(shù)、高分辨率質(zhì)譜技術(shù)、多維色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等的聯(lián)合應(yīng)用，將幫助我們更易從大量代謝產(chǎn)物中找出特異性代謝標(biāo)志物。同時(shí)與代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)進(jìn)行整合，互相驗(yàn)證，將是水生生物代謝組學(xué)方法發(fā)展的方向。

3.1 代謝組學(xué)與其他組學(xué)的聯(lián)用

隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展，代謝組學(xué)開始與其他組學(xué)(基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué))結(jié)合起來，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于生態(tài)毒理學(xué)上[44-45]。尤其是先通過蛋白組學(xué)技術(shù)和基因組學(xué)技術(shù)尋找相關(guān)蛋白質(zhì)和相關(guān)基因的表達(dá)變化規(guī)律，再通過代謝組學(xué)方法分析代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，最后通過檢測到的相應(yīng)蛋白質(zhì)、相應(yīng)基因與代謝物的結(jié)合分析和相互驗(yàn)證，更深入地探討生態(tài)毒理機(jī)制。

Wu等[20]結(jié)合了蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)方法研究了砷的毒性效應(yīng)在不同海水鹽度下對菲律賓蛤仔鰓組織的影響。研究表明，鹽度能影響砷對菲律賓蛤仔的毒性效應(yīng)。用代謝組學(xué)方法可以觀察到相關(guān)的代謝標(biāo)記物ATP、琥珀酸含量顯著上升，利用蛋白組學(xué)技術(shù)可以觀察到相關(guān)的蛋白標(biāo)記物如ATP合酶、琥珀酰輔酶A和核苷二磷酸含量顯著上升。而ATP合酶、琥珀酰輔酶A和核苷二磷酸的上升與代謝標(biāo)記物ATP和琥珀酸的上升呈正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分證明代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)合在研究生態(tài)毒物對水生軟體動(dòng)物的影響方面具有有效的互補(bǔ)性。因此，通過蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的整合來研究環(huán)境污染物對水生軟體動(dòng)物的影響，能更有效地反映水生軟體動(dòng)物完整的生態(tài)毒理機(jī)制。

值得提出的是，在各種組學(xué)的研究中，基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)是分別從細(xì)胞基因改變和蛋白表達(dá)修飾水平研究水生生物對外界干預(yù)的應(yīng)答，而代謝組學(xué)是以生物體內(nèi)源性代謝物的動(dòng)態(tài)變化為對象來研究生命活動(dòng)的[46]。雖然我們已將各種組學(xué)初步結(jié)合到了一起，但目前各個(gè)組學(xué)的整合是線性的，然而生物體是一個(gè)復(fù)雜的非線性的巨大系統(tǒng)，因此各個(gè)組學(xué)之間的結(jié)合有必要從目前的線性發(fā)展到非線性。同時(shí)還有一個(gè)突出的問題是蛋白組學(xué)更傾向于檢測到含量較多的蛋白(如肌動(dòng)蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白)，而那些參與代謝物合成和分解的相關(guān)蛋白(如酶類)，可能由于含量較低而很不容易檢測到[47]，其次很多蛋白雖然能夠表達(dá)出完整的序列，但是還需要進(jìn)行修飾、加工和具有一定的空間結(jié)構(gòu)才有真正的生物活性，所以即使是那些檢測到的蛋白也不一定能參與代謝活動(dòng)。這也是造成目前蛋白組學(xué)與代謝組學(xué)兩者結(jié)果間缺乏完全同步性的原因。因此目前我們還只能通過代謝組學(xué)尋找特定的響應(yīng)代謝物，再通過蛋白組學(xué)去找相關(guān)的特異性酶，監(jiān)測這些酶的相關(guān)變化，從而達(dá)到減少實(shí)驗(yàn)工作量的目的。

3.2 NMR與其他檢測技術(shù)的聯(lián)用

目前沒有一種分析方法可以單獨(dú)檢測到所有代謝物[48]。不同的分析技術(shù)有著不同的適用范圍，NMR技術(shù)可以檢測到小分子代謝物中的親水組分，如葡萄糖、氨基酸、有機(jī)酸和核酸等，而疏水組分的檢測主要通過質(zhì)譜手段實(shí)現(xiàn)，其中GC/MS可用來檢測膽固醇與飽和及不飽和脂肪酸，LC/MS則更適合油脂和磷脂的分析。為了盡可能的收集到更多代謝物的動(dòng)態(tài)信息，研究者開始采用多種技術(shù)聯(lián)用的方法。如Ong等[49]結(jié)合GC/MS、LC/MS和NMR研究斑馬魚(Barchydanio rerio)肝臟的生化輪廓。結(jié)果可以明顯檢測到斑馬魚肝臟的氨基酸、不飽和脂肪酸、膽固醇、磷脂和其他小分子等多種生化成分的變化，從他們的整體的研究結(jié)果表明，多平臺(tái)的方法能夠提供一個(gè)更全面的的代謝分析輪廓，因此，借助多種分析技術(shù)聯(lián)用的方法來探討水生軟體動(dòng)物的代謝機(jī)制或許將是未來研究的新趨勢。

3.3 尋找生物標(biāo)志物

在水生軟體動(dòng)物的研究上，代謝組學(xué)在尋找毒物生物標(biāo)志物方面具有巨大的潛力。代謝組學(xué)主要集中在研究其肌肉、肝臟組織等毒性生物標(biāo)志物上[50]，比較這些研究可以發(fā)現(xiàn)，不考慮毒物的性質(zhì)、作用機(jī)制和作用靶組織，在毒物的干預(yù)下，水生軟體動(dòng)物的代謝產(chǎn)物(檸檬酸鹽、葡萄糖和磷酸肌酸等)通常都會(huì)出現(xiàn)一系列變化，需要強(qiáng)調(diào)的是，不是所有的這些代謝產(chǎn)物在任一種毒物的干預(yù)下都會(huì)出現(xiàn)變化，不同毒物干預(yù)所引起的這些代謝產(chǎn)物變化的途徑也不都相同。而且毒理學(xué)研究最重要目的是闡明毒理機(jī)制，與沒有明確機(jī)制的生物標(biāo)志物相比，明確機(jī)制的生物標(biāo)志物具有更大的優(yōu)勢。通過代謝組學(xué)獲得的生物標(biāo)志物可以作為敏感的生物效應(yīng)“早期預(yù)警”工具，在環(huán)境質(zhì)量評估中具有非常重要的意義。

3.4 代謝流組學(xué)（fluxomics）的產(chǎn)生

為進(jìn)一步了解生物體的代謝途徑，近年來，出現(xiàn)了代謝流組學(xué)(fluxomics)，它是研究細(xì)胞內(nèi)分子隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的一個(gè)新興的組學(xué)，能夠通過跟蹤穩(wěn)定同位素在代謝網(wǎng)絡(luò)中的轉(zhuǎn)移并進(jìn)行相應(yīng)的模型計(jì)算，有效地定量代謝流量及其變化，可以對環(huán)境擾動(dòng)的影響給予充分的評價(jià)，并能對特定途徑和反應(yīng)的重要性進(jìn)行準(zhǔn)確的描述，是對代謝組學(xué)的一個(gè)有益補(bǔ)充。目前國內(nèi)外對代謝流組學(xué)的研究仍處于起步階段。在水生軟體動(dòng)物中的研究僅有Tikunov等[51]利用NMR通過13C同位素標(biāo)記實(shí)現(xiàn)了對美洲牡蠣(Crassostrea virginica)的代謝途徑分析，證實(shí)了美洲牡蠣的消化腺和肌肉組織的葡萄糖主要是通過糖酵解這一厭氧途徑消耗掉，且牡蠣糖酵解的最終產(chǎn)物是丙氨酸而非乳酸。

4 問題與展望

毫無疑問，代謝組學(xué)相對于其他組學(xué)能更快、更準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)毒性物質(zhì)和毒性規(guī)律。尤其是在水生生物應(yīng)答逆境脅迫研究領(lǐng)域中，其應(yīng)用確實(shí)取得了一些新進(jìn)展，拓展了對于水生生物耐受逆境脅迫分子機(jī)理的認(rèn)識，然而對于水生生物復(fù)雜的應(yīng)答脅迫代謝的機(jī)制來說，代謝組學(xué)其目的是分析隨著環(huán)境的改變其代謝物含量的變化，主要體現(xiàn)在表型的變化上。因此，代謝組學(xué)如何更廣泛地應(yīng)用在水生態(tài)毒理上，還需要通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)的整合，使每種組學(xué)都能最大的發(fā)揮出各自的優(yōu)勢，以達(dá)到概述生物在不同的時(shí)間尺度上，其從基因型到表型的變化，幫助人們從整體水平上把握水生生物脅迫應(yīng)答機(jī)制。其次，水生態(tài)環(huán)境是易變的，通常生物接觸的毒物是復(fù)雜的混合物，而不是單一的物質(zhì)，所以難以識別單個(gè)化合物的影響能力，因此代謝組學(xué)對探究環(huán)境污染的毒理機(jī)制上有待于進(jìn)一步努力，目前我們的認(rèn)識仍然十分有限，僅有不多的實(shí)驗(yàn)室從事于水生生物環(huán)境代謝組學(xué)研究，所獲得的成果自然也不明顯。但值得一提的是，雖然我們現(xiàn)在還不知道代謝組學(xué)會(huì)在多大的程度上影響水生生態(tài)毒理學(xué)的研究，但它的確是為評估水生生物的代謝狀態(tài)提供了一種具有潛力的快速的方法。因此，開展更多水生生物的應(yīng)答脅迫的相關(guān)代謝組學(xué)研究，無疑能促進(jìn)人們對于水生生物脅迫應(yīng)答代謝規(guī)律的系統(tǒng)認(rèn)知，幫助人們從整體水平上把握水生生物脅迫應(yīng)答機(jī)制，最終推動(dòng)水生生態(tài)毒理學(xué)的發(fā)展。

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Application of NMR-based Metabolomics in the Study of Ecotoxicology of Molluscs：A Review

Mao Xiaohua,Lu Kaihong,Yang Wen,Zhu Jinyong*

Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology,Ministry of Education,School of Marine Sciences,Ningbo University,Ningbo 315211,China

1 July 2015 accepted 17 September 2015

With the development of the nuclear magnetic resonance(NMR)technology,NMR-based metabolomics has gradually become an effective approach for studying the metabolic response of aquatic animals to environmental change.As the sensitive species,aquatic molluscs are the important organisms in environmental monitoring,and significant progresses have been made.This paper reviewed the research progresses on the metabolic aspects of various environmental contaminants or stressors in aquatic molluscs based on NMR metabolomics technology,and mainly fouced on the metabolic differences among the various tissues in terms of metabolites and their concentration levels.The shortcomes of recent research and prospective future work on NMR-based metabolomics in aquatic ecotoxicology are also discussed.

nuclear magnetic resonance;aquatic molluscs;ecotoxicology;metabolomics

2015-07-01 錄用日期：2015-09-17

1673-5897（2016）3-036-11

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150701003

簡介：朱津永(1983—)，男，博士，講師，主要研究方向水域生態(tài)與環(huán)境，發(fā)表學(xué)術(shù)論文20余篇。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31302192)；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目(20123305110001)；國家星火計(jì)劃項(xiàng)目(2014GA701024)；浙江省教育廳科研項(xiàng)目(Y201327177)

毛小華(1990-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗涹w動(dòng)物代謝組學(xué)，E-mail:236040341@qq.com

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:zhujinyong@nbu.edu.cn