β-半乳糖苷酶固定化研究

江賢君，包建波

(1.武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢430023，2.武漢博藍(lán)科技發(fā)展有限公司，湖北 武漢430014)

?

β-半乳糖苷酶固定化研究

江賢君1，包建波2

(1.武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢430023，2.武漢博藍(lán)科技發(fā)展有限公司，湖北 武漢430014)

用微孔陶瓷吸附和戊二醛交聯(lián)復(fù)合法制備了固定化β-半乳糖苷酶。試驗(yàn)結(jié)果表明：用3mm微孔陶瓷吸附，以2.0%戊二醛，時(shí)間1.5 h，溫度25 ℃交聯(lián)后，獲得固定化酶活為146 U/g，固定化酶活力回收率為60.8%。固定化酶最適溫度為50 ℃，最適pH=7。固定化酶的km=5.6 mmol/L。半衰期為33d。

微孔陶瓷；固定化；β-半乳糖苷酶

1　引言

β-半乳糖苷酶亦稱(chēng)乳糖酶，廣泛用于乳制品工業(yè)，生產(chǎn)中以游離酶形式水解乳糖生產(chǎn)低乳糖牛奶以緩解乳糖不耐癥[1]。乳糖酶來(lái)源于微生物合成，分泌量小，提取成本高，導(dǎo)致乳糖酶價(jià)格高，因此很多科技工作者進(jìn)行了大量研究尋找合適方法將乳糖酶固定化以降低生產(chǎn)成本。文獻(xiàn)報(bào)道固定化方法有[2～8]明膠包埋固定法，樹(shù)脂吸附交聯(lián)固定法，有機(jī)試劑交聯(lián)法，殼聚糖吸附交聯(lián)固定法以及磁性微球固定法等?？紤]到工業(yè)生產(chǎn)對(duì)固定化酶諸多要求，本研究以微孔陶瓷為固定化酶支撐載體，再用戊二醛交聯(lián)形成固定化酶，制得的固定化酶酶活回收高，最適溫度提高，半衰期延長(zhǎng)，具有生產(chǎn)實(shí)用價(jià)值。

2　材料與方法

2.1材料與試劑

β-D-半乳糖苷酶(哈爾濱美華生物技術(shù)股份有限公司,比活力>3 000 IU/g,溫度39 ℃，pH6.8,溶液中25 ℃半衰期8d)；微孔陶瓷(廣東佛山陶瓷研究所，粒徑3 mm,孔容>46%，蛋白吸附專(zhuān)用)；其它試劑為市售(分析純)。

2.2主要儀器

實(shí)驗(yàn)室玻璃填充柱：φ2×25 cm；

WFJ7200型可見(jiàn)分光光度計(jì)(尤尼柯儀器有限公司)；

工件的加工表面質(zhì)量直接影響到產(chǎn)品的使役性能，在實(shí)際生產(chǎn)中必須加以嚴(yán)格控制，如發(fā)動(dòng)機(jī)零件的表面層燒傷會(huì)引起使用壽命大幅度下降。目前，工程中常用的燒傷評(píng)價(jià)方法主要有：目測(cè)法、酸洗法、表面顯微硬度法等，均屬于定性評(píng)價(jià)方法，且后兩者屬于破壞性方法。圖18為高溫合金典型的表面燒傷圖像，從圖18(a)到圖18(e)燒傷程度依次變得嚴(yán)重。

電子天平，pH儀，集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，水浴鍋等。

2.3試驗(yàn)方法

綜合新零售城市創(chuàng)新各分項(xiàng)指數(shù)來(lái)看，當(dāng)前成都市新零售的領(lǐng)先之處在于：擁有全國(guó)領(lǐng)先的品牌數(shù)字化智慧門(mén)店數(shù)量、物流網(wǎng)點(diǎn)數(shù)量，同時(shí)在進(jìn)口高端商品的消費(fèi)上也擁有一定領(lǐng)先勢(shì)能。作為一個(gè)美食之都，成都外賣(mài)已經(jīng)滲透在各個(gè)領(lǐng)域，品類(lèi)多、味道好、客單價(jià)高的趨勢(shì)顯現(xiàn)。成都打造的“10分鐘經(jīng)濟(jì)圈”，讓其成為國(guó)內(nèi)便利店數(shù)量最多的城市之一。未來(lái)，成都人三公里范圍將有專(zhuān)屬理想生活圈。

2.3.1分析檢測(cè)方法

2.3.1.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[8]

乳糖水解后還原糖含量增加，因此在稀溶液中可用DNS法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并以此為依據(jù)定義酶活力和比較酶活力大小。制得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖1(y = 0.953 3x, R2= 0.998 7)所示。

2.3.1.2酶活力測(cè)定[9]

用pH6.8的磷酸鹽緩沖液，配制濃度為1 g/L的乳糖酶溶液。取一定量的酶加入到45 g/l乳糖溶液中，在39 ℃條件下水浴10 min。然后取1 mL的反應(yīng)溶液置于100 ℃沸水中滅活10 min。將滅酶活的溶液稀釋100倍后，量取0.3 mL放入15 mL的帶塞子的試管中，再滴加0.4 mL的DNS，100 ℃水浴顯色2 min。冷卻后測(cè)量吸光度，計(jì)算酶活。定義乳糖酶的活力為：在39 ℃，pH = 6.8條件下反應(yīng)10 min，每分鐘使OD520增加0.000 1個(gè)單位為1個(gè)酶活力單位：

乳糖酶比活U/g=(OD1-OD0)n×10 000/(0.953 3×m×10)單位：mg/(mL*min*g)

OD1水解后乳糖液吸光度

OD0水解前乳糖吸光度

除了《合同法》上的一般規(guī)定，對(duì)于格式條款的效力問(wèn)題，《合同法》第四十條還做出了特殊規(guī)定，認(rèn)定提供格式條款的一方免除其責(zé)任、加重對(duì)方責(zé)任、排除對(duì)方主要權(quán)利的，該條款無(wú)效。那變更合同成立時(shí)點(diǎn)的格式條款是否屬于前述情形呢？

2.3.3.3米氏常數(shù)的測(cè)定[10]

女子望著他，努力抬高手臂，嘴巴微微開(kāi)闔，似乎是想要說(shuō)些什么。他急忙俯下身子，將耳朵貼到了女子的唇邊，女子卻只嘔出了一口血，然后便一動(dòng)也不動(dòng)了。

m酶量(g)

可見(jiàn)隨戊二醛濃度增加固定化酶失活越來(lái)越嚴(yán)重，因?yàn)槲於┘仁墙宦?lián)劑也是蛋白質(zhì)變性劑。

10 10 min

2.3.1.3固定化酶活力測(cè)定

參照2.3.1.2方法取一定量固定化酶加入到乳糖溶液中，并在合適溫度，pH條件下測(cè)定。

2.3.2固定化酶制備方法

2.3.2.1微孔陶瓷吸附試驗(yàn)

配制120 U/mL乳糖酶溶液(Ph = 6.8)1L，將預(yù)處理后微孔陶瓷50 g裝入φ2×25 cm玻璃填充柱，以100 mL該酶溶液反復(fù)流經(jīng)玻璃柱進(jìn)行吸附直至酶溶液比活不再下降為止，緩沖液清洗微孔陶瓷，干燥后冰箱保存，并測(cè)定吸附固定酶活力。

2.3.2.2戊二醛交聯(lián)試驗(yàn)

取1g吸附后的微孔陶瓷固定化酶加入交聯(lián)劑戊二醛復(fù)合固定化。分別在濃度為0.4 %、0.8 %、1.2 %、1.6 %、2 %，2.4%戊二醛溶液中進(jìn)行交聯(lián)試驗(yàn)確定合適戊二醛濃度；在0.5 h、1 h、1.5 h、2.0 h條件下交聯(lián)確定合適交聯(lián)時(shí)間；在20 ℃、25 ℃、30 ℃、3 5℃、40℃溫度條件下交聯(lián)確定合適交聯(lián)溫度；在此基礎(chǔ)上確定較佳戊二醛交聯(lián)條件組合。最后計(jì)算總活力回收率。

2.3.3固定化酶性質(zhì)研究

2.3.3.1固定化酶合適溫度

一份菜加上一碗米飯是最常見(jiàn)的外賣(mài)搭配。有人喜歡吃葷，就點(diǎn)個(gè)紅燒排骨；有人喜歡吃素，常點(diǎn)素炒圓白菜，不管哪種菜肴，單獨(dú)與主食搭配都存在營(yíng)養(yǎng)缺陷。因此，點(diǎn)外賣(mài)一定要注意葷素搭配，肉類(lèi)和蔬菜都要有，不喜歡吃肉可以用蛋類(lèi)代替。如果一葷一素兩個(gè)菜吃不完，推薦點(diǎn)一個(gè)半葷半素的菜，比如青椒炒肉絲、西紅柿炒雞蛋。

按2.3.1.2方法取等量酶溶液分別在25 ℃、30℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃條件下水解乳糖，比較相對(duì)活力大?。徊⑷〉攘繌?fù)合固定化酶分別在35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃條件下水解乳糖，比較相對(duì)活力大小。

2.3.3.2固定化酶合適溫度

按2.3.1.2方法分別取等量溶液酶在pH 5.5、6.0、 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5緩沖液中39 ℃水解乳糖，比較相對(duì)活力大?。辉俜謩e取等量復(fù)合固定化酶在pH 5.5、6.0、 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5緩沖液中50 ℃水解乳糖，比較相對(duì)活力大小。

n稀釋倍數(shù)

在兩組4個(gè)250 mL試劑瓶中用pH = 6.8緩沖液分別配制0.5,0.75,1.0,1.5 mmol/L的乳糖溶液，其中一組每瓶加入120 U游離酶，在39 ℃溫度下反應(yīng)30 min，測(cè)定酶活并計(jì)算反應(yīng)速度。在另一組每瓶加入1g固定化酶，在最適條件下測(cè)定酶活并計(jì)算反應(yīng)速度。最后由米氏方程通過(guò)雙倒數(shù)作圖求米氏常數(shù)km。

對(duì)照組患者給予氨氯地平阿托伐他汀鈣（輝瑞制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20130030，規(guī)格5 mg∶10 mg/片）治療，1次/d，1片/次，口服給藥。

已知游離酶半衰期為8 d,測(cè)定固定化酶半衰期。稱(chēng)取10 g復(fù)合固定化酶置于100 mL pH為6.8緩沖溶液中，放置25 ℃恒溫箱密封保存，分別在保存的第1,2,3,4,5 d取1 g固定化酶進(jìn)行酶活力測(cè)定，然后依指數(shù)衰減定律測(cè)定固定化酶半衰期。

3　結(jié)果與分析

3.1吸附固定化酶回收率

按2.3.2.1方法比較了溫度對(duì)吸附的影響，結(jié)果如圖2：

圖2　溫度對(duì)吸附的影響

可見(jiàn)在室溫條件下操作比較適宜。在填充柱室溫操作條件下，測(cè)定微孔陶瓷固定酶平均比活為220 U/g，游離酶比活為120 U/mL：

莊昶認(rèn)為邵雍以及李白、杜甫、陳師道、黃庭堅(jiān)等人雖然在易、詩(shī)、文等方面有不足，但他們都是繼承先賢而來(lái)，白璧微瑕?；诖朔N認(rèn)識(shí)，莊昶將文分成不同的類(lèi)別，有詩(shī)人、文人之文，有圣人之文。在《滁州志序》中，莊昶以“天下之物固有遇不遇者，蓋亦數(shù)也”作喻，指出滁州不足為遇。不管是為官于此的韋應(yīng)物、王元之、歐陽(yáng)修，還是做客于此的蘇東坡、曾鞏、滿(mǎn)執(zhí)中，都是文人、詩(shī)人，他們不足以使滁州聞名，因?yàn)椤膀}雅余談，文章小技者，惡足以當(dāng)此哉”［3］卷六，1葉b-2葉a！他還以“月亮”為例，指出有詩(shī)人之月、文人之月、詩(shī)顛酒狂之月、自得性天之月。在他看來(lái)，前三者之“月”無(wú)足取，唯有自得性天之月，即圣賢之月才值得追求和提倡：

酶活回收率 =(50 × 固定酶比活)/(溶液酶體積 × 游離酶比活)

=(50 × 220)/(100 × 120)

=91.6%

因此采用微孔陶瓷常溫下填充柱吸附操作簡(jiǎn)便，酶活回收高。

從交聯(lián)試驗(yàn)看出戊二醛濃度與酶活呈負(fù)相關(guān)?？紤]吸附洗脫影響并結(jié)合上述交聯(lián)試驗(yàn)條件結(jié)果,再在戊二醛濃度0.4 %、0.8 %、1.2 %、1.6 %、2 %,交聯(lián)時(shí)間1.5 h,室溫下制備固定化酶，然后將制得的固定化酶裝入填充柱，用pH = 6.8的緩沖液柱中洗脫12 h，測(cè)定酶活，結(jié)果如圖6：

3.2.1戊二醛交聯(lián)濃度對(duì)固定化影響

本研究試驗(yàn)地位于浙江紹興縣富盛鎮(zhèn)御茶村有限公司綠茶生產(chǎn)地，地理位置 29°56′N(xiāo)，120°43′E，海拔165.7 m，坡度為18°，屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，光能資源比較豐富；年平均降水量約1400 mm，多集中在春季和夏季，年平均降水天數(shù)為125.6 d，常年相對(duì)濕度80%，屬濕潤(rùn)地帶；無(wú)霜期為200~230 d。供試的茶樹(shù)品種為豐綠，種植年限為10 a，行距1.5 m。茶園基礎(chǔ)肥力如表1所示。

讓我們從就業(yè)和收入開(kāi)始討論，因?yàn)椴还茏杂擅裰髟谡軐W(xué)上有多大的吸引力，它的力量在很大程度上都得益于一個(gè)實(shí)際優(yōu)勢(shì)：在政治學(xué)和經(jīng)濟(jì)學(xué)中，自由主義的特點(diǎn)是分散決策，這使得自由民主國(guó)家能夠勝過(guò)其他國(guó)家，并為人民帶來(lái)越來(lái)越多的財(cái)富。

所有檢測(cè)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（±sd，n=3）表示。數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素分析（ANOVA）檢驗(yàn)不同樣品間的差異顯著性，所有差異分析均在p=0.05水平進(jìn)行。

圖3　戊二醛濃度對(duì)酶活性影響

0.953 3還原糖對(duì)吸光度轉(zhuǎn)換系數(shù)(葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率)

3.2.2戊二醛交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化影響

在戊二醛濃度為2.0 %，室溫下在不同時(shí)間下交聯(lián)，得固定化酶相對(duì)酶活大小，結(jié)果如圖4：

圖4　交聯(lián)時(shí)間對(duì)酶活性的影響

隨著交聯(lián)時(shí)間增加，尤其時(shí)間>1.5 h固定化酶活性衰減嚴(yán)重，說(shuō)明時(shí)間越長(zhǎng)戊二醛對(duì)乳糖酶變性作用越強(qiáng)。

3.2.3戊二醛交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化影響

在戊二醛濃度2.0 %，交聯(lián)時(shí)間為1.5 h條件下分別在不同溫度下進(jìn)行交聯(lián)，得固定化酶相對(duì)酶活大小，如圖5：

圖5　交聯(lián)溫度對(duì)固定化酶活的影響

可見(jiàn)合適交聯(lián)溫度為25 ℃，較高的溫度導(dǎo)致戊二醛與酶蛋白劇烈反應(yīng)從而引起酶失活。

3.2.4交聯(lián)條件確定

2.3.3.4固定化酶半衰期測(cè)定[10]

3.2戊二醛交聯(lián)試驗(yàn)結(jié)果

圖6　戊二醛濃度對(duì)固定化酶洗脫影響

可見(jiàn)，在低濃度條件下吸附制得固定化酶長(zhǎng)時(shí)間洗脫后固定化酶脫附明顯。綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，確定固定化酶交聯(lián)條件為室溫下戊二醛濃度2.0 %，交聯(lián)時(shí)間1.5 h。

主要工藝如下：①使用工裝進(jìn)行找中，確定機(jī)床主軸與螺孔中心重合。②殘余螺栓掏空：加工螺紋孔內(nèi)螺栓，直至內(nèi)徑為Φ149.60～Φ149.80mm時(shí)止。③螺孔內(nèi)取殘絲：配合使用手動(dòng)工具，將存留在主螺栓孔中的螺紋絲卷出來(lái)。

3.2.5復(fù)合固定化酶總活力回收計(jì)算

以2.3.2.1法制得的活力為220 U/g微孔陶瓷固定化酶按3.2.4法交聯(lián)制備50 g復(fù)合固定化酶，測(cè)得復(fù)合固定化酶活力為146 U/g,因此：

總活力回收率=吸附酶回收率×交聯(lián)酶回收率

=91.6 %×(146U / 220U)

=60.8 %

對(duì)鋼軌的表面狀態(tài)而言，在滾筒式校直機(jī)上對(duì)鋼軌進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校直，在較短的時(shí)間內(nèi)就會(huì)出現(xiàn)磨耗，這是因?yàn)殇撥壴谛Ｖ边^(guò)程中會(huì)使鋼軌體內(nèi)的內(nèi)應(yīng)力增大；在一定的壓力機(jī)上對(duì)鋼軌進(jìn)行適量的校直，則對(duì)鋼軌波磨的影響程度較輕。

3.3固定化酶性質(zhì)研究

3.3.1固定化酶合適溫度

在不同濃度戊二醛溶液中室溫下交聯(lián)1 h，得酶活相對(duì)大小如圖3：

可以看出，固定化酶最適溫度為50 ℃，相對(duì)于游離酶有明顯飄移。固定化酶由于交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)從而提高穩(wěn)定性。50 ℃最適溫度對(duì)于固定化酶連續(xù)生產(chǎn)防止雜菌污染非常有利。

圖7　固定化酶最適溫度

3.3.2固定化酶合適pH

可見(jiàn)，固定化酶最適pH為7.0，與游離酶最適pH 6.8差異不明顯，固定化酶對(duì)pH波動(dòng)略顯穩(wěn)定。

圖8　固定化酶最適pH

3.3.3固定化酶米氏常數(shù)

根據(jù)米氏方程,采用雙倒數(shù)法1/v ～ 1/s作圖(v為反應(yīng)速度，此即酶活性;s為乳糖濃度)結(jié)果見(jiàn)圖9：

圖9　固定化酶米氏常數(shù)

游離酶回歸方程y= 0.031x+ 0.235 (R2= 0.992 5)

筆者在母豬人工授精站工作十年中經(jīng)常遇到公豬發(fā)生睪丸炎，性欲缺失，精神不振，睪丸腫大、疼痛等病狀。使公豬精液供精站工作無(wú)法正常開(kāi)展。公豬睪丸炎是睪丸實(shí)質(zhì)的炎癥，由于睪丸和附睪緊密相連，容易引起附睪炎，兩者常同時(shí)發(fā)生或者互相繼發(fā)。根據(jù)病程和病性，臨床上可分為急性與慢性、非化膿性與化膿性。

固定化酶酶回歸方程y= 0.045x+ 0.252 (R2= 0.997 5)

通過(guò)回歸方程可以算出游離酶km= 7.58 mmol/L，固定化酶km= 5.6 mmol/L。較游離酶固定化酶km變小，因?yàn)槊阜肿咏宦?lián)后空間構(gòu)型發(fā)生一定改變導(dǎo)致固定化酶與底物親和力下降。

3.3.4固定化酶半衰期

根據(jù)酶活性指數(shù)衰減定律:E=E0exp(-k*t) 可得：

酶活性半衰期t1/2= 0.693 /k

衰減常數(shù)k= ln(E/E’) / △t；

E,E’分別為前后兩次測(cè)定酶活；

△t為兩次測(cè)定酶活間隔時(shí)間；

按2.3.3.4方法測(cè)定酶活，以ln(E/E’) ～ △t作圖，直線(xiàn)斜率即為k，結(jié)果如圖10：

圖10　固定化酶半衰期

經(jīng)回歸擬合分析得k= 0.021,由此得固定化酶半衰期為33 d?？梢?jiàn)復(fù)合固定化酶半衰期明顯延長(zhǎng)。半衰期對(duì)固定化酶用于實(shí)際生產(chǎn)具有特別重要意義。

4　結(jié)論

將微孔陶瓷填充柱室溫飽和吸附游離酶后，在戊二醛濃度2.0 %，溫度25 ℃，時(shí)間1.5 h條件下交聯(lián)制備得到的固定化酶比活力為146 U/g，酶活總回收率60.8 %；固定化酶km= 5.6 mmol/L,最適溫度為50 ℃，半衰期為33d。本研究結(jié)果酶活回收高，半衰期長(zhǎng)，且酶最適溫度提高，另外微孔陶瓷機(jī)械強(qiáng)度高，為工業(yè)化固定化乳糖酶連續(xù)生產(chǎn)低乳糖牛奶提供了技術(shù)依據(jù)。

[1]趙志華．淺析乳業(yè)現(xiàn)狀、潛在發(fā)展瓶頸及對(duì)策[J]．中國(guó)乳品工業(yè)，2004，32(1)：55-58.

[2]Vassilis G，Migulel L L.Hydrolysis of lactosea literarure review[J].Process Biochem，1985，20(1)：2-12.

[3]潘道東，駱承癢.乳糖酶的固定化及其特性的研究[J].中國(guó)乳品工業(yè)，1991，19(6)：242-247.

[4]駱承癢.應(yīng)用透性化細(xì)胞乳糖酶生產(chǎn)低乳糖乳制品的特點(diǎn)和技術(shù)要求[J].中國(guó)乳業(yè)，2001(3)：9-11.

[5]Papayannaks N,Matkas. Studies on modeling and simulate on of lactose hydrolysis free and immobilized beta-galactosidase from Asperillusniger[J].Chemical Engineering Journal，1993，51(1):575-586.

[6]Pererson R S，Hill C G.Lactose hydrolysis by immobilized β-galactosidase in capillary bed reactor[J].Biotechnology and Bioengineering.1989(34)：438-446.

[7]Miller J.Enzymiclactosehydrolysis[J].Food Technology，1980，32：144-151.

[8]魏群.生物工程技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：高等教育出版社.2002.

[9]Sufang You.Immobilizationand characterization of bera-galactosidase from the plant gram chichen bean.Evolution of its enzymatic actions in the hydrolysis of lactose[J].Journal of agricultural and Food Chemistry，1999，47(3)：819-823.

[10]戚依政，汪叔雄.生化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)與反應(yīng)器[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社.1999.

Study of immobilized β-galactosidase

JIANGXian-jun1，BAOJian-bo2

(1. School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China;2. Wuhan Bo Blue Technology Company, Wuhan 430000, China)

Immobilizedβ-galactosidase has made by microporous ceramic adsorption and glutaraldehyde crosslinking. The results are as follows: aftter 3mm microporous eramic adsorption,β-galactosidase was crosslinked into immobilized enzyme by glutaraldehyde with glutaraldehyde concentration 2.0 %, temperature 25 ℃, time 1.5 hr. The activity of immobilized enzyme is 146 U/g. The recovery rate of immobilized enzyme is 60.8 %. Immobilized enzyme optimumreaction temperature is 50 ℃, the optimum pH = 7,dynamics parameter of immobilized enzyme: km = 5.6 mmol / L. The half-life period of immobilized enzyme is 33 days.

microporous ceramic; immobilized; β-galactosidase

2016-07-10.

江賢君(1962-)，男，副教授，E-mail:1098377885@qq.com.

2095-7386(2016)03-0035-04

10.3969/j.issn.2095-7386.2016.03.006

TS 252

A