運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠記憶能力及神經(jīng)元AMPK信號(hào)分子和自噬的影響

郭春陽(yáng)，劉 濤，李 明

1. 河南大學(xué) 學(xué)生體質(zhì)健康研究所，河南 開(kāi)封 475001； 2. 西安體育學(xué)院 健康科學(xué)系，西安 710068

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運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠記憶能力及神經(jīng)元AMPK信號(hào)分子和自噬的影響

郭春陽(yáng)1，劉 濤2，李 明1

1. 河南大學(xué) 學(xué)生體質(zhì)健康研究所，河南 開(kāi)封 475001； 2. 西安體育學(xué)院 健康科學(xué)系，西安 710068

〔目的〕 探討運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠記憶能力及神經(jīng)元AMPK信號(hào)分子和自噬的影響。〔方法〕 將60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)對(duì)照組、AD模型對(duì)照組、AD模型訓(xùn)練組。在立體定位儀下向大鼠兩側(cè)海馬注射Aβ25-35制造AD模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，通過(guò)Morris水迷宮檢測(cè)各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，用Nissl法檢測(cè)海馬神經(jīng)元存活狀態(tài)；通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)磷酸化AMPK表達(dá)；用Western blot法檢測(cè)P-AMPK、LC3I、LC3II及Beclin-1的表達(dá)?！步Y(jié)果〕 與AD模型對(duì)照組相比較，AD模型訓(xùn)練組大鼠的逃避潛伏期明顯減少，穿越平臺(tái)區(qū)域次數(shù)明顯增加(P<0.01)；AD模型訓(xùn)練組大鼠的CAI區(qū)海馬神經(jīng)元形態(tài)較AD模型對(duì)照組改善明顯，神經(jīng)元數(shù)目顯著增加 (P<0.05)；P-AMPK在AD模型訓(xùn)練組大鼠的表達(dá)明顯增強(qiáng)，且主要在胞漿表達(dá)；與AD模型對(duì)照組相比，AD模型訓(xùn)練組大鼠的P-AMPK和Beclin-1的蛋白表達(dá)都明顯增強(qiáng)(P<0.01)，LC3II/LC3I比值明顯增加(P<0.01)。〔結(jié)論〕 8周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可明顯改善AD模型大鼠的記憶能力、減少AD模型大鼠海馬CAI區(qū)神經(jīng)元損傷數(shù)量。其機(jī)制可能是8周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練激活A(yù)D模型大鼠海馬神經(jīng)元AMPK通路和自噬，進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)元。

腺苷酸活化蛋白激酶； 阿爾茨海默?。?自噬； 運(yùn)動(dòng)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)又稱老年性癡呆，是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病。AD會(huì)使患者遭受嚴(yán)重的痛苦，包括進(jìn)行性記憶功能障礙，出現(xiàn)異常心理和行為癥狀，喪失獨(dú)立生活能力等。AD的主要病理特征是以海馬區(qū)神經(jīng)元減少，β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)異常折疊在神經(jīng)元外形成的老年斑和Tau蛋白過(guò)度磷酸化在神經(jīng)元內(nèi)形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)為主，尤其是Aβ對(duì)神經(jīng)元的毒性是其主要的致病因素之一[1]。以往的研究表明，適宜負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)防治AD有一定的效應(yīng)[2]。流行病學(xué)調(diào)查研究認(rèn)為，長(zhǎng)期適宜負(fù)荷的體育鍛煉可以明顯改善AD患者的認(rèn)知功能和生活自理能力。AD動(dòng)物模型研究表明，對(duì)AD模型大鼠進(jìn)行轉(zhuǎn)籠、跑臺(tái)等訓(xùn)練可改善其學(xué)習(xí)記憶能力，緩解AD腦組織病理學(xué)現(xiàn)象[3-4]。因此，適宜負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)被認(rèn)為是非藥物干預(yù)AD的有效策略。但是，目前運(yùn)動(dòng)干預(yù)AD腦功能確切的細(xì)胞分子機(jī)制還不明確。腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine 5-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，被稱為機(jī)體的“能量感受器”，對(duì)ATP/AMP濃度變化、糖代謝及各種生長(zhǎng)因子、饑餓、運(yùn)動(dòng)等刺激都非常敏感。已有研究表明，大腦能量代謝紊亂與AD的神經(jīng)退行性病變密切相關(guān)，并且可能與早期認(rèn)知功能障礙有關(guān)。所以，人們認(rèn)為AMPK是干預(yù)AD的一種新的靶分子[5]。近年來(lái)，一種新的細(xì)胞死亡方式——自噬(autophagy)，引起研究者廣泛的注意，通過(guò)自噬途徑可以降解功能障礙的細(xì)胞器和/或異常折疊的蛋白質(zhì)，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用。研究表明，AMPK在細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)缺乏、能量降低、氧化應(yīng)激時(shí)可激活自噬，其激活自噬途徑主要是通過(guò)抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的[6]。已有研究表明，激活A(yù)MPK可以降低神經(jīng)元Aβ的產(chǎn)生，這種作用受多種機(jī)制介導(dǎo)，如白藜蘆醇可以通過(guò)激活A(yù)MPK通路引發(fā)自噬，進(jìn)而保護(hù)AD神經(jīng)元[7]。但運(yùn)動(dòng)對(duì)AD神經(jīng)元AMPK通路的影響及AMPK與神經(jīng)元自噬的關(guān)系，目前研究還很少，其機(jī)制有待于進(jìn)一步闡明。

本研究擬提出如下假說(shuō)：適宜負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)可激活A(yù)D腦組織AMPK信號(hào)分子和AD神經(jīng)元自噬，從而保護(hù)AD神經(jīng)元，改善大鼠的記憶能力。在此假說(shuō)下，本文建立β-淀粉樣蛋白海馬區(qū)注射致AD大鼠運(yùn)動(dòng)干預(yù)模型，進(jìn)而探討運(yùn)動(dòng)對(duì)海馬神經(jīng)元AMPK信號(hào)分子及自噬的影響，可能為研究探索AD發(fā)病機(jī)制和治療方案開(kāi)辟新的思路。

1　實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象與分組

雄性2月齡SD大鼠50只，體重(206±12)g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(許可證號(hào)：SCXK(陜)2007-003)。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，自由飲食飲水。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境：室溫(24±1)℃，濕度30%～60%，自然光照。實(shí)驗(yàn)前，隨機(jī)將大鼠分為4組：正常對(duì)照組(Normal Control Group，NC組)，10只；運(yùn)動(dòng)對(duì)照組(Exercise Control Group，EC組)，10只；AD模型對(duì)照組(Alzheimer Control Group，AC組)，15只；AD模型訓(xùn)練組(Alzheimer Exercise Group，AE組)，15只。

1.2實(shí)驗(yàn)造模

以大鼠海馬區(qū)注射凝聚態(tài)Aβ25-35作為AD動(dòng)物模型，可以較好地建立大鼠的AD記憶障礙模型。

NC組大鼠，按常規(guī)飼養(yǎng)，自由活動(dòng)。

AC組和AE組大鼠，用2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉；麻醉后固定于立體定位儀上，切開(kāi)皮膚，找到前囟位置，參考大鼠圖譜海馬CAI所在部位體表投影位置，以電鉆鉆開(kāi)一骨窗，將微量注射器固定在立體定位儀上，左右兩側(cè)各緩慢均勻注入5μl凝聚態(tài)Aβ25-35；完畢，留針5 min，然后緩慢撤針，術(shù)后縫合皮膚[8]，常規(guī)飼養(yǎng)，青霉素肌注每日1次共5天，以防止感染。造模過(guò)程中AC組大鼠死亡4只，AE組大鼠死亡3只。造模結(jié)束后，AE組大鼠進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練，共8周。在本實(shí)驗(yàn)中，參照Bedford跑臺(tái)訓(xùn)練方案[9]加以改動(dòng)，因?yàn)?60%～70%)VO2max可以看做是中等負(fù)荷訓(xùn)練，但本實(shí)驗(yàn)對(duì)象是AD造模大鼠，體力較正常大鼠弱，所以我們?cè)?5% VO2max跑速的基礎(chǔ)上將跑臺(tái)速度下調(diào)，最終定為15 m/min，并在實(shí)驗(yàn)中通過(guò)觀察大鼠的毛色、飲食、糞便、體重及運(yùn)動(dòng)能力來(lái)確定，確保大鼠不會(huì)出現(xiàn)疲勞癥狀。訓(xùn)練方案為：第1周，跑速10 m/min，30 min/d，6 d/周，周日休息；第2～4周，跑速15 m/min，45 min/d，6 d/周，周日休息；第5～8周，跑速15 m/min，60 min/d，6 d/周，周日休息。

EC組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，訓(xùn)練方案同AE組，也持續(xù)8周。

在訓(xùn)練期，AE組和EC組各有2只大鼠非正常死亡。

1.3SD大鼠行為學(xué)測(cè)試

Morris水迷宮是英國(guó)心理學(xué)家Morris于20世紀(jì)80年代初設(shè)計(jì)并應(yīng)用于腦學(xué)習(xí)、記憶機(jī)制研究的一種實(shí)驗(yàn)手段，在AD研究中的應(yīng)用非常普遍。實(shí)驗(yàn)前一天，將大鼠放入水中自由游泳2 min，使其熟悉迷宮環(huán)境。在實(shí)驗(yàn)第9周，采用Morris水迷宮檢測(cè)各組大鼠定位航行和空間探索行為能力，判斷各組大鼠學(xué)習(xí)記憶和空間記憶的認(rèn)知能力：①定位航行實(shí)驗(yàn)，共5 d，將大鼠從標(biāo)記的4個(gè)入水點(diǎn)依次朝向池壁輕輕放入水中，記錄大鼠在120 s內(nèi)尋找到并爬上平臺(tái)所用時(shí)間，即逃避潛伏期；②空間探索實(shí)驗(yàn)，撤除平臺(tái)，將大鼠放入水池中，記錄大鼠在120 s內(nèi)在平臺(tái)所放置的目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺(tái)所在區(qū)域的次數(shù)。

1.4海馬CAI區(qū)Nissle染色

水迷宮測(cè)試結(jié)束后24 h，用10%的水合氯醛(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)升主動(dòng)脈灌注肝素化的生理鹽水250 mL，繼4%多聚甲醛500 mL灌注。取海馬置4%多聚甲醛溶液中后固定24 h，先后移入含20%、30%梯度蔗糖的新鮮固定液(4 ℃)中；待其沉底，恒冷箱切片機(jī)做冠狀冷凍切片，片厚20μm；切片裱于經(jīng)多聚賴氨酸處理過(guò)的玻片上，室溫干燥；切片入蒸餾水，從70%酒精開(kāi)始逐級(jí)上行至無(wú)水酒精脫脂，每級(jí)約2 min，再下行返回各級(jí)酒精；每級(jí)約2 min，最后入蒸餾水10 min×2；0.5%甲苯胺藍(lán)(60 ℃)浸染60 min；水洗，梯度酒精分化、脫水；二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀察。采用Image-pro Plus 6.0軟件計(jì)數(shù)陽(yáng)性染色像素總和，采用陽(yáng)性染色像素計(jì)數(shù)總和反映腦片內(nèi)存活的神經(jīng)細(xì)胞。

表1　各組SD大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期(單位：s)

1.5海馬CAI區(qū)P-AMPK免疫熒光染色

取材同上，石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。3%的H2O2去離子水孵育30 min， PBS清洗，抗原修復(fù)后血清封閉室溫30 nin，傾去，勿洗。 滴加一抗(P-AMPK, 1∶400)，4 ℃過(guò)夜。PBS沖洗，3 min×5次。滴加熒光二抗(羊抗兔CY3，1∶200)，室溫?fù)u床孵育1 h，PBS洗脫，甘油封片，熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照。

1.6Western Blot 檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后，10%水合氯醛( 30 mg/kg) 腹腔注射麻醉大鼠，迅速斷頭取腦。切取海馬置于預(yù)冷的細(xì)胞裂解液中，充分勻漿后冰上靜置30 min；沸水中煮5 min，冰上冷卻5 min，以12 000 r/min轉(zhuǎn)速于4 ℃離心30 min；棄沉淀，留上清液。取小部分上清液用BCA法測(cè)定蛋白濃度，剩余上清液分裝后置-80 ℃冰箱中待用。等量蛋白樣品(50 μg)經(jīng)12.5%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。經(jīng)5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，分別用兔多抗P-AMPK(Thr172)、Beclin-1(1∶2 000)、鼠單抗LC3I/II(1∶2 000)、兔單抗β-action(1∶1 000)室溫孵育1 h后，4 ℃過(guò)夜；TBST洗膜10 min×3次，分別加入相應(yīng)的HRP結(jié)合的羊抗兔、羊抗鼠IgG (1∶2 000)室溫孵育1 h；TBST洗10 min×3次，加入ECL發(fā)光液1 min后于暗室內(nèi)進(jìn)行膠片曝光、顯影、定影、晾干。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，β-action作為內(nèi)參照，以目的條帶與內(nèi)參的吸光度比值表示蛋白表達(dá)，應(yīng)用Bandscan.5.0進(jìn)行分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1SD大鼠行為學(xué)測(cè)試結(jié)果

2.1.1各組SD大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如表1所示，定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組大鼠的Morris水迷宮逃避潛伏期隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的增加都有下降的趨勢(shì)。在實(shí)驗(yàn)的第3、4、5天，AC組和AE組逃避潛伏期與NC組比較，明顯增加(P<0.05，P<0.01)，表明這兩組大鼠空間記憶能力顯著下降。在實(shí)驗(yàn)的第5天，AE組逃避潛伏期與AC組比較，明顯降低(P<0.01)，表明AE組大鼠的空間記憶能力較AC組要顯著增強(qiáng)。

2.1.2各組SD大鼠空間探索成績(jī)比較

各組大鼠的Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)成績(jī)?nèi)绫?所示。與NC組相比，AC組在目標(biāo)象限停留的時(shí)間明顯降低(P<0.01)，穿越原平臺(tái)位置次數(shù)也顯著減少(P<0.01)，表明AC組大鼠的空間探索能力與NC組相比明顯減弱。與AC組比較，AE組在目標(biāo)象限停留的時(shí)間明顯變長(zhǎng)(P<0.05)，穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)也顯著增加(P<0.01)，表明AE組大鼠的空間探索能力與AC組比較有顯著提高。

表2　各組SD大鼠Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)成績(jī)

2.2SD大鼠海馬CAI區(qū)神經(jīng)元Nissle染色結(jié)果

Nissle染色結(jié)果如圖1所示：NC組與EC組神經(jīng)元飽滿，細(xì)胞邊界清晰，細(xì)胞排列緊密，尼氏小體染色均勻，細(xì)胞核無(wú)固縮現(xiàn)象；AC組神經(jīng)元排列稀疏，細(xì)胞邊界模糊，細(xì)胞核出現(xiàn)大量固縮(見(jiàn)白色箭頭)，尼氏小體著色不勻，部分細(xì)胞已解體；AE組神經(jīng)元部分細(xì)胞核也出現(xiàn)固縮，但尼氏小體較AC組著色相對(duì)均勻，細(xì)胞排列也較清晰、緊密。

圖1　各組SD大鼠海馬CA1區(qū)Nissle染色圖

對(duì)神經(jīng)元尼氏體染色陽(yáng)性細(xì)胞的計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表3：AC組CAI區(qū)海馬神經(jīng)元數(shù)目較NC組顯著減少(P<0.01)，AE組神經(jīng)元數(shù)目較NC組也顯著減少(P<0.05)，但AE組較AC組神經(jīng)元數(shù)目顯著增加(P<0.05)。此結(jié)果表明，AE組神經(jīng)元形態(tài)及存活數(shù)量較AC組明顯改善。

表3　各組海馬CAI區(qū)神經(jīng)元計(jì)數(shù)(個(gè))

2.3大鼠海馬CA1區(qū)P-AMPK免疫熒光染色結(jié)果

對(duì)海馬CAI區(qū)神經(jīng)元P-AMPK進(jìn)行免疫熒光染色，胞漿紅染為P-AMPK陽(yáng)性細(xì)胞，結(jié)果如圖2所示：P-AMPK在AE組表達(dá)明顯增強(qiáng)，且主要在胞漿表達(dá)，而在AC組P-AMPK表達(dá)很弱，NC組、EC組P-AMPK表達(dá)介于二者之間。此結(jié)果表明，AE組海馬神經(jīng)元P-AMPK被激活。

圖2　各組SD大鼠海馬CAI區(qū)P-AMPK免疫熒光染色圖

2.4Western Blot檢測(cè)結(jié)果

Western Blot檢測(cè)結(jié)果(見(jiàn)圖3、圖4、圖5)顯示：與NC組比較，AC組P-AMPK蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)，AE組P-AMPK表達(dá)較NC組和AC組明顯增強(qiáng)(P<0.01)。此結(jié)果與熒光染色結(jié)果相同。AE組LC3II/LC3I比值較NC組和AC組明顯增強(qiáng)(P<0.01)，其余三組LC3II/LC3I比值無(wú)顯著性差異。與NC組相比，EC組和AE組Beclin-1蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)，AC組Beclin-1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)；與AC組相比，AE組Beclin-1蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)。

圖3　SD大鼠海馬P-AMPK蛋白相對(duì)表達(dá)量

圖4　SD大鼠海馬LC3II/LC3I蛋白相對(duì)表達(dá)量

圖5　SD大鼠海馬Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量

3　討論

3.1跑臺(tái)訓(xùn)練對(duì)AD模型大鼠記憶和神經(jīng)元病理改變的影響

AD作為一種病理機(jī)制尚未完全明確的神經(jīng)退行性疾病，是神經(jīng)學(xué)科研究的熱點(diǎn)之一，目前還無(wú)有效的治療手段。在AD的非藥物治療方案中，運(yùn)動(dòng)干預(yù)由于其有效性和經(jīng)濟(jì)性受到廣泛關(guān)注。

流行病學(xué)調(diào)查顯示，對(duì)一定人群的AD患者給予不同負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)刺激后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)常參與體育運(yùn)動(dòng)的老年人患老年性癡呆的危險(xiǎn)較低，中等負(fù)荷的體育運(yùn)動(dòng)可以防止老年人認(rèn)知功能下降，改善AD 患者的認(rèn)知功能[10-11]。通過(guò)建立AD動(dòng)物模型，并進(jìn)行一定強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)干預(yù)也表明[12]，運(yùn)動(dòng)可以改善AD動(dòng)物模型的記憶功能。

近年來(lái)的研究表明，適宜負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)AD大鼠模型的學(xué)習(xí)記憶能力有不同程度的提高。Wang等[13]的研究證明，通過(guò)腦室內(nèi)注射Aβ制作的AD大鼠模型給予12 d的轉(zhuǎn)籠訓(xùn)練后，Y型迷宮成績(jī)明顯提高，神經(jīng)元丟失和突觸數(shù)目減少都明顯緩解。Kang等[14]也證實(shí)，海馬區(qū)注射Aβ的AD大鼠模型經(jīng)過(guò)跑臺(tái)訓(xùn)練后，旋臂水迷宮的學(xué)習(xí)記憶能力明顯提高。選擇一種合適的運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案對(duì)AD的干預(yù)治療是至關(guān)重要的，針對(duì)AD病人一般年齡偏高，體力較差，只適合參與輕度或中等負(fù)荷的體力活動(dòng)。因此，在本實(shí)驗(yàn)中我們對(duì)AD大鼠的運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案選擇中等負(fù)荷的跑臺(tái)訓(xùn)練。

我們借鑒前人的研究方案，通過(guò)大鼠海馬區(qū)注射凝聚態(tài)Aβ25-35建立AD大鼠模型，發(fā)現(xiàn)AD大鼠的逃避潛伏期與正常大鼠相比明顯變長(zhǎng)，目標(biāo)象限的停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)與正常大鼠比較也明顯變短和變少。這些結(jié)果都表明AD大鼠的近期記憶能力下降明顯，也與我們前面的研究結(jié)果類似[15]，說(shuō)明本次造模在行為學(xué)上是成功的。

進(jìn)一步，我們觀察到經(jīng)過(guò)8周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后發(fā)現(xiàn)，AD大鼠行為學(xué)指標(biāo)明顯改善，其學(xué)習(xí)記憶能力得到顯著提高，這表明本實(shí)驗(yàn)選取的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和負(fù)荷可以改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。AD患者不但有漸進(jìn)性記憶障礙，還有非常明顯的病理學(xué)改變，除經(jīng)典的老年斑外，還有突觸丟失和神經(jīng)元丟失，而海馬區(qū)被認(rèn)為是與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系最為密切的腦功能區(qū)，海馬神經(jīng)元丟失引起的細(xì)胞突觸減少是記憶功能下降的病理基礎(chǔ)。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到AD大鼠海馬CAI區(qū)神經(jīng)元受損嚴(yán)重，表現(xiàn)為尼氏小體著色不均勻，核固縮等凋亡現(xiàn)象，以致神經(jīng)元丟失，而AD訓(xùn)練組大鼠的海馬CAI區(qū)尼氏小體形態(tài)與AD模型組比較明顯改善，AD訓(xùn)練組神經(jīng)元存活數(shù)量也明顯多于AD模型組。這表明，適宜負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)刺激可以改善神經(jīng)元的生存環(huán)境、促進(jìn)神經(jīng)元的活性。但適宜運(yùn)動(dòng)的刺激如何保護(hù)AD神經(jīng)元的丟失，是我們比較關(guān)心的問(wèn)題。在本實(shí)驗(yàn)中，我們選擇對(duì)運(yùn)動(dòng)刺激敏感的AMPK信號(hào)分子及與神經(jīng)元丟失密切相關(guān)的細(xì)胞自噬兩個(gè)點(diǎn)進(jìn)行研究。

3.2運(yùn)動(dòng)對(duì)AD神經(jīng)元AMPK和自噬的影響

AMPK是一個(gè)由α、β、γ三個(gè)亞基組成的蛋白激酶，其α亞基在海馬神經(jīng)元中的表達(dá)較高。目前普遍認(rèn)為，AMPK的α亞基中蘇氨酸172位點(diǎn)的磷酸化是AMPK活化的關(guān)鍵[16]，而運(yùn)動(dòng)被認(rèn)為是生理?xiàng)l件下對(duì)AMPK激活最為顯著的因素之一[17]，關(guān)于運(yùn)動(dòng)對(duì)AMPK信號(hào)通路的認(rèn)識(shí)主要集中在骨骼肌方面。一種觀點(diǎn)是，類似耐力運(yùn)動(dòng)的刺激會(huì)選擇性激活A(yù)MPK通路，從而抑制mTOR的活性，減少蛋白質(zhì)的合成[18]。關(guān)于運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)AD神經(jīng)元AMPK/mTOR信號(hào)通路的研究還很少，考慮到耐力訓(xùn)練可以激活骨骼肌AMPK信號(hào)，那么運(yùn)動(dòng)是否可以激活A(yù)D腦神經(jīng)元AMPK信號(hào)通路？這是我們非常感興趣的問(wèn)題。

在本研究中，免疫熒光染色和蛋白定量實(shí)驗(yàn)都顯示：與AD模型組大鼠比較，AD訓(xùn)練組大鼠海馬神經(jīng)元中磷酸化的AMPK表達(dá)明顯增強(qiáng)， 甚至AD訓(xùn)練組大鼠磷酸化的AMPK表達(dá)都明顯高于對(duì)照組和正常訓(xùn)練組大鼠。這表明，運(yùn)動(dòng)刺激對(duì)AD神經(jīng)元AMPK的激活是非常顯著的。AMPK激活后可引起一系列下游生理事件的發(fā)生，AMPK的下游信號(hào)分子很多，其中AMPK/mTOR信號(hào)通路引起的自噬可能對(duì)AD神經(jīng)元的凋亡和存活產(chǎn)生重要影響。

自噬既是細(xì)胞的一種自殺現(xiàn)象，也是一種蛋白質(zhì)降解機(jī)制，多是細(xì)胞處于饑餓、能量匱乏、溫度升高等各種病理狀態(tài)下的一種崩解。崩解產(chǎn)生的各種細(xì)胞碎片又能重新被細(xì)胞利用，所以自噬會(huì)消滅一些對(duì)機(jī)體造成損傷的細(xì)胞，適度的自噬可對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用。但自噬過(guò)度又會(huì)造成正常細(xì)胞的死亡，所以自噬是一把“雙刃劍”，如何合理有效地利用細(xì)胞的自噬現(xiàn)象是我們尋找治療疾病的關(guān)鍵。

目前，關(guān)于運(yùn)動(dòng)對(duì)神經(jīng)元AMPK與自噬調(diào)節(jié)的文獻(xiàn)非常匱乏，而運(yùn)動(dòng)通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK與自噬對(duì)AD影響的研究還未見(jiàn)到。

微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3，MAP1-LC3)是酵母自噬相關(guān)基因8的哺乳動(dòng)物同源體，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞典型的一種自噬體標(biāo)志物。在自噬狀態(tài)下，LC3-I會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N膜結(jié)合形式即LC3-II。因此，常用LC3-II/LC3-I比值來(lái)衡量自噬活性，其比值升高提示自噬活性加強(qiáng)。哺乳動(dòng)物Beclin-1是酵母自噬相關(guān)基因6的同源物，Beclin-1與自噬吞噬小泡的形成初期有關(guān)，是自噬的發(fā)起者，Beclin-1也常作為自噬體形成的重要的正調(diào)節(jié)因子[19]。

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，AD訓(xùn)練組大鼠神經(jīng)元LC3-II/LC3-I比值及Beclin-1表達(dá)較對(duì)照組和AD模型組均升高，自噬發(fā)生的標(biāo)志性蛋白LC3-II和Beclin-1表達(dá)均增加。這提示本研究的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷可誘導(dǎo)AD大鼠海馬神經(jīng)元自噬的產(chǎn)生，而在觀察到LC3-II和Beclin-1表達(dá)增加的同時(shí)，我們還觀察到AD訓(xùn)練組神經(jīng)元AMPK的活化。由此可見(jiàn)，AD神經(jīng)元AMPK的活化與神經(jīng)元的自噬有著密切的關(guān)系，而活化的AMPK如何引起自噬或通過(guò)下游的何種信號(hào)通路激活自噬還有待進(jìn)一步研究。

我們還發(fā)現(xiàn)，AD模型組大鼠的Beclin-1表達(dá)明顯低于對(duì)照組?？赡苁潜緦?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ拖翧D大鼠海馬神經(jīng)元發(fā)生自噬之前，神經(jīng)元已經(jīng)大量死亡，而運(yùn)動(dòng)能強(qiáng)烈刺激神經(jīng)元自噬體的產(chǎn)生，從而清除衰老及受損神經(jīng)元，保護(hù)正常神經(jīng)元活性，表現(xiàn)為訓(xùn)練組AD大鼠神經(jīng)元存活數(shù)量明顯多于AD模型組大鼠。

祖靚等[20]發(fā)現(xiàn)力竭運(yùn)動(dòng)即刻后，小鼠骨骼肌AMPK活性明顯提高，細(xì)胞的自噬水平也顯著增加，提出力竭運(yùn)動(dòng)可以通過(guò)AMPK途徑顯著提高骨骼肌細(xì)胞自噬水平。丁樹(shù)哲等[21]認(rèn)為，適宜強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可通過(guò)上調(diào)細(xì)胞自噬水平，為細(xì)胞再生提供一定的能量與合成底物，而自噬的過(guò)度激活則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷或疲勞，甚至可能誘發(fā)自噬性細(xì)胞死亡，所以運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的選擇是激發(fā)自噬水平的關(guān)鍵。在AD神經(jīng)元中，適度的自噬現(xiàn)象可減少正常神經(jīng)元的丟失，已有研究表明[22]，一種藥物如白藜蘆醇可通過(guò)激活A(yù)MPK進(jìn)而提高AD神經(jīng)元自噬，改善神經(jīng)元的功能。姜寧等[23]也發(fā)現(xiàn)，早期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可初步啟動(dòng)中腦和紋狀體自噬，進(jìn)而改善中腦和紋狀體線粒體功能。

4　結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，8周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可明顯改善AD模型大鼠的記憶能力，減少AD模型大鼠海馬CAI區(qū)神經(jīng)元損傷數(shù)量。其機(jī)制可能是8周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練激活A(yù)D大鼠海馬神經(jīng)元AMPK通路，引起神經(jīng)元自噬，進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)元。

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[責(zé)任編輯李麥產(chǎn)]

Effect of exercise intervention on Alzheimer’s disease model and memory and neuron of rat AMPK signaling molecules and autophagy

GUO Chunyang1, LIU Tao2, LI Ming1

1. Institute of Student Fitness and Health, Henan University, Henan Kaifeng 475001, China; 2. Department of Healthy Science, Xi’an Physical Education University, Xi’an 710068, China

〔Objective〕To investigate the effects of exercise intervention on Alzheimer’s disease model and memory and neuron of rat AMPK signaling molecules and autophagy.〔Methods〕60 male SD rats were randomly divided into normal control group, exercise group, AD control group, AD training group. Model of rathippocampus to bilateral injection of Aβ25-35manufacturing AD under stereotactic instrument. After the experiment through the test of Morris water maze learning and memory ability of rats in each group, the Nissle method for the detection of hippocampal neuron survival; immunofluorescent staining was used to detect the expression of phosphorylated AMPK expression; Western blot method to detect P-AMPK, LC3I, LC3II and Beclin-1.〔Results〕Compared with AD control group, AD training group escape latency of rats increased significantly, space exploration results significantly decreased, the decrease in the number of surviving neurons in hippocampus, the expression of P-AMPK and Beclin-1 decreased, but the ratio of LC3II/LC3I had no change; Compared with AD control group, the rats of AD training group behavior index were significantly improved, a marked increase in the number of hippocampal neuron survival the expression of P-AMPK, LC3II/LC3I, Beclin-1 and ratios were significantly increased. 〔Conclusion〕8 weeks of treadmill exercise can improve the memory ability of AD rats, reduce the number of neurons in CAI area of hippocampus injury in rats AD model. The mechanism may be the expression of exercise training for 8 weeks to activate AD neurons of rat in the phosphorylation of AMPK, then cause neuronal autophagy to protect normal neurons.

AMPK; Alzheimer’s disease; autophagy; exercise

1672-7606(2016)03-0182-07

2016-06-05

陜西省教育廳自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2013JK0777)

郭春陽(yáng)(1973-)，男，河南上蔡人，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師,從事運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)教學(xué)與科研工作。

R339.1

A