rhBMP-2對再生障礙性貧血小鼠骨髓造血恢復(fù)的促進(jìn)作用

高巧艷， 王 靖， 邢萬里， 戴 凱， 劉昌勝（華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，教育部醫(yī)用生物材料工程研究中心，上海 200237）

rhBMP-2對再生障礙性貧血小鼠骨髓造血恢復(fù)的促進(jìn)作用

高巧艷， 王 靖， 邢萬里， 戴 凱， 劉昌勝
（華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，教育部醫(yī)用生物材料工程研究中心，上海 200237）

探究了人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（rhBMP-2）對再障小鼠的治療作用。采用5-FU聯(lián)合白消安建立小鼠再障模型，通過干預(yù)rhBMP-2進(jìn)行治療?？疾炝烁鲗?shí)驗(yàn)組小鼠白細(xì)胞數(shù)、骨髓單核細(xì)胞數(shù)、體重、存活率、脾系數(shù)、粒系-巨系細(xì)胞集落（CFU-GM）數(shù)以及骨髓單核細(xì)胞中CD34＋細(xì)胞比例，進(jìn)行股骨、脾臟HE切片分析。結(jié)果表明，相較于再障對照組，rhBMP-2治療組小鼠的白細(xì)胞數(shù)、存活率、CFU-GM集落數(shù)及骨髓單核細(xì)胞數(shù)顯著提高，并且骨髓單核細(xì)胞中的CD34＋細(xì)胞含量也提高，顯著改善脾臟功能和緩解骨髓抑制，證實(shí)rhBMP-2能夠促進(jìn)再障小鼠造血損傷的修復(fù)。

重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2；再生障礙性貧血；造血損傷修復(fù)

再生障礙性貧血（Aplastic Anemia，AA）簡稱再障，是一種嚴(yán)重的血液病。它是由多種因素引發(fā)的造血障礙，導(dǎo)致造血組織減少，骨髓造血功能衰竭，以骨髓造血細(xì)胞增生減低和全血細(xì)胞減少為主要表現(xiàn)。再障可分為先天性再障和獲得性再障。據(jù)統(tǒng)計(jì)國內(nèi)的再障發(fā)病率為7.4×10－6，其中急性重型再障（SAA-I）發(fā)病率為1.4×10－6，慢性重型再障（SAA-Ⅱ）為6.0×10－6［1-2］。目前治療再障的方法有造血干細(xì)胞移植、骨髓移植、免疫抑制治療、免疫支持治療、細(xì)胞因子治療法等。但造血干細(xì)胞移植和骨髓移植來源有限，并且要考慮移植物抗宿主疾病，所以應(yīng)用很有限。所以尋找對人體毒副作用小、治療效果好的治療再障藥物具有重要的意義。

重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（rh BMP-2）作為已被美國FDA批準(zhǔn)用于脊柱融合和脛骨骨折臨床治療［3］的轉(zhuǎn)化生長因子，因其具有優(yōu)異的誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞分化為骨和軟骨細(xì)胞的特性［4］而備受關(guān)注。近年來的相關(guān)研究表明，BMP-2在機(jī)體造血發(fā)生過程中也有作用。田瓊等［5-6］研究表明，rhBMP-2可減輕γ射線輻射及化療藥物CTX所致的急性造血損傷，具有治療修復(fù)造血損傷的潛能；同時趙瑋欽等［7］研究發(fā)現(xiàn)重組人骨形成蛋白成熟肽-4及重組人骨形成蛋白-4二連體對損傷造血系統(tǒng)修復(fù)有明顯的促進(jìn)作用。本文通過建立小鼠再障造血損傷模型，探究了rhBMP-2在再障造血損傷修復(fù)中的作用。

1　材料和方法

1.1主要試劑

rh BMP-2購自上海瑞邦生物材料有限公司；FITC Rat Anti-Mouse CD45、PE Rat Anti-Mouse CD34購自優(yōu)寧維生物科技有限公司；小鼠單系集落甲基纖維素培養(yǎng)基購自北京安普生化科技有限公司；五氟尿嘧啶、白消安購自西安科創(chuàng)藥業(yè)有限公司；紅細(xì)胞裂解液（Tris-NH4Cl）購自碧云天生物科技有限公司；多聚甲醛購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；溶血素、HB含酶清洗液購自南京普朗醫(yī)用設(shè)備有限公司。

1.2主要儀器

FACs Calibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；TE2000-U倒置顯微鏡購自日本Nikon公司；XFA 6130血細(xì)胞分析儀購自南京普朗醫(yī)療設(shè)備有限公司；5415R低溫高速離心機(jī)購自德國Eppendorf公司；AB104-N電子分析天平購自梅特勒托儀器有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1再生障礙性貧血動物模型建立 Balb/C小鼠腹腔注射五氟尿嘧啶（5-FU）200μL（150 mg/kg），2 d后腹腔注射白消安200μL（15 mg/kg），每周1次，連續(xù)3周，建立小鼠再生障礙性貧血模型。1.3.2 實(shí)驗(yàn)動物及分組 SPF級Balb/C小鼠90只，雄性，18～20 g，鼠齡6～8周，購自上海中醫(yī)藥大學(xué)。所有動物適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察3 d后隨機(jī)分為3組，每組30只，正常飼養(yǎng)，自由攝食和飲水。其中A組（Normal）：空白對照組，腹腔注射磷酸緩沖溶液（PBS）；B組（BMP）：rhBMP-2組，按1.3.1節(jié)的方法造模1周后，連續(xù)2周腹腔注射rhBMP-2（BMP），每只小鼠每天的劑量為50μg；C組（AA）：再障對照組，按1.3.1節(jié)的方法造模1周后，連續(xù)2周腹腔注射PBS；各小鼠注射體積均為每天100μL。

各組小鼠在建模4周后全部處死檢測。

1.3.3外周血白細(xì)胞（WBC）檢測 造模前取1次血，造模后每周取1次血，檢測白細(xì)胞數(shù)。方法如下：使用毛細(xì)玻璃管在小鼠右眼眼眶取血約50μL，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的EDTA-K2溶液抗凝，然后用血細(xì)胞分析儀檢測WBC數(shù)量。

1.3.4脾系數(shù)的檢測 造模后第4周，檢測脾系數(shù)。方法如下：處死前對小鼠先稱重記錄，處死后解剖取出脾臟并稱重，脾系數(shù)=脾臟質(zhì)量/體重。

1.3.5股骨骨髓單核細(xì)胞數(shù)（BMNC）檢測 脫頸法處死小鼠，在體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇中浸泡5 min，在無菌環(huán)境下取出股骨，用5 m L的注射器吸取PBS，從股骨一端沖洗，沖洗液用4號針頭過濾，再用400目（38μm）的無菌紗布過濾，離心去上清后加入Tris-NH4Cl，室溫靜止5 min，再次離心，棄上清，PBS重懸，過濾后調(diào)整濃度，顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.3.6粒系-巨系細(xì)胞集落（CFU-GM）形成測定

將1.3.5節(jié)中制備的骨髓單核細(xì)胞懸液在無菌環(huán)境下，離心加入100μL培基，制成細(xì)胞懸液。于1 m L甲基纖維素培養(yǎng)基中加入10μL細(xì)胞懸液，分散均勻后，轉(zhuǎn)移至24孔板，于37℃、φ=5%CO2、培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d后，顯微鏡下計(jì)數(shù)，超過50個細(xì)胞的細(xì)胞簇為一個集落。

1.3.7小鼠骨髓細(xì)胞中CD34＋細(xì)胞比例變化分析

將1.3.5節(jié)中制備的骨髓單核細(xì)胞懸液調(diào)整濃度至2×106～5×106個/m L，離心去上清，加入CD34抗體10μL。4℃孵育30 min后，用PBS清洗一遍，抗體保存液固定，采用流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.8小鼠脾臟和股骨組織形態(tài)學(xué)觀察 實(shí)驗(yàn)取出小鼠雙側(cè)股骨，用甲醛（w=10%）固定，脫鈣，浸蠟包埋；脾臟，迅速用甲醛固定，浸蠟包埋，矢裝面切片（3 μm），HE染色，觀察骨髓細(xì)胞的變化。

2　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用Origin 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，兩組間比較采用卡方檢驗(yàn)，檢測數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1rhBMP-2對再障小鼠體重、存活率和外周血WBC的影響

表1示出了各實(shí)驗(yàn)組造模后的體重、存活率、WBC變化情況。由表1可看出，造模后1周內(nèi)，各組均未給予rhBMP-2，此時B組和C組WBC、體重、存活率都顯著低于A組，且B組與C組相比沒有顯著差異，表明建模成功。B組從第2周干預(yù)rhBMP-2治療后，WBC和體重都出現(xiàn)上升的趨勢，至第4周時，B組WBC已恢復(fù)至正常組的50%左右，體重也達(dá)到正常的70%左右。相比較而言，C 組2～4周，體重并未增加，同時WBC不斷下降，死亡率升高。至第4周時，B組的存活率接近C組的2倍。上述結(jié)果顯示，rhBMP-2能夠促進(jìn)再障小鼠的WBC和體重的恢復(fù)，同時能提高小鼠的存活率。

表1　各實(shí)驗(yàn)組造模后的體重、存活率和WBC變化Table 1 Weight，survival ratio and WBC change after modeling

3.2rhBMP-2對再障小鼠骨髓單核細(xì)胞數(shù)和CD34+細(xì)胞含量影響

造模4周各組小鼠骨髓單核細(xì)胞數(shù)如圖1所示。由圖1可以看出，C組小鼠的骨髓單核細(xì)胞數(shù)只有A組小鼠的20%左右，rhBMP-2干預(yù)治療的B組已恢復(fù)到A組的50%左右，是C組的2倍左右，B和C兩組間存在顯著性差異（P＜0.05）。同時，骨髓單核細(xì)胞中CD34＋細(xì)胞的含量見圖2。

圖1　造模4周各組小鼠骨髓單核細(xì)胞數(shù)（P＜0.05）Fig.1 BMNC values on the fourth week after modeling（P＜0.05）

造模4周后，C組中CD34＋細(xì)胞數(shù)量只有A組的20%左右，而B組經(jīng)rh BMP-2治療后已恢復(fù)到A組的50%左右，是再障對照組的2.5倍，表明rhBMP-2不但能夠促進(jìn)再障小鼠的骨髓單核細(xì)胞數(shù)的提升，而且可以提高再障小鼠骨髓單核細(xì)胞中CD34＋細(xì)胞的含量。

圖2　造模4周各實(shí)驗(yàn)組的骨髓單核細(xì)胞中CD34＋細(xì)胞含量（P＜0.05）Fig.2 BMNCs CD34＋ratio in each group on the fourth week after modeling（P＜0.01）

3.3 rhBMP-2對再障小鼠骨髓CFU-GM形成的影響

造模4周骨髓CFU-GM集落計(jì)數(shù)如圖3所示。由圖3可以看出，注射rhBMP-2的B組小鼠骨髓細(xì)胞體外培養(yǎng)的CFU-GM集落數(shù)已恢復(fù)到A組的25%左右，而C組只有A組的14%左右，B組是C組的1.8倍，兩者有明顯差異（P＜0.05）。同時圖4示出了各組骨髓細(xì)胞體外培養(yǎng)CFU-GM的照片?？梢钥闯稣＝MA組的集落形貌明顯比B組和C組大，且細(xì)胞分散也比較集中。B組雖然比A組小，但是細(xì)胞分布仍比較集中。而C組的集落不僅小，細(xì)胞也較為分散。CFU-GM集落的數(shù)量和形貌反應(yīng)了機(jī)體造血干/祖細(xì)胞的增殖分化能力。綜合圖3和圖4表明，rhBMP-2能夠促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞數(shù)量的提高和功能的恢復(fù)，促進(jìn)再障小鼠的骨髓造血功能的改善和重建。

圖3　造模4周骨髓CFU-GM集落計(jì)數(shù)（P＜0.05）Fig.3 Number of CFU-GM BM on the fourth week after modeling（P＜0.05）

圖4　骨髓細(xì)胞體外培養(yǎng)CFU-GM的照片F(xiàn)ig.4 CFU-GM morphology of bone marrow cells

3.4rhBMP-2對再障小鼠脾系數(shù)的影響

各組小鼠造模4周脾系數(shù)變化如圖5所示。B、C兩組脾系數(shù)較A組均下降，B組為A組的53%，C組為A組的38%，表明小鼠脾臟出現(xiàn)損傷，處于萎縮狀態(tài)。脾臟的萎縮直接影響小鼠的造血功能，同時還會導(dǎo)致小鼠的免疫力變差，容易感染，這與造模4周后小鼠的存活率變化情況一致。但同時可以發(fā)現(xiàn)，rhBMP-2治療組的脾系數(shù)是再障對照組的1.4倍，兩者有顯著差別（P＜0.05），說明rh BMP-2在一定程度上提高了再障小鼠的脾系數(shù)，促進(jìn)改善脾臟功能恢復(fù)。

3.5組織形態(tài)學(xué)評價

造模4周后，小鼠股骨HE組織切片的染色結(jié)果見圖6。圖6（a）顯示正常小鼠股骨HE染色，骨髓各系分布正常。當(dāng)骨髓中出現(xiàn)大量脂肪泡時預(yù)示著骨髓受到抑制，功能在退化。圖6（b）和（c）示出了B組和C組小鼠的骨髓生長都明顯受到了抑制，骨髓的功能也在退化，但是B組脂肪泡明顯少于C組，說明B組的骨髓抑制程度比C組輕。

圖5　造模4周脾系數(shù)值變化（P＜0.05）Fig.5 Spleen coefficient values of each group on the fourth week after modeling（P＜0.05）

圖7示出了造模4周后各實(shí)驗(yàn)組小鼠的脾臟切片。圖7（a）示出的是正常小鼠的脾臟HE切片，未見明顯異常；圖7（b）是注射rhBMP-2的小鼠的脾臟照片，從圖中可以看出脾臟出現(xiàn)局灶性增生；圖7 （c）是再障組的小鼠脾臟切片，可以看出脾臟不僅出現(xiàn)局灶性增生，而且脾臟淋巴組織還出現(xiàn)萎縮。脾臟是人體最大的周圍淋巴樣器官，由紅髓和白髓兩部分構(gòu)成，發(fā)揮著造血和濾血的功能，更是重要的免疫應(yīng)答、產(chǎn)生免疫效應(yīng)分子的場所。

圖6　小鼠股骨骨髓組織切片F(xiàn)ig.6 Femoral BM histological evaluation

圖7　小鼠脾臟組織切片F(xiàn)ig.7 Spleen histological evaluation of each group

由組織切片檢查結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，通過干預(yù)rhBMP-2治療，能夠緩解再障小鼠的骨髓抑制造血損傷和改善脾臟功能。

4　分析與討論

距Ehrlich［8］1888年首次報(bào)道再障已有100多年的歷史，目前的研究表明再障的發(fā)病機(jī)制涉及造血微環(huán)境異常、造血干/祖細(xì)胞缺陷和免疫功能紊亂［9］，同時AA的發(fā)生、發(fā)展與T細(xì)胞功能亢進(jìn)引起的造血組織損傷也密切相關(guān)［10］。目前對再障病因的研究主要集中在關(guān)于造血干細(xì)胞和造血微環(huán)境兩方面［11］。

再障治療一直是血液系統(tǒng)疾病中的難題。SAA的標(biāo)準(zhǔn)療法為有移植治療和聯(lián)合免疫抑制治療，首選與人類白細(xì)胞抗原（HLA）相合的同胞供體進(jìn)行同種異體骨髓移植或造血干細(xì)胞移植。其中，造血干細(xì)胞移植仍是目前兒童和青年重型再生障礙性貧血的一線治療選擇，但存在供體來源有限、費(fèi)用高等突出問題，且有約5%～15%的患者因?yàn)槁砸浦参锟顾拗鞑《绊懐熜Ш蜕钯|(zhì)量。當(dāng)SAA患者無合適供體或者自身不適合移植時主要采用聯(lián)合抗人胸腺細(xì)胞免疫球蛋白（ATG/ALG）和環(huán)孢菌素A（Cs A）的免疫抑制治療（IST）［1，12-13］。聯(lián)合IST的強(qiáng)化治療一方面能提高療效，同時可減輕大劑量單一藥物的毒副作用［12］。王方方等［14］研究了使用國產(chǎn)豬抗人淋巴細(xì)胞免疫球蛋白（p-ALG）聯(lián)合Cs A治療SAA的療效，結(jié)果表明此方法作為初診SAA的首次治療方案，在治療期間予以成分輸血、干預(yù)細(xì)胞因子G-CSF、IL-11及抗感染等輔助支持治療手段，療效顯著，且治療費(fèi)用較馬或兔抗胸腺免疫球蛋白（ATG）聯(lián)合Cs A的方案更為經(jīng)濟(jì)。此外，成分輸血、干預(yù)雄性激素、細(xì)胞因子以及抗感染治療等作為輔助支持治療手段對再障的治療也發(fā)揮著重要的作用，近年來在強(qiáng)化免疫抑制方案基礎(chǔ)上加用造血細(xì)胞生長因子［HGFs，包括粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）或粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）和紅細(xì)胞生成素（EPO）］治療SAA 28例，有效率達(dá)到85.7%［15］?？梢娔壳暗闹委煼桨敢詮?qiáng)化免疫并輔以細(xì)胞因子或其他手段的聯(lián)合作用為主。但臨床研究表明，大多數(shù)集落細(xì)胞因子使用后伴隨發(fā)熱、惡心、低血壓、水腫、胸痛、骨痛等不良反應(yīng)。目前尚未研發(fā)出安全有效并可長期應(yīng)用于治療再障的細(xì)胞生長因子［16］。

BMP-2作為TGF-β超家族成員，其在成骨領(lǐng)域的應(yīng)用已經(jīng)相當(dāng)成熟。近年來研究表明BMP對造血的發(fā)生和調(diào)控也有重要作用［17］，但鮮有將其用于再生障礙型貧血治療的報(bào)道。因此，本文對rhBMP-2在再障造血損傷修復(fù)中的作用進(jìn)行了探究。通過5-FU聯(lián)合白消安用藥建立小鼠再障造血損傷模型。治療組在建模1周后連續(xù)2周腹腔注射rh BMP-2，劑量為50μg/d。本文研究對比了rhBMP-2治療組和再障對照組在造血表征相關(guān)指標(biāo)方面的差異和變化。結(jié)果表明，治療4周后，rhBMP-2治療組WBC相比再障對照組提高了3倍，存活率提高了2倍，同時治療組骨髓單核細(xì)胞數(shù)是再障對照組的2倍，CD34＋含量是對照組的2.5倍；集落培養(yǎng)的結(jié)果也顯示rhBMP-2治療組的CFU-GM集落計(jì)數(shù)結(jié)果是對照組的1.8倍，而且集落形態(tài)更好；4周后，rhBMP-2治療組的脾系數(shù)是對照組的1.4倍，而且從脾臟的HE染色切片上可以觀察到rh BMP-2治療組的脾臟功能好于再障組。上述結(jié)果一致性地顯示，通過干預(yù)rhBMP-2治療，能夠有效地降低再障小鼠的骨髓抑制程度，同時促進(jìn)各項(xiàng)造血功能的恢復(fù)，具有促進(jìn)再障造血損傷的修復(fù)作用，因而使得小鼠的存活率提高。盡管本文結(jié)果顯示，采用rhBMP-2治療的結(jié)果與正常水平仍存在差異，但在再障的治療方案中，仍可作為一種輔助的治療手段，發(fā)揮積極的作用。下一步的工作將更細(xì)致地研究BMP-2的不同劑量、給藥方式等對于再障模型的治療效果，以及與其他治療手段的輔助作用。

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Promoting Effects of rhBMP-2 on Aplastic Anemia Mice Bone Marrow Hematopoietic Recovery

GAO Qiao-yan， WANG Jing， XING Wan-li， DAI Kai， LIU Chang-sheng
（Engineering Research Center of Medical Biomaterials，Ministry of Education，School of Materials Science and Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai，200237，China）

Aiming to explore the promoting effects of rh BMP-2 on aplastic anemia mice bone marrow hematopoietic recovery，we built the hematopoietic injury model by 5-FU and busulfan with the interventional treatment of rhBMP-2.We analysed the number of mice peripheral white blood cells，bone marrow mononuclear cells，BM CD34＋cells，weight index，survival rate，spleen coefficient，CFU-GM colony as well as the HE sections of femur and spleen tissue.The results showed that rh BMP-2 can improve the index of peripheral white blood cell amount，mice survival rates，CFU-GM colony number，the bone marrow mononuclear cells number and CD34＋cells ratio；rh BMP-2 can also improve the function of the spleen and reduce bone marrow suppression compared with the AA control group.All results above confirmed that rh BMP-2 can effectively promote the restoration of hematopoietic injury in aplastic anemia mice.

human bone morphogenetic protein-2（rhBMP-2）；aplastic anemia；hematopoietic damage repair

R318.08

A

1006-3080（2016）01-0042-06 DOI：10.14135/j.cnki.1006-3080.2016.01.007

2015-05-14

納米研究重大科學(xué)研究計(jì)劃（2012CB933600）

高巧艷（1989-），女，陜西延安人，碩士生，主要從事rhBMP-2與造血相關(guān)的研究。E-mail：roxygao@163.com

劉昌勝，E-mail：liucs@ecust.edu.cn