蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白通路在七氟醚后處理保護(hù)心肌缺血再灌注中的作用

張靜，余鵬，袁林輝，陳勇，朱曉紅，張列亮，周斌，周志東

蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白通路在七氟醚后處理保護(hù)心肌缺血再灌注中的作用

張靜，余鵬，袁林輝，陳勇，朱曉紅，張列亮，周斌，周志東

目的：探討七氟醚后處理對(duì)離體大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及蛋白激酶B（AKT）/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路在其中的作用。

方法：取Langendorff離體灌注模型成功的大鼠心臟84個(gè)，隨機(jī)分為7組（n=12）：假手術(shù)組（Sham組）、缺血再灌注組（I/R組）、七氟醚后處理組（SPC組）、NVP-BEZ235溶劑二甲基亞砜組（DMSO組）、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/mTOR雙重抑制劑NVP-BEZ235組（BEZ組）、NVP-BEZ235+七氟醚后處理組（BEZ+SPC組）和單純七氟醚給藥組（SEVO組）。除Sham組和SEVO組，其余各組缺血30 min，再灌注 120 min。SPC組、DMSO組和BEZ組分別于缺血末至再灌注初15 min給予經(jīng)2.4%七氟醚、DMSO（＜ 0.2%）和NVP-BEZ235（20 μmol/L）飽和的K-H液灌注，隨后更換為正常K-H液再灌注105 min。BEZ+SPC組于缺血末至再灌注初15 min給予經(jīng)2.4%七氟醚和NVP-BEZ235（20 μmol/L）飽和的K-H液灌注。再灌注末觀察各組心肌梗死范圍，心肌組織病理學(xué)變化，檢測(cè)蛋白［磷酸化AKT（phospho-AKT）/總的AKT（total-AKT）、磷酸化mTOR（phospho-mTOR）/總的mTOR（total-mTOR）、自噬相關(guān)基因6（Beclin1）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）相關(guān)X蛋白（Bax）/Bcl-2和活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved Caspase-3）］ 表達(dá)水平。

結(jié)果：與I/R組比較，SPC組心肌梗死范圍減少［（26.28±4.00）% vs（ 49.22±3.66）%］，心肌病理?yè)p傷減輕，phospho-AKT/total-AKT和phospho-mTOR/total-mTOR表達(dá)分別上調(diào)79.85%和67.02%，Beclin1、Bax/Bcl-2和cleaved Caspase-3表達(dá)分別下調(diào)33.77%、69.26%和48.84%（P 均＜ 0.05）；與SPC組比較，BEZ+SPC組心肌梗死范圍增加［（53.85±4.06）% vs（ 26.28±4.00）%］，心肌病理?yè)p傷加重，phospho-AKT/total-AKT和phospho-mTOR/total-mTOR表達(dá)分別下調(diào)46.06%和42.95%，Beclin1、Bax/Bcl-2和cleaved Caspase-3表達(dá)分別上調(diào)29.90%、206.85%和114.65%（ P 均＜ 0.05）。

結(jié)論：七氟醚后處理可通過(guò)激活A(yù)KT/mTOR通路，抑制心肌細(xì)胞自噬和凋亡，從而減輕離體大鼠心肌缺血再灌注損傷。

心肌缺血再灌注損傷；雷帕霉素靶蛋白；七氟醚

Abstract

Objective: To investigate the effect of sevoflurane （SEVO） post-conditioning on protein kinase B （AKT）/mammalian target of rapamycin （mTOR） pathway for protecting ischemia/reperfusion （I/R） injury in isolated rat’s heart.

Methods: A total of 84 isolated rat’s heart prepared by Langendorff method were randomly divided into 7 groups and n=12 in each group.①Sham group， ②I/R group， ③SEVO post- conditioning （SPC） group， ④NVP-BEZ235 solvent dimenthyl sulfoxide（DMSO） group，⑤Phosphatidyl inositol 3-kinase （PI3K）/mTOR dual inhibitor NVP-BEZ235 （BEZ） group， ⑥BEZ+SPC group and ⑦SEVO alone group. The hearts received 30 min ischemia followed by 120 min reperfusion with relevant treatment except for Sham group and SEVO group in which the hearts were without ischemia process. Myocardial infarct （MI） size and tissue pathological changes were observed， protein expressions of phosphor-AKT （P-AKT）/total-AKT， P-mTOR/total-mTOR， Beclin1， Bax/Bcl-2 andcleaved Caspase-3 were examined at the end of reperfusion respectively.

Results: Compared with I/R group， SPC group presented decreased MI size （26.28±4.00） % vs （49.22±3.66） % and reduced tissue pathological changes； up-regulated protein expressions of P-AKT/total-AKT and P-mTOR/total-mTOR by 79.85% and 67.02%， while down-regulated protein expressions of Beclin1， Bax/Bcl-2 and cleaved Caspase-3 by 33.77%， 69.26% and 48.84% respectively， all P＜0.05. Compared with SPC group， BEZ+SPC group sowed increased MI size （53.85±4.06） % vs （26.28±4.00） % and elevated tissue pathological changes； down-regulated proteins expressions of P-AKT/total-AKT and P-mTOR/total-mTOR by 46.06% and 42.95%， while up-regulated protein expressions of Beclin1， Bax/Bcl-2 and cleaved Caspase-3 by 29.90%， 206.85% and 114.65% respectively， all P＜0.05.

Conclusion: SPC may activate AKT/mTOR pathway and inhibit cardiomyocyte autophagy and apoptosis， thereby attenuate I/R injury in isolated rats’ heart.

（Chinese Circulation Journal， 2016，31: 896.）

心肌缺血后處理是一種內(nèi)源性心臟保護(hù)機(jī)制，即在心肌缺血再灌注（I/R）開(kāi)始后立即給予多次短暫的停灌和復(fù)灌處理，可以明顯減少心肌梗死面積，改善心肌收縮功能，產(chǎn)生心肌保護(hù)作用［1］。同缺血后處理一樣，七氟醚后處理同樣對(duì)心肌I/R損傷具有保護(hù)作用［2］。七氟醚后處理可以通過(guò)減少心肌細(xì)胞自噬和凋亡，抑制心肌I/R損傷［3，4］。蛋白激酶B（AKT）/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路與細(xì)胞自噬、凋亡的發(fā)生密切相關(guān)［5］。已有研究表明，AKT/mTOR信號(hào)通路參與缺血后處理的保護(hù)作用機(jī)制［6］，但是，AKT/mTOR信號(hào)通路是否通過(guò)抑制心肌細(xì)胞自噬和凋亡，參與七氟醚后處理的心肌保護(hù)作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討。本研究于2015-01至2015-06擬在Langendorff離體心肌I/R模型下，給予磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/mTOR雙重抑制劑NVP-BEZ235，探討AKT/mTOR通路在七氟醚后處理保護(hù)離體大鼠心肌I/R中的作用，為心肌I/R損傷的臨床治療提供基礎(chǔ)研究資料。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物選擇及分組

雄性SD大鼠，體重220～270 g，清潔級(jí)，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。取Langendorff離體模型制備成功的心臟84個(gè)，分為7組（n=12）。假手術(shù)組（Sham組）：持續(xù)灌注3 h；I/R組：平衡30 min，缺血30 min，再灌注2 h；七氟醚后處理組（SPC組）：于缺血末到再灌注開(kāi)始后15 min給予經(jīng)2.4%七氟醚［37 ℃時(shí)為1.0最低肺泡有效濃度（MAC）］飽和的K-H液灌注［用95% O2-5% CO2混合氣體通過(guò)裝有七氟醚（批號(hào)：H20130614，Maruishi Pharmaceutical公司，日本）的專(zhuān)用揮發(fā)灌，將七氟醚以不間斷鼓泡的形式通入已經(jīng)配好的K-H液，期間檢測(cè)K-H液的七氟醚濃度，以保證進(jìn)入主動(dòng)脈的K-H液的七氟醚濃度維持在1.0 MAC］［7］；NVP-BEZ235溶劑二甲基亞砜組（DMSO組）：于缺血末至再灌注初15 min給予經(jīng)DMSO（＜ 0.2%，批號(hào)：sc-364200，Santa Cruz公司，美國(guó)）飽和的K-H液；PI3K/mTOR雙重抑制劑NVP-BEZ235組（BEZ組）：于缺血末至再灌注初15 min給予經(jīng)20 μmol/L NVP-BEZ235飽和的K-H液；NVP-BEZ235 +七氟醚后處理組（BEZ+SPC組）：于缺血末至再灌注初15 min給予經(jīng)1.0 MAC七氟醚和20 μmol/L NVP-BEZ235飽和的K-H液；單純七氟醚給藥組（SEVO組）：持續(xù)灌注180 min，并于灌注60 min至75 min期間給予經(jīng)1.0 MAC七氟醚飽和的K-H液灌注15 min。

1.2Langendorff離體心肌缺血再灌注模型

K-H液的配制［8］（mmol/L）：NaCl 118.0、KCl 4.8、KH2PO41.2、NaHCO325.0、MgSO41.2、CaCl22.5和葡萄糖11.0。調(diào)pH值至7.35～7.45，加熱至37.0 ℃，并預(yù)先通入95% O2-5% CO2的混合氣體30 min使氣體充分與K-H液混合，循環(huán)溫度為37 ℃。大鼠腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉及500 U/kg肝素化后，制備離體心肌I/R模型。開(kāi)胸取心臟，迅速將心臟置于4 ℃ K-H液中冷卻至停跳，主動(dòng)脈插管以K-H液行恒速灌流。將心臟用5-0的絲線固定，灌注通路的開(kāi)關(guān)控制冠脈缺血和再灌注，調(diào)節(jié)左心室舒張末壓（LVEDP）基礎(chǔ)值維持在6～10 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。于左心耳處剪一小口，將帶有套囊的壓力換能器插至左心室，連接U/4C501H Med Lab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)，采用Med Lab 6.0軟件連續(xù)監(jiān)測(cè)缺血前即刻（T0）與缺血再灌注30 min T1）、60 min（T2）、90 min（T3）、120 min（T4）各時(shí)間點(diǎn)的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，包括：心率（HR）、左心室峰壓（LVSP）和LVEDP。

1.3心肌梗死范圍

再灌注末，隨機(jī)選擇Langendorff模型制備成功的心臟。用心臟切割器橫斷分割成5塊2 mm厚的組織，置于1% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，批號(hào)：sc-206516，Santa Cruz公司，美國(guó)）染色，染色過(guò)程中不斷震蕩使之染色均勻。于避光恒溫下孵育20 min，PBS緩沖液沖洗后10%福爾馬林固定24 h。梗死區(qū)被染為灰白色，非梗死區(qū)染為磚紅色。用Alpha View凝膠圖像軟件分析心肌梗死范圍梗死心肌面積/總心肌面積×100%）。

1.4心肌組織病理

再灌注末，迅速取下心臟，剪除左右心耳及殘余大血管，放入10%多聚甲醛固定，制作石蠟切片，切片厚度5～6 μm，常規(guī)蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察心肌組織病理學(xué)變化，放大倍數(shù)為200倍。

1.5蛋白的提取

再灌注末迅速取下Langendorff模型制備成功的心臟，將左心室心肌組織剪碎，加入冰冷的蔗糖緩沖液勻漿，800 g離心10 min后取上清液10 000 g離心15 min，得到心肌細(xì)胞胞漿。在心肌組織樣品中加入裂解液提取胞漿蛋白。用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)：P0012S，碧云天試劑公司）測(cè)定蛋白含量，并用裂解液將其調(diào)至相同濃度值，整個(gè)操作過(guò)程均于4 ℃下進(jìn)行。

1.6蛋白免疫印跡（Western blot）法測(cè)定蛋白表達(dá)

從每個(gè)細(xì)胞質(zhì)蛋白樣品取30 μg，預(yù)熱。電泳蛋白提取物，在氨基丁三醇-甘氨酸10%聚丙烯酰胺分離膠（BIO-RAD公司，美國(guó)）分離蛋白，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜（Millipore公司，美國(guó)），5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入一抗phospho-AKT（1:1000，批號(hào)：sc-33437，Santa Cruz公司，美國(guó)）、一抗total-AKT（1:1000，批號(hào)：sc-8312，Santa Cruz公司，美國(guó)）、一抗phosphomTOR（1:1000，批號(hào)：sc-101738，Santa Cruz公司，美國(guó)）、一抗total-mTOR（1:1000，批號(hào)：sc-8319，Santa Cruz公司，美國(guó)）、一抗自噬相關(guān)基因6 （Beclin1，1:1000，批號(hào)：3495，Cell Signaling公司，美國(guó)）、一抗B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）相關(guān)X蛋白（Bax， 1:1000，批號(hào)：sc-6236，Santa Cruz公司，美國(guó)）、一抗Bcl-2（1:1000，批號(hào)：sc-492，Santa Cruz公司，美國(guó)）、一抗活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved Caspase-3，1:1000， 批 號(hào)：sc-22171-R，Santa Cruz公司，美國(guó)）和內(nèi)參抗-甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，1:2000，批號(hào)：sc-25778，Santa Cruz公司，美國(guó)），4℃一抗孵育過(guò)夜。洗滌緩沖液漂洗3遍，加入二抗后搖床孵育2 h。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號(hào)：34077，Thermo公司，美國(guó)） 顯色，行增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，將聚偏氟乙烯膜置于發(fā)光液（免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑AB液，批號(hào)：0609025，Merck公司，德國(guó)）中，于暗室中曝光后自動(dòng)洗片機(jī)顯影，定影。采用Image J軟件測(cè)定條帶灰度值，以目的條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值反映 phospho-AKT/total-AKT、phospho-mTOR/totalmTOR、Beclin1、Bax/Bcl-2和cleaved Caspase-3表達(dá)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)（表1）

7組T0時(shí)各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與T0比較，除Sham組和SEVO組外，其它各組T1～T4時(shí)LVSP、HR降低，LVEDP升高（P均＜ 0.05）；在T1～T4四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，與Sham組和SEVO組比較，其它各組LVSP、HR降低，LVEDP升高（P均＜ 0.05）；與I/R組 比 較，SPC組、SEVO組LVSP、HR升高，LVEDP降低（P＜0.05）；與SPC組比較，DMSO組、BEZ組、BEZ+SPC組、SEVO組LVSP、HR、LVEDP差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

2.2心肌梗死范圍

與I/R組（49.22±3.66）%比較，SPC組（26.28±4.00）%心肌梗死范圍減少（P＜0.05）；與SPC組比較，BEZ+SPC組（53.85±4.06）%心肌梗死范圍增大（P＜0.05）；Sham組（10.87±3.51）%和SEVO組（9.51±3.61）%組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；I/R組、DMSO組（55.38±4.69）%、BEZ組（52.30±3.60）%、BEZ+SPC組，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1　各組大鼠心肌缺血再灌注期間的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)

表1　各組大鼠心肌缺血再灌注期間的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)

注：Sham組：假手術(shù)組；I/R組：?jiǎn)渭內(nèi)毖俟嘧⒔M；SPC組：七氟醚后處理組；DMSO組：二甲基亞砜組；BEZ組：NVP-BEZ235組；BEZ+SPC組：BEZ235+七氟醚后處理組；SEVO組：?jiǎn)渭兤叻呀o藥組；T0：缺血前即刻；T1：缺血再灌注30 min；T2：缺血再灌注60 min；T3：缺血再灌注90 min；T4：缺血再灌注120 min。與T0比較aP＜0.05；與Sham組比較bP＜0.05；與I/R組比較cP＜ 0.05；與SPC組比較dP＜0.05；與SEVO組比較eP＜0.05。1 mmHg=0.133 kPa

項(xiàng)目　T0　T1　T2　T3　T4心率（bpm）Sham組　297±20　271±44　316±23　282±24　308±35 I/R組　302±26　213±36abe　226±15abe　184±25abe　158±35abeSPC組　313±10　247±10abce　251±20abce　227±35abce　216±47abceDMSO組　327±30　223±21abde　211±24abde　162±11abde　137±30abdeBEZ組　302±14　218±13abde　208±21abde　184±38abde　130±29abdeBEZ+SPC組　263±51　212±23abde　206±18abde　166±25abde　151±20abdeSEVO組　308±40　301±21cd　308±52cd　303±18cd　305±19cd左心室峰壓（mmHg）Sham組　116±8　111±6　110±5　108±6　108±7 I/R組　108±12　93±10abe　65±16abe　54±7abe　44±9abeSPC組　113±1　103±5abce　89±16abce　74±20abce　55±6abceDMSO組　116±8　88±3abde　58±7abde　53±6abde　43±7abcdeBEZ組　110±5　85±25abde　56±10abde　50±15abde　35±14abdeBEZ+SPC組　112±11　77±12abde　60±6abde　49±2abde　36±8abdeSEVO組　104±21　105±14cd　101±11cd　106±7cd　109±10cd左心室舒張末壓（mmHg）Sham組　6.7±0.4　7.1±0.9　8.2±1.6　7.7±0.6　8.0±0.7 I/R組　8.0±1.2　24.3±5.0abe　39.7±10abe　49.8±6.0abe　68.7±6.6abeSPC組　7.2±0.6　15.3±7.0abce　28.1±5.4abce41.6±3.7abce　48.9 ±7.0abceDMSO組　7.3±0.5　26.6±8.4abde　44.7±6.9abde48.2±4.5abde　61.3±6.7abdeBEZ組　6.9±0.9　27.2±7.3abde　38.8±6.4abde58.3±8.9abde　60.5±9.0abdeBEZ+SPC組　6.8±0.8　31.6±7.2abde　49.7±7.2abde52.9±5.2abde　69.2±6.4abdeSEVO組　7.1±3.5　6.0±2.0cd　7.4±1.1cd　7.8±1.4cd　8.5±1.4cd

2.3心肌組織病理學(xué)改變（圖1）

在光鏡下觀察各組心肌組織病理學(xué)變化，Sham組和SEVO組左心室心肌組織為正常的組織學(xué)形態(tài)，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、排列整齊清晰。I/R組、DMSO組、BEZ組和BEZ+SPC組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，邊界不清，排列紊亂，胞內(nèi)明顯水腫，胞質(zhì)中存在一定空泡，胞核大并畸形，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較Sham組明顯增多。SPC組心肌細(xì)胞輪廓完整，排列略松散，胞質(zhì)輕度水腫，少量胞核聚集，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較I/R組明顯減少（放大倍數(shù)為200倍）。

2.4phospho-AKT/total-AKT和phospho-mTOR/total-mTOR蛋白的表達(dá)

與Sham組比較，I/R組phospho-AKT/total-AKT和 phospho-mTOR/ total-mTOR蛋 白 表 達(dá) 輕 度 上 調(diào)（P＜ 0.05）；與I/R組比較，SPC組phospho-AKT/total-AKT和 phosphomTOR/total-mTOR蛋白表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)（P＜ 0.05）；與SPC組比較，BEZ +SPC組 phospho-AKT/total-AKT和 phospho-mTOR/total-mTOR蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜ 0.05）。詳見(jiàn)圖2。

圖1　 再灌注末各組大鼠心肌組織病理改變

圖2　 蛋白免疫印跡分析各組大鼠心肌AKT和mTOR蛋白的磷酸水平

2.5 Beclin1、Bax/Bcl-2和cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)

與Sham組比較，I/R組Beclin1、Bax/Bcl-2和cleaved Caspase-3表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；與I/R組比較，SPC組Beclin1、Bax/Bcl-2和cleaved Caspase-3表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）；與SPC組比較，BEZ+SPC組Beclin1、Bax/Bcl-2和cleaved Caspase-3表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖3。

圖3　 Western blot分析各組大鼠心肌Beclin1，Bax/Bcl2和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平

3　討論

本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)［9］中的方法建立Langendorff離體灌注模型。結(jié)果提示離體I/R模型制備成功。并參照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)施七氟醚后處理和給予NVP-BEZ235，于缺血末至再灌注初15 min分別給予1.0 MAC七氟醚或20 μmol/L NVP-BEZ235。

在本實(shí)驗(yàn)中，于再灌注末觀察Langendorff模型制備成功的各組離體大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)和心肌梗死范圍，發(fā)現(xiàn)SPC組較I/R組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)明顯改善，心肌梗死范圍降低，但給予PI3K/mTOR通路的雙重抑制劑NVP-BEZ235后，BEZ+SPC組較SPC組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)明顯惡化，并且心肌梗死范圍也升高。已有研究表明，心肌收縮功能與心肌組織病理學(xué)變化密切相關(guān)［10］，本研究利用HE染色觀察心肌組織病理學(xué)變化，同樣證明七氟醚后處理能夠減少離體大鼠I/R損傷的心肌組織病理學(xué)損傷，減輕心肌胞質(zhì)水腫，降低炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量。但給予NVP-BEZ235后，心肌組織病理學(xué)損傷明顯加重，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增加。說(shuō)明七氟醚后處理能夠改善離體大鼠I/R損傷的心肌收縮和舒張功能，減少心肌梗死，抑制心肌組織病理學(xué)損傷，發(fā)揮其心肌保護(hù)作用。但是這種保護(hù)作用能夠被NVPBEZ235所取消。

NVP-BEZ235，是一種咪唑喹啉衍生物，可通過(guò)與ATP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，抑制AKT和mTOR的催化活性，是廣泛使用的PI3K/mTOR通路雙重抑制劑。研究證明七氟醚后處理通過(guò)PI3K通路發(fā)揮其對(duì)大鼠心肌I/R損傷的保護(hù)作用［11］。PI3K根據(jù)其結(jié)構(gòu)及磷酸化底物的特異性可分為I、II和III三種，其中，I型PI3K能催化磷脂酰肌醇二磷酸磷酸化而生成磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3），PIP3與AKT的氨基端結(jié)合激活A(yù)KT，活化的AKT進(jìn)一步激活其下游因子mTOR，參與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞自噬和凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明七氟醚后處理能夠明顯上調(diào)phospho-AKT/total-AKT和phospho-mTOR/total-mTOR的 蛋白表達(dá)，NVP-BEZ235抑制PI3K/mTOR通路，下調(diào) phospho-AKT/total-AKT和 phospho-mTOR/totalmTOR的蛋白表達(dá)，取消七氟醚后處理的心肌保護(hù)作用。這說(shuō)明七氟醚后處理通過(guò)激活mTOR通路發(fā)揮其心肌保護(hù)作用。

研究表明，mTOR通路的激活能夠抑制細(xì)胞自噬和凋亡發(fā)生，參與心肌I/R損傷的保護(hù)作用［12，13］。細(xì)胞自噬是一種高度進(jìn)化的降解細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)和細(xì)胞器的生理現(xiàn)象，當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)下，如缺血再灌注等情況下自噬的水平明顯上調(diào)，細(xì)胞啟動(dòng)自噬機(jī)制來(lái)清除受損細(xì)胞器，減少心肌細(xì)胞損傷［14］。Beclin1是參與自噬體形成的重要限速基因，參與自噬的調(diào)控并促進(jìn)自噬體形成，其表達(dá)強(qiáng)度與自噬活性密切相關(guān)［15］。細(xì)胞凋亡，是在正常生理或病理狀態(tài)下發(fā)生的，由一系列酶參與、多種基因調(diào)控的活體內(nèi)單個(gè)細(xì)胞主動(dòng)程序性死亡過(guò)程，心肌I/R損傷中細(xì)胞死亡的主要方式［16，17］。Bcl-2基因是最早發(fā)現(xiàn)的抗凋亡基因，可增加細(xì)胞對(duì)多種凋亡刺激因素的抵抗力，顯著延長(zhǎng)細(xì)胞的壽命，抑制其凋亡發(fā)生。Bax可以拮抗Bcl-2基因的抗凋亡作用，本身還具有直接促進(jìn)凋亡的能力。兩基因通過(guò)構(gòu)成二聚體的形式來(lái)調(diào)控細(xì)胞凋亡進(jìn)程，Bax/Bcl-2蛋白比值高時(shí)，同源二聚體形成較多，可以明顯的促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Bax/Bcl-2蛋白比值低時(shí)，異源二聚體形成較多，可以明顯的抑制細(xì)胞凋亡。七氟醚后處理減輕心肌I/ R損傷時(shí)，降低Bax/Bcl-2比值能夠減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。凋亡是一個(gè)由Caspase家族成員介導(dǎo)的蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程，cleaved Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)重要蛋白質(zhì)降解失活及DNA斷裂。本實(shí)驗(yàn)采用Western Blot法測(cè)定再灌注末各組Beclin1、Bax/Bcl-2和cleaved Caspase-3的蛋白表達(dá)。研究結(jié)果證明七氟醚后處理能夠抑制自噬和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，但給予PI3K/ mTOR通路雙重抑制劑后心肌自噬和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)，這說(shuō)明七氟醚后處理通過(guò)激活mTOR通路下調(diào)自噬和凋亡相關(guān)蛋白，抑制心肌細(xì)胞自噬和凋亡。

綜上所述，七氟醚后處理可能通過(guò)激活mTOR通路，減少心肌梗死范圍，改善心肌組織病理學(xué)損傷，抑制自噬和凋亡相關(guān)蛋白的上調(diào)，進(jìn)而發(fā)揮其對(duì)離體大鼠心肌I/R損傷的保護(hù)作用。

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Effect of Sevoflurane Post-conditioning on AKT/mTOR Pathway for Protecting Cardiac Ischemia/reperfusion Injury in Isolated Rat’s Heart

ZHANG Jing， YU Peng， YUAN Lin-hui， CHEN Yong， ZHU Xiao-hong， ZHANG Lie-liang， ZHOU Bin， ZHOU Zhi-dong.
Department of Anesthesiology， Second Affiliated Hospital of Nanchang University， Nanchang （330000）， Jiangxi， China
Corresponding Author: ZHOU Zhi-dong， Email: dongdongzhi@163.com

Myocardial ischemia reperfusion injury； Target protein of rapamycin； Sevoflurane

2015-10-25）

（編輯：常文靜）

330000 江西省南昌市，南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 麻醉科（張靜、袁林輝、陳勇、朱曉紅、張列亮、周斌、周志東），心內(nèi)科（余鵬）

張靜 住院醫(yī)師 碩士 研究方向：心肌缺血再灌注損傷 Email：zhangjing_jxndefy@163.com 通訊作者：周志東 Email：dongdongzhi@163.com

R54

A

1000-3614（2016）09-0896-06 doi：10.3969/j.issn.1000-3614.2016.09.017