撕裂蠟孔菌的發(fā)酵優(yōu)化及其開放式發(fā)酵

邵國兵，楊萍，姜文俠

（1.天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過程工程重點實驗室，中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所，天津300308；2.天津科技大學生物工程學院，天津300457）

撕裂蠟孔菌的發(fā)酵優(yōu)化及其開放式發(fā)酵

邵國兵1，2，楊萍1，*，姜文俠1，*

（1.天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過程工程重點實驗室，中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所，天津300308；2.天津科技大學生物工程學院，天津300457）

以生物量為指標對撕裂蠟孔菌TIB.BPE.11002的液體發(fā)酵進行了優(yōu)化。優(yōu)化后的液體培養(yǎng)基配方為：玉米淀粉60 g/L、玉米漿干粉8 g/L、KH2PO45 g/L、α-淀粉酶733 U/L，pH自然。優(yōu)化后的搖瓶培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度25℃，接種量5%，500 mL三角瓶裝液量150 mL，轉速150 r/min。優(yōu)化后的生物量達7 g/L以上。進一步探索發(fā)現(xiàn)，該菌株具有在非無菌環(huán)境中大量生長的能力，可以進行開放式發(fā)酵。

撕裂蠟孔菌；發(fā)酵優(yōu)化；開放式發(fā)酵

撕裂蠟孔菌（Ceriporia lacerata）是一種白腐真菌，日本［1］、韓國［2］和我國華北、華中、華東及四川的天然林和人工林內均有分布［3-4］。撕裂蠟孔菌在工業(yè)廢水處理［5-7］、醫(yī)藥和保健食品［8-15］等領域都有一定的應用前景，目前國內外對該菌的研究還較少。韓國Kim Byoung-Cheon等［9-11］研究發(fā)現(xiàn)撕裂蠟孔菌發(fā)酵液的粗提物具有降血糖作用，能明顯抑制a-淀粉酶和a-葡萄糖苷酶的活性，含有保護胰島素分泌細胞不受損傷的藥理成分，可有效預防和緩解糖尿病，有可能成為糖尿病的治療藥物和保健功能食品。高冬［12］公開了一株撕裂蠟孔菌，該菌具有營養(yǎng)豐富、食藥兼用的特點，用于治療貧血、心臟病、肺癌和白血病等。此外，還有通過撕裂蠟孔菌的發(fā)酵制備2′，4′-二羥基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查耳酮［8］、石杉堿甲［13］及其衍生物［14］、甘露糖赤蘚糖醇脂［15］等功效成分的中國專利公開。

對撕裂蠟孔菌TIB.BPE.11002的液體培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，進而探索了該菌的開放式發(fā)酵，為撕裂蠟孔菌的進一步研究開發(fā)提供參考。

1材料與方法

1.1菌種

撕裂蠟孔菌（Ceriporia lacerate）TIB.BPE.11002：保藏于中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所。

1.2主要試劑和儀器

玉米淀粉：天津中英保健食品有限公司；玉米漿干粉：山東盛泰生物科技有限公司；KH2PO4（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；中溫α-淀粉酶（3 700 U/g）：北京索萊寶科技有限公司。恒溫振蕩器（IS-RDS3型）：美國精騏有限公司；電子天平（PL4002型）、臺式pH計（S20K型）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；BIOSTATRD-DCU D20-3型液體發(fā)酵罐、BIOSTATRC plus C20-3型液體發(fā)酵罐、BIOSTATRD-DCUD200-3型液體發(fā)酵罐：SartoriusGroup；ZFD-5090型鼓風干燥箱：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g/L，玉米漿干粉6 g/L，KH2PO41 g/L，pH自然，121℃滅菌20 min。

搖瓶基礎培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g/L，玉米漿干粉6 g/L，KH2PO41 g/L，pH自然，121℃滅菌20 min。

1.4方法

1.4.1液體菌種的制備

挑取菌苔約3 cm2接入種子培養(yǎng)基，裝液量為150 mL/500 mL擋板三角瓶，25℃搖床150 r/min培養(yǎng)3.5 d～4 d。

1.4.2搖瓶液體發(fā)酵

將7.5 mL液體菌種接入搖瓶基礎培養(yǎng)基，裝液量為150 mL/500 mL三角瓶，25℃搖床150 r/min培養(yǎng)5 d。通過改變搖瓶基礎培養(yǎng)基中碳源、氮源和無機鹽等的添加量，以及搖瓶的培養(yǎng)溫度、接種量、裝液量、初始pH和搖床轉速等條件，以生物量為指標進行發(fā)酵優(yōu)化試驗。

1.4.3開放式發(fā)酵

1.4.3.1開放式搖瓶發(fā)酵

將液體菌種按體積比5%分別接入經(jīng)高溫滅菌和未經(jīng)任何滅菌處理的培養(yǎng)基，前者的接種無菌操作；后者則在非無菌環(huán)境下進行接種。裝液量為150 mL/ 500 mL三角瓶，25℃搖床150 r/min培養(yǎng)5 d。觀察兩種培養(yǎng)方式的培養(yǎng)基中菌絲體的生長情況，測量其生物量。

1.4.3.220L發(fā)酵罐開放式發(fā)酵

以工作體積20 L的D20-3型液體發(fā)酵罐為培養(yǎng)容器，培養(yǎng)基不經(jīng)任何滅菌處理，按體積比5%直接接入液體菌種，發(fā)酵培養(yǎng)過程中發(fā)酵罐的接種口不密閉。發(fā)酵罐接種后的裝液量為18.9 L，培養(yǎng)溫度25℃，初始通風量16 L/min，初始攪拌轉速50 r/min，溶氧控制在30%左右。開放式發(fā)酵培養(yǎng)6 d，觀察發(fā)酵液中菌絲體的生長情況，每12 h取樣1次，測量其生物量。

1.4.3.3200L發(fā)酵罐開放式發(fā)酵

以工作體積200 L的液體發(fā)酵罐為培養(yǎng)容器，培養(yǎng)基不經(jīng)任何滅菌處理，按體積比5%直接接入液體菌種，該液體菌種以工作體積20 L的C20-3型液體發(fā)酵罐通過無菌培養(yǎng)的方式制備。發(fā)酵培養(yǎng)過程中，發(fā)酵罐的頂蓋完全敞開，通入的壓縮空氣不經(jīng)過除菌過濾。發(fā)酵罐接種后的裝液量為168 L，培養(yǎng)溫度25℃，初始通風量80 L/min，初始攪拌轉速100 r/min，溶氧控制在30%左右。開放式發(fā)酵培養(yǎng)6 d，觀察發(fā)酵液中菌絲體的生長情況，每12 h取樣一次，測量其生物量。

1.4.4生物量的測量方法

發(fā)酵液經(jīng)過400目濾布過濾，水洗2次～3次，置105℃鼓風干燥箱中烘至恒重，稱量菌絲體的干重。

2結果與討論

2.1液體培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1碳源對生物量的影響

分別以不同的碳源替代搖瓶基礎培養(yǎng)基中的可溶性淀粉，搖瓶培養(yǎng)菌株TIB.BPE.11002的試驗結果見圖1。

圖1　碳源對生物量的影響Fig.1Effect of carbon sources on the biomass

以玉米粉為碳源時，生物量的測定值最高，但因玉米粉中的不溶物對測定結果的影響，其實際的生物量應低于測定值。生物量次高的是果糖，但果糖的價格較高。以玉米淀粉為碳源的僅略低于以果糖為碳源的，因此選擇玉米淀粉為碳源。

2.1.2氮源對生物量的影響

分別以不同的氮源替代搖瓶基礎培養(yǎng)基中的玉米漿干粉，搖瓶發(fā)酵菌株TIB.BPE.11002的試驗結果見圖2。

綜合考慮氮源的價格及某些不溶性氮源對生物量測定值的影響，依然以玉米漿干粉作為氮源。

2.1.3碳氮比對生物量的影響

為確定玉米漿干粉的最佳添加量，將搖瓶基礎培養(yǎng)基中的玉米淀粉添加量固定為20 g/L，通過改變玉米漿干粉的添加量來分析氮源添加量對生物量的影響結果見圖3。

圖2　氮源對生物量的影響Fig.2Effect of nitrogen sources on the biomass

圖3　氮源添加量對生物量的影響Fig.3Effect of the additive amount of nitrogen source on the biomass

試驗結果（圖3）表明，玉米漿干粉添加量在8 g/L時生物量最高，因此將玉米漿干粉的添加量定為8g/L。

為確定玉米淀粉的最佳添加量，將搖瓶基礎培養(yǎng)基中的玉米漿干粉添加量固定為8 g/L，通過改變玉米淀粉的添加量來確定其最佳添加量結果見圖4。

圖4　碳源添加量對生物量的影響Fig.4Effect of the additive amount of carbon source on the biomass

試驗結果（圖4）表明，玉米淀粉添加量為80 g/L時，菌株TIB.BPE.11002的生物量達到最高。綜合分析誤差范圍及成本因素的影響，選擇玉米淀粉的添加量為60 g/L。

2.2搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化

用上述優(yōu)化后的培養(yǎng)基，優(yōu)化菌株TIB.BPE.11002的搖瓶發(fā)酵條件。

2.2.1溫度對發(fā)酵的影響

在不同的溫度搖瓶發(fā)酵菌株TIB.BPE.11002，試驗結果見圖5。

圖5　溫度對生物量的影響Fig.5Effect of temperature on the biomass

在15℃～33℃時，生物量較高，而低于15℃和高于33℃時生物量都明顯地降低，表明該菌發(fā)酵的適宜溫度范圍較寬。綜合考慮，選擇25℃作為該菌株液體發(fā)酵的溫度。

2.2.2接種量對發(fā)酵的影響

分別以2%、5%、8%、10%和12%的接種量培養(yǎng)菌株TIB.BPE.11002，試驗結果見圖6。

圖6　接種量對生物量的影響Fig.6Effect of inoculation amount on the biomass

接種量對菌株TIB.BPE.11002生物量的影響較小，2%～12%接種量發(fā)酵的生物量相差不大。綜合考慮，選用5%作為該菌株液體發(fā)酵的接種量。

2.2.3裝液量對發(fā)酵的影響

分別采用不同的裝液量來培養(yǎng)菌株TIB.BPE. 11002，試驗結果見圖7。

裝液量越低，單位體積中的生物量越高。從經(jīng)濟角度考慮，裝液量不宜過低，因此裝液量選擇150mL/500mL三角瓶。

圖7　裝液量對生物量的影響Fig.7Effect of liquid medium volume on the biomass

2.2.4培養(yǎng)基初始pH對發(fā)酵的影響

采用鹽酸或氫氧化鈉將培養(yǎng)基的初始pH值調為2、3、4、5、6、7、8，考察培養(yǎng)基的不同初始pH值對TIB. BPE.11002生長的影響，試驗結果見圖8。

圖8　培養(yǎng)基初始pH對生物量的影響Fig.8Effect of initial pH on the biomass

培養(yǎng)基的初始pH為4時，TIB.BPE.11002的生物量最高。由于該培養(yǎng)基的自然pH為4.1，因此選擇不調整培養(yǎng)基的初始pH。

2.2.5搖床轉速對發(fā)酵的影響

分別以50、100、150、200 r/min和250 r/min的搖床轉速培養(yǎng)菌株TIB.BPE.11002，試驗結果見圖9。

圖9　搖床轉速對生物量的影響Fig.9Effect of shaking speed on the biomass

轉速在100 r/min以上時，生物量均能保持較高水平，但由于100 r/min時的數(shù)據(jù)誤差較大，而200 r/min以上時搖瓶中的菌絲聚集，易出現(xiàn)大團的菌絲體，菌團的形態(tài)發(fā)生了明顯變化，因此，搖床培養(yǎng)的轉速確定為150 r/min。

2.3無機鹽及維生素對發(fā)酵的影響

在上述優(yōu)化的基礎上，繼續(xù)優(yōu)化液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的無機鹽和維生素。

以KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2和VB1共4種物質為因素，做正交試驗，確定其對菌株TIB.BPE.11002液體發(fā)酵的影響及其添加量，各因素水平見表1。

表1　正交試驗因素水平表Table 1The table of factor and level in L9（34）orthogonal experiment

采用SPSS 19.0軟件對試驗結果進行方差分析（由于MgSO4·7H2O所在列顯著性水平ɑ＞0.25，故作為空白列），直觀分析結果表明KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2和VB1最佳添加量分別為2 g/L、0、0、0。方差分析結果見表2。

表2　方差分析結果Table 2Variance analysis of orthogonal experiment

MgSO4·7H2O、CaCl2和VB1均不是顯著因素（P＞0.05），KH2PO4是顯著因素（P＜0.05）。

對正交試驗結果進行試驗驗證的結果見圖10。

KH2PO4對生物量有一定的影響，其添加量為5 g/L時的生物量最高，達到7.6 g/L。因此，選用5 g/L作為KH2PO4的添加量。

2.4開放式發(fā)酵

圖10　KH2PO4添加量對生物量的影響Fig.10Effect of the additive amount of KH2PO4on the biomass

分別采用經(jīng)高溫滅菌處理的發(fā)酵培養(yǎng)基和未經(jīng)高溫滅菌處理的發(fā)酵培養(yǎng)基，搖瓶培養(yǎng)TIB.BPE.11002菌株，發(fā)酵5 d的搖瓶見圖11。

圖11　培養(yǎng)基經(jīng)滅菌處理的發(fā)酵（a）和培養(yǎng)基未經(jīng)任何滅菌處理的發(fā)酵（b）Fig.11Cultured in sterilized medium（a）and cultured in unsterilized medium（b）

采用未經(jīng)任何滅菌處理的培養(yǎng)基，搖瓶發(fā)酵的撕裂蠟孔菌不僅能夠生長，外觀無雜菌生長的跡象，而且菌絲團的形態(tài)、生物量及發(fā)酵液氣味與培養(yǎng)基經(jīng)過高溫滅菌的搖瓶發(fā)酵均沒有可以判別的區(qū)別。

以20 L發(fā)酵罐和200 L發(fā)酵罐開放式發(fā)酵培養(yǎng)菌株TIB.BPE.11002，生物量及發(fā)酵液pH的變化見圖12。

圖12　開放式發(fā)酵中生物量和pH的變化曲線Fig.12The changes of the biomass and pH with open fermentation

經(jīng)20 L發(fā)酵罐和200 L發(fā)酵罐的開放式發(fā)酵驗證，該菌株都能夠正常生長，外觀無雜菌生長的跡象，發(fā)酵液的氣味和無菌培養(yǎng)的相同，pH變化在4～5之間，生物量均在75 h前后達到最高，分別為6.6、8.0 g/L，與搖瓶無菌培養(yǎng)的生物量接近。

通過搖瓶和發(fā)酵罐的開放式發(fā)酵試驗表明，菌株TIB.BPE.11002可以進行完全開放式的發(fā)酵培養(yǎng)，該菌株可能產(chǎn)生某些抗菌或抑菌物質，拮抗雜菌的生長。

3結論

通過優(yōu)化液體發(fā)酵培養(yǎng)基和搖瓶培養(yǎng)條件，撕裂蠟孔菌TIB.BPE.11002搖瓶發(fā)酵的生物量達到7 g/L以上。優(yōu)化后的培養(yǎng)基為：玉米淀粉60 g/L，玉米漿干粉8 g/L，KH2PO45 g/L，α-淀粉酶733 U/L，pH自然。優(yōu)化后的搖瓶培養(yǎng)條件為：溫度25℃，接種量5%，裝液量150 mL/500 mL三角瓶，轉速150 r/min。

發(fā)現(xiàn)并試驗驗證了撕裂蠟孔菌TIB.BPE.11002可以進行常溫開放式發(fā)酵，不僅培養(yǎng)基無需滅菌，也無需無菌操作，而且通入的壓縮空氣也無需除菌過濾。如果該發(fā)酵方式用于工業(yè)生產(chǎn)，將大幅度降低投資、生產(chǎn)和管理成本。對于該菌株拮抗雜菌的機理，是否產(chǎn)生抑菌或抗菌物質，有待進一步的研究。

［1］Suhara H，Maekawa N，Kaneko S，et al.A new species，Ceriporia lacerata，isolated from white-rotted wood［J］.Mycotaxon，2003，86（41）：335-347

［2］Jang Y，Choi H E，Lim Y W，et al.The first report of Ceriporia lacerata（Phanerochaetaceae，Basidiomycota）in Korea［J］.Mycotaxon，2012，119（7）：397-403

［3］崔寶凱，魏玉蓮，戴玉成.江蘇紫金山的多孔菌［J］.菌物學報，2006，25（1）：9-14

［4］戴玉成.中國木本植物病原木材腐朽菌研究［J］.菌物學報，2012，31（4）：493-509

［5］Lin Y H，He X B，Han G M，et al.Removal of Crystal Violet from aqueous solution using powdered mycelia biomass of Ceriporia lacerata P2［J］.Joumal of Environmental Sciences，2011，23（12）：2055-2062

［6］Choi Y S，Seo J Y，Lee H，et al.Decolorization and detoxification of wastewater containing industrial dyes by Bjerkandera adusta KUC9065［J］.Water，Air，&Soil Pollution，2014，225（1）：1-10

［7］田啟建，林永慧，何興兵，等.耐高鹽撕裂蠟孔菌P2對模擬橙黃G染料廢水的脫色及廢水脫色前后的毒性測試［J］.應用與環(huán)境生物學報，2011，17（6）：876-882

［8］Wang J，Yao L Y，Lu Y H.Ceriporia lacerata DMC1106，a new endophytic fungus：isolation，identification，and optimal medium for 2'，4'-dihydroxy-6'-methoxy-3'，5'-dimethylchalcone production［J］. Biotechnology and Bioprocess Engineering，2013，18：669-678

［9］Kim J E，Kim H J，Lee S P.Hyperglycemic effect of submerged cultureextract of Ceriporia lacerata in streptozotocin-induced diabetic rats［J］．Food Science and Biotechnology，2012，21（6）：1685-1693

［10］Kim J H，Park Y K，Kim J E，et al．Crude extract of Ceriporia lacerata has a protective effect on dexamethasone-induced cytotoxicity in INS-1 cells via the modulation of PI3K/PKB activity［J］．International Journal of Molecular Medicine，2013，32：179-186

［11］Kim B C．Pharmaceutical composition for prevention or treatment of steroid-induced diabetes and health functional food：US，2014 0193455［P］．2014-07-10

［12］高冬．撕裂蠟孔菌及其用途：中國，ZL 201110433356.0［P］．2013-06-26

［13］吳水生，張方方，鄭雅媗，等．閩浙馬尾杉內生真菌及其產(chǎn)石杉堿甲的方法和應用：中國，CN 201410045031.9［P］．2014-05-28

［14］單偉光，應優(yōu)敏，占扎君．一種蛇足石杉內生真菌及其在制備8α，15α-環(huán)氧化石杉堿甲的應用：中國，ZL 201310445192.2［P］．2014-03-26

［15］陳啟和，范琳琳，董亞晨．撕裂蠟孔菌菌株及其應用：中國，CN 201410520107.9［P］．2015-01-14

Optimization of Submerged Fermentation for Mycelium of Ceriporia lacerata and Its Open Fermentation

SHAO Guo-bing1，2，YANG Ping1，*，JIANG Wen-xia1，*
（1.Tianjin Key Laboratory for Industrial Biological Systems and Bioprocessing Engineering，Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China；2.College of Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China）

Submerged fermentation of Ceriporia lacerata TIB.BPE.11002 was optimized，the optimal biomass was above 7 g/L.The optimal parameters in submerged fermentation of TIB.BPE.11002 were found as：corn starch 6 g/L，corn steep powder 8 g/L，KH2PO45 g/L，α-amylase 733 U/L，natural pH，culture temperature 25℃，inoculum ratio 5%，loading volume 150 mL/500 mL，shaking speed 150 r/min.In addition，it was discovered and verified that the mycelia of TIB.BPE.11002 could be cultured with open fermentation.

Ceriporia lacerata；optimization of fermentation；open fermentation

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.043

2015-06-11

天津市科技支撐重點項目（12ZCZDSY12900、14ZCZDSY00063）

邵國兵（1990—），男（漢），碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程。

楊萍（1978—），女（漢），高級工程師，研究方向：食品與發(fā)酵工程。姜文俠（1964—），男（漢），研究員，研究方向：發(fā)酵工程。