液質(zhì)法測定水產(chǎn)品中敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷

侯文慧

（烏蘭察布職業(yè)學院，內(nèi)蒙古烏蘭察布012000）

液質(zhì)法測定水產(chǎn)品中敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷

侯文慧

（烏蘭察布職業(yè)學院，內(nèi)蒙古烏蘭察布012000）

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷的的含量。試樣經(jīng)0.1%甲酸-乙酸乙酯超聲萃取，HC-C18固相萃取柱凈化后，UPLCBEHC18色譜柱分離，選擇離子監(jiān)測（SIM），定量離子對（m/z）：258.7/ 127.0（敵百蟲）、221.0/127.1（敵敵畏）、142.1/94.1（甲胺磷）；定性離子對（m/z）：258.7/109.0（敵百蟲）、221.0/109.1（敵敵畏）、221.0/112.0（甲胺磷）。結(jié)果表明：敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷加標回收率在90.6%～106.0%之間，相對標準偏差不大于8.8%；以信噪比RSN=3計算，方法檢出限均為1.5μg/kg，方法定量限均為5.0μg/kg。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；敵百蟲；敵敵畏；甲胺磷；水產(chǎn)品；測定

有機磷農(nóng)藥（Organophosphrous pesticides，簡稱OPPS）是含有C-P鍵或C-O-P、C-S-P、C-N-P鍵的有機化合物。作為殺蟲劑，有機磷農(nóng)藥具有廣譜、高效、量小以及作用方式多、使用方便、半衰期短等優(yōu)點，廣泛應用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥等領域。但與此同時產(chǎn)生的環(huán)境問題也引起人們的關注，而且絕大多數(shù)有機磷農(nóng)藥是劇毒的，容易對人體或動物造成急性中毒，且對肝臟、腎臟、心臟、呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)以及血液系統(tǒng)有一定毒害作用。由于在生產(chǎn)、管理及農(nóng)業(yè)中濫用有機磷農(nóng)藥，使土壤、水源受到了污染，并影響到養(yǎng)殖用地和用水，使水產(chǎn)品含有有機磷農(nóng)藥的殘留存在可能。敵百蟲作為國標漁藥廣泛應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖領域，其在堿性條件下分解成劇毒的敵敵畏，加上養(yǎng)殖用戶非法使用甲胺磷等劇毒農(nóng)藥作為殺蟲劑和消毒劑，給水產(chǎn)品中有機磷農(nóng)藥殘留帶來潛在的風險。此外，在咸魚加工過程中非法使用敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷等有機磷農(nóng)藥浸泡來進行防腐，這嚴重威脅著消費者的身體健康。

目前，國內(nèi)外對有機磷殘留的檢測方法主要是氣相或氣質(zhì)，而該方法前處理復雜、耗時長、有機溶劑消耗多，且其在進樣口襯管容易產(chǎn)生吸附，發(fā)生基質(zhì)效應導致定量結(jié)果的不準確。而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其對極性有機磷檢測時選擇性更高，其對樣品的前處理凈化要求較氣相或氣質(zhì)法相對較低，但目前國內(nèi)外關于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（簡稱：液質(zhì)）法測定水產(chǎn)品中敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷殘留的研究較少。本文以魚、蝦、咸魚等水產(chǎn)品為研究對象，探索超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷殘留量的分析方法，為水產(chǎn)品監(jiān)督部門、檢測機構(gòu)、水產(chǎn)品加工企業(yè)提供實際的應用參考。

1試驗部分

1.1儀器與試劑

超高效液相色譜儀Waters Acquity UPLC系統(tǒng)配Quattro Premier XE串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（美國沃特世公司）；XS-205型電子分析天平（賽多利斯北京有限公司）；Milli-Q型超純水器（美國Millipore公司）；HY-3型多功能振蕩器（常州國華電器公司）；0.22 μm有機微孔濾膜（天津津騰試驗設備有限公司）；固相萃取裝置（美國Supelco公司）。

敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷標準溶液（1.0 μg/mL）：分別準確稱取敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷標準品100 mg（精確至0.1 mg），用65%乙腈水溶解后定容至100 mL。

魚、蝦、咸魚：購自當?shù)剞r(nóng)貿(mào)超市。

所用試劑除特別標注外均為分析純試劑，水為超純水。

標準物質(zhì)：敵百蟲（trichlorfon，CAS：52-68-6）、敵敵畏（dichlorvos，CAS：62-73-7）、甲胺磷（methamidophos，CAS：10265-92-6），純度均≥97%，購自美國SIGMA公司；乙腈、甲醇、正己烷（色譜純，德國默克公司）；氮氣、氬氣（純度≥99.99%，河南三門峽市榮鑫氣體廠）；HC-C18固相萃取柱（500 mg/3 mL，美國安捷倫Agilent公司）。

1.2儀器工作條件

色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；柱溫為35℃；流動相A為甲醇；流動相B為0.1%甲酸水溶液；流速為0.2mL/min；梯度洗脫程序見表1。

表1　梯度洗脫程序Table 1Gradient elution program of the mobile phase

質(zhì)譜條件：電離方式，電噴霧電離，正離子模式，ESI（+）；檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）；其它質(zhì)譜條件見表2。

1.3樣品前處理

1.3.1羅非魚、對蝦等鮮活、冷凍樣品

稱取試樣5 g于50 mL離心管中，加入4.0 g無水硫酸鎂，再加入15 mL 0.1%甲酸-乙酸乙酯，振蕩提取10 min，4 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，殘渣用10 mL 0.1%甲酸-乙酸乙酯重復提取1次，離心后合并上清液并定容至刻度。準確移取上述提取液5.00 mL于離心管中，于35℃水浴氮氣吹至近干，加入2 mL 0.1%甲酸-乙腈超聲2 min后再渦旋溶解，待凈化。

1.3.2咸魚制品

稱取試樣2.5 g于50 mL離心管中，加入2.0 g無水硫酸鎂，余下步驟按1.3.1節(jié)操作“再加入15 mL 0.1%甲酸-乙酸乙酯，……，待凈化”。

1.3.3凈化

將1.3.1待凈化溶液過HC-C18固相萃取柱，待自然流干后，用0.1%甲酸-乙腈4 mL清洗上述離心管，并將清洗液依次過柱，收集全部流出液體，35℃水浴氮氣吹至近干，準確加入1.0 mL甲醇-甲酸水溶液超聲2 min后再渦旋溶解，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.4標準曲線繪制

稱取相同基質(zhì)的空白試樣6份，每份5 g，分別加入適量的標準工作溶液，制備成含敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷的濃度均為5.0、10、20、50、100、200 μg/kg的樣品，按1.3進行操作，按1.2的儀器條件濃度由低到高進樣測定，以特征離子色譜峰面積為縱坐標，敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，求回歸方程和相關系數(shù)。

2結(jié)果與討論

2.1質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別用甲醇將敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷標準儲備液稀釋成濃度均為1.0 μg/mL的單標溶液，分別以流動注射的方式在電噴霧離子源（ESI）進行正負離子掃描。首先對單一標準溶液進行全掃描觀察其準分子離子峰，再進行二次質(zhì)譜優(yōu)化時得到子離子峰。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷均在正離子模式下具有豐度較高的母離子和子離子。每種待測物選擇豐度最大的母離子及對應的兩個響應值較高得子離子為定性離子，再以其中靈敏度最高、基質(zhì)干擾小的子離子為定量離子，最終對2對特征離子對（定量離子對和定性離子對）進行多反應監(jiān)測（MRM）參數(shù)優(yōu)化，優(yōu)化的參數(shù)詳見表2。敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷的二級質(zhì)譜圖見圖1、圖2、圖3。

表2　待測物定性離子對、定量離子對、去簇電壓、碰撞能量及碰撞池出口電壓Table 2Determination of the ion pair，quantitative ion pair，the cluster voltage，and the impact of the collision energy meter

2.2UPLC色譜條件的優(yōu)化

本試驗采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1×150 mm，1.7 μm）色譜柱分析。液質(zhì)聯(lián)用所用流動相可選范圍較小，常用的為甲醇、乙腈、水及其不同比例的混合物和一些易揮發(fā)性鹽的緩沖液。本研究考察了甲醇-水溶液流動相體系與甲醇-0.1%甲酸水溶液流動相體系對待測物峰形和靈敏度的影響。結(jié)果表明：在水溶液中加入少量甲酸有助于敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷等3種有機磷農(nóng)藥的離子化，響應值更高；敵百蟲在酸性條件下穩(wěn)定性好，避免其分解轉(zhuǎn)化成敵敵畏對檢測結(jié)果的影響。故選擇甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相。為了進一步改善峰型縮短分析時間，采用了梯度洗脫，3種待測組分均在10 min內(nèi)出峰，且峰型較好。

圖1　敵百蟲二級質(zhì)譜圖Fig.1Two mass spectra of trichlorfon

圖2　敵敵畏二級質(zhì)譜圖Fig.2Two mass spectra of dichlorvos

圖3　甲胺磷二級質(zhì)譜圖Fig.3Two mass spectra of methamidophos

2.3提取溶劑的選擇

水產(chǎn)品中有機磷農(nóng)藥殘留通常以二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、乙腈為提取溶劑。二氯甲烷毒性較大，且提取液在下層，移取時易吸出少量樣品組織；丙酮共萃物較多，且與水互溶，此外，3種有機磷農(nóng)藥均在水中有較大溶解度，增加后續(xù)的除水步驟；由于敵敵畏在中性和堿性條件下穩(wěn)定性較差，本研究考察了酸化乙腈和酸化乙酸乙酯的提取效果。結(jié)果表明，酸化乙腈的沸點較高且與水互溶，除水較困難，提取液濃縮耗時較長，對敵敵畏回收率的影響較大；酸化乙酸乙酯的沸點相對較低，水溶性較差，濃縮時耗時短，除水效果好，3種待測組分的回收率均較高。還比較了0.1%甲酸-乙酸乙酯、0.2%甲酸-乙酸乙酯、1.0%甲酸-乙酸乙酯等3種酸化乙酸乙酯對有機磷提取效率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種提取液對3種待測組分的提取效率的影響均較小，故最終選擇提取溶劑為0.1%甲酸-乙酸乙酯。

2.4凈化條件的優(yōu)化

為達到理想的凈化效果和回收率，本研究考察了液液萃取、分散固相萃取、固相萃取等3種常見凈化方法對水產(chǎn)品中敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷測定的影響。用空白南美白對蝦肌肉樣品分別按照上述前處理方法（包括提取和凈化）制備空白基質(zhì)樣品溶液后，加標濃度均為10.0 μg/kg，其加標回收率見圖4。

圖4　3種凈化方式條件下的加標回收率（n=5）Fig.4The recoveries of spiked standard under the condition of 3 kinds of purification methods（n=5）

結(jié)果表明：3種凈化方式后的溶液均為無色；采用分散固相萃取法與固相萃取法，敵百蟲、甲胺磷的回收率均較高，而采用液液萃取法敵百蟲、甲胺磷的回收率均在80%左右，其回收率明顯低于采用分散固相萃取法與固相萃取法凈化中敵百蟲、甲胺磷的回收率；采用分散固相萃取法與液液萃取法，敵敵畏回收率均為30%左右；采用固相萃取法，敵敵畏回收率為60%左右，這可能與敵敵畏的沸點（74℃）較低，穩(wěn)定性較差有關。故最終凈化方式選擇固相萃取。

2.5方法線性范圍、檢出限和定量限

稱取相同基質(zhì)的空白試樣6份，每份5 g（咸魚制品稱取2.5 g），分別加入適量的標準工作溶液，制備成含敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷的濃度均為5.0、10、20、50、100、200 μg/kg的樣品，按前處理方法進行操作，濃度由低到高進樣分析測定。以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標以峰面積（Y）為縱坐標，以峰面積對目標化合物的折算濃度建立回歸直線方程。以3倍信噪比（S/N=3）計算方法定量限（LOD），以10倍信噪比（S/N=10）計算方法定量限（LOQ）。敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷在不同基質(zhì)樣品中的線性回歸方程、相關系數(shù)、方法檢出限、方法定量限見表3。

表3　敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷線性方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限Table 3Linear equations，correlation coefficient，limit of detection and quantification of trichlorfon，dichlorvos and methamidophos

結(jié)果表明，3種有機磷農(nóng)藥在相應濃度范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)（R2）在0.995 2～0.999 6之間。敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷的方法檢出限（LOD）均為1.5 μg/kg，方法定量限（LOQ）均為5.0 μg/kg，滿足國內(nèi)水產(chǎn)品中對其殘留限量的要求。

在空白陰性羅非魚、南美白對蝦、咸魚樣品中，分別添加5.0、10.0、50.0 μg/kg 3個濃度水平的3種有機磷農(nóng)藥，每個濃度水平設6個平行，同時設1個空白對照。敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷的加標回收率及相對標準偏差（RSD）結(jié)果見表4至表6。

表4　樣品中敵百蟲添加回收率和精密度Table 4Recovery and precision of trichlorfon in samples

表5　樣品中敵敵畏添加回收率和精密度Table 5Recovery and precision of dichlorvos in samples

表6　樣品中甲胺磷添加回收率和精密度Table 6Recovery and precision of methamidophos in samples

結(jié)果顯示：在3種水產(chǎn)品基質(zhì)中，敵百蟲的平均加標回收率為93.7%～103.2%，精密度（相對標準偏差，RSD）為3.3%～8.1%；敵敵畏的平均加標回收率為90.6%～106.0%，精密度（RSD）為6.4%～8.8%；甲胺磷的平均加標回收率為94.5%～102.8%，精密度（RSD）為3.2%～7.3%。

2.6實際樣品的檢測

選取農(nóng)貿(mào)市場待售的水產(chǎn)品（鮮魚、蝦、咸魚），按照本文前處理和儀器條件進行上機測定，結(jié)果表明：不同來源的水產(chǎn)品樣品中，敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷殘留量有所差異，其中咸魚樣品中甲胺磷的殘留量可達26.52 μg/kg。這說明在實際的水產(chǎn)品養(yǎng)殖、加工、運輸、貯藏等過程中，敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷有可能作為殺蟲劑而應用于水產(chǎn)品中。因此，為了確保水產(chǎn)品質(zhì)量安全和維護消費者人身健康，相關行政部門有必要加強對敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷的行政監(jiān)督與日常監(jiān)測。

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Determination of Trichlorfon，Dichlorvos and Methamidophos in Aquatic Products by Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

HOU Wen-hui
（Ulanqab Vocational College，Wulanchabu 012000，Inner Mongolia，China）

A method for determining the residues of trichlorfon，dichlorvos and methamidophos in aquatic products was established by an ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry.Samples was ultrasonic extracted with 0.1%formic acid-ethyl acetate，and purified with SPE-C18，and separated by UPLC BEH C18 column，and measured by selected ion monitoring（SIM）.The qualitative ion pair（m/z）was 258.7/127.0（trichlorfon），221.0/127.1（dichlorvos），and 142.1/94.1（methamidophos）；the quantitative ion pair（m/z）was 258.7/109.0（trichlorfon），221.0/109.1（dichlorvos），221.0/112.0（methamidophos）.The results showed that the recoveries were between 92.3%-106.0%，and the relative standard deviation were no more than 8.8%；According to RSN=3，the detection limits were 1.5 μg/kg quantitative，limits were 5.0 μg/kg.

ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry；trichlorfon；dichlorvos；methamidophos；aquatic products；determination

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.036

2015-12-29

侯文慧（1979—），男（漢），講師，本科，研究方向：食品加工技術(shù)。